FGF9 syöpään liittyvien fibroblastien on mahdollinen välittäjäaine hyökkäyksen ja anti-apoptoosin mahalaukun syöpäsolujen

FGF9 syöpään liittyvien fibroblastien on mahdollinen välittäjäaine hyökkäyksen ja anti-apoptoosin mahalaukun syöpäsolujen
tiivistelmä
tausta
syöpään liittyvän fibroblasteja (valuuttalisiin), jotka sijaitsevat noin kasvainsoluja, ehdotetaan pelata keskeinen asema syövän etenemiseen. Tässä me suoritetaan microarray-analyyseillä verrata geeniekspressioprofiilit välillä valuuttalisiin ja ei-syöpä mahalaukun fibroblasteissa (NGF: ien) potilaalta, jolla on mahalaukun syöpä ja totesi, että fibroblastikasvutekijä 9
(FGF9
) on uusi kasvutekijä yli-ilmentynyt valuuttalisien. Sitten tutkittiin biologisia vaikutuksia FGF9 aikana etenemisen mahasyöpä.
Menetelmät
ilmentäminen FGF9 on valuuttalisiin ja NGF: ien ja niiden erittyvä tuotteet tutkittiin Western-blottauksella. Vaikutukset FGF9 on AGS ja MKN28 mahalaukun syöpäsolujen leviämisen kannalta, invaasion ja anti-apoptoosin arvioitiin WST-1 määritys, invaasio kammio määritys ja FACS, vastaavasti. Lisäksi solunsisäinen signalointi, jonka FGF9 saa aikaan biologisia rooleja on tutkittu in vitro
.
Tulokset
FGF9 voimakkaasti ilmaistu valuuttalisiin verrattuna NGF: ien, että se on yhteensopiva microarray dataa, joka ilmoittaa, että FGF9 oli uusi kasvu tekijä yli-ilmentynyt valuuttalisien. Hoito FGF9 edistetään invaasio ja anti-apoptoosin aktivoimalla ERK ja Akt signaalireaktioteissä AGS ja MKN28 soluja, nämä vaikutukset olivat lieventyneet hoito anti-FGF9 neutraloiva vasta-aine. Lisäksi FGF9 hoito merkittävästi parannettu ilmaus matriisimetalloproteinaasin 7 (MMP7) molemmissa solulinjoissa.
Johtopäätökset
FGF9 on mahdollista sovittelija erittämiä valuuttalisiin joka edistää anti-apoptoosin ja invasiivisia kykyä mahalaukun syöpäsoluja.
avainsanat
FGF syöpään liittyvän fibroblastien Invasion Anti-apoptoosin ERK Akt Mahasyöpää Taustaa
muodostuminen pahanlaatuisten vaurioiden on läheisesti liittyvät niiden ainutlaatuinen mikroympäristön. Progression läheisesti korreloi kyky syöpäsolujen rekrytoida ja aktivoida ympäröivän strooman soluja, ja sen jälkeen hyödyntää niitä [1]. Syöpää ympäröivän strooman soluja, kuten fibroblasteja, endoteelisoluja, ja immuunijärjestelmän solujen, voidaan järjestää kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden kautta solu-solu-vuorovaikutuksen ja /tai liukoisten kasvutekijöiden /sytokiinien /kemokiinien [1-3]. Tässä yhteydessä fibroblastien pahanlaatuisten vaurioiden tunnetaan syöpään liittyvän fibroblasteja (valuuttalisiin) ja ovat saaneet paljon huomiota osalta niiden rooli syövän etenemistä [4,5]. Vaikka valuuttalisiin tiedetään olevan merkittävästi erilaisia ​​kuin normaalien fibroblastien ei-neoplastisten kudosten mitattuna niiden geenin profiilin, mekanismi, jonka valuuttalisiin edistävät syövän etenemiseen on epäselvä. Siksi me verrattuna geenin ilmentymisen profiilit valuuttalisiin, keskittyen erityisesti kasvutekijöitä /sytokiinien /kemokiinien, niiden kanssa ei-syöpä mahalaukun fibroblasteissa (NGF: ien) käyttäen microarray-määritystä, ja sen jälkeen eristää fibroblastikasvutekijä 9
(FGF9
), koska uusi geeni, joka oli yli-ilmentynyt valuuttalisiin mahasyövän.
FGF9, joka on eritysproteiinia FGF-perheen, on tiettävästi ilmaistaan ​​stroomasoluissa, mukaan lukien fibroblastit [6-8]. Yleensä FGF signalointi tapahtuu kautta FGF-reseptorien (FGFR: ää) säätää erilaisia ​​solun biologista käyttäytymistä, kuten proliferaatiota, erilaistumista, selviytymisen ja liikkuvuus [9], ja ilmaus FGF9, FGFR2c, FGFR3b ja FGFR3c on havaittu mahalaukun ja paksusuolen syövistä [10]. Näin ollen, kuten muiden FGF-ryhmän proteiinien, FGF9 voi olla keskeinen rooli vuorovaikutusta syöpäsoluja ja niitä ympäröivän strooman soluja, ja on huomionarvoista, että FGF9 ilmentyy voimakkaasti valuuttalisiin mahasyövän. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme seulotaan eroja geeni-ilmentymisen välillä valuuttalisiin ja NGF: ien potilaan mahalaukun syöpä. Olemme tutkineet vaikutus FGF9 jakautumiseen, invaasio ja anti-apoptoosin mahalaukun syövän solujen, ja lisäksi selkeytetty solunsisäinen signalointi, jolla FGF9 vaikuttaa biologisesti mahalaukun syöpäsoluja. Tool Menetelmät
Reagenssit ja soluviljelmissä
ihmisen rekombinantti FGF9 ja anti-ihmis-FGF9 neutraloiva vasta-aine hankittiin R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anti-ekstrasellulaarisen signaalin säädellään proteiinikinaasi (ERK), anti-fosfo-spesifinen ERK (p-ERK), anti-Akt, anti-fosfo-spesifinen Akt (p-Akt, Ser473), ja anti-β-aktiini-vasta-aineet olivat ostettu Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).
mahalaukun syövän solulinjat AGS viljeltiin Hamin F-12-väliaineessa (Sigma, Aurora, Ohio, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Biowest, Nuaille, Ranska) kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa atmosfäärissä 5% CO 2. Samoin, MKN28 viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia, ja muut viisi mahasyövän solulinjoissa MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY, ja KATOIII ylläpidettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [11].
Eristäminen ja viljely ihmisen mahalaukun fibroblastit
Human mahasyövän (huonosti erilaistunut adenokarsinooma) näytteet saatiin potilaasta, joille tehtiin gastrectomy at Hyogo College of Medicine Hospital vuonna 2012. syöpä liittyvien fibroblasteja (valuuttalisiin) valmistettiin syöpä osasta vatsassa. Ei-syöpä mahan fibroblasteja (NGF: ien) valmistettiin ei-syöpä osan kanssa atrofinen gastriitti vähintään 50 mm kaukana kasvain mahassa. Kudosnäytteet leikattiin rasvaa ja nekroottista kudosta, paloiteltiin leikkausveitsiä ja pestiin PBS: ssä, joka sisälsi antibioottia-antimykoottia reagenssia (Anti-Anti®, GIBCO). Kudoksen palaset siirrettiin 12-kuoppaisen mikrolevyn (Iwaki, Tokio, Japani), yksi fragmentti /kuoppa. Soluja viljeltiin DMEM-väliaineessa (GIBCO, Grand Island, NY, USA), jossa oli 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 5% CO2: ta. Fibroblastien että aluksi kasvoi yksikerroksinen kerättiin, siirtää toiseen astiaan ja käytettiin kokeisiin sisällä 10th kulkua. Nämä tutkimukset tehdään hyväksyntää Review Board of Hyogo College of Medicine, ja suostumus saatiin potilaasta.
Mikrosiruanalyysi
käyttäminen Trizol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), kokonais-RNA oli uutetaan kolme sarjaa valuuttalisiin ja NGF: ien viljeltiin. cDNA merkintöjä, hybridisaatiot, skannaus ja tietojen analysointi suoritettiin Hokkaido System Science Co., Ltd (Sapporo, Japani). Lyhyesti, syaniini-3 (Cy3) -merkattua cRNA valmistettiin kokonais-RNA (0,05 ug) käyttämällä Low Input Lyhyt ampeerin Labeling Kit (Agilent) mukaisesti valmistajan ohjeiden, jonka jälkeen RNAeasy pylväspuhdistus (QIAGEN, Valencia, CA) . Dye sisällyttäminen ja cRNA saanto tarkastettiin kanssa NanoDrop ND-1000 Spektrofotometri. Cy3-leimattua cRNA (0,60 ug) hajanaista 60 ° C: ssa 30 minuutin ajan reaktion 25 ui, joka sisälsi 1 x Agilent pirstoutuminen puskuria ja 2 x Agilent salpaaja mukaisesti valmistajan ohjeita. Päätyttyä pirstoutuminen reaktion, 25 ui 2x Agilent hybridisaatiopuskuria lisättiin pirstoutuminen seokseen ja hybridisoitiin Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression Microarray (8x60K ver.2.0) 17 h ajan 65 ° C: ssa pyörivässä Agilent hybridisaatio uuni. Hybridisaation jälkeen mikrosiruja pestiin 1 min huoneenlämpötilassa GE Wash Buffer 1 (Agilent) ja 1 min 37 ° C: GE Pesupuskuri 2 (Agilent), kuivattiin sitten välittömästi sentrifugoimalla lyhyen aikaa. Objektilasit skannattiin välittömästi pesun jälkeen Agilent DNA Microarray Scanner (G2565CA) käyttäen yhtä väriä skannausasetus varten 8x60K array dioja (Scan Area 61 × 21,6 mm, Skannaustarkkuus 3 um, Dye kanava Green PMT asetettu 100%). Skannatut kuvat analysoitiin ja normalisoitu Feature Extraction Software 10.7.3.1 (Agilent).
RNA ja käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B Yhteensä RNA uutettiin mahasyöpä solulinjoista käyttämällä Trizol reagenssia (Invitrogen). Neljä mikrogrammaa kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin käyttämällä oligo-dT (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA) ja 200 U Superscript ™ II käänteistranskriptaasia (Invitrogen) kokonaistilavuudessa 20 ui. Seuraavat PCR, oligonukleotidialukepareista ihmisen FGFR: ää
valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Human FGFR2c
: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(eteenpäin) ja 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (taaksepäin); ihmisen FGFR3b
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(eteenpäin) ja 5'--GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3' (taaksepäin); ihmisen FGFR3c
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(eteenpäin) ja 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (taaksepäin); ihmisen GAPDH
: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(eteenpäin) ja 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (peruutus). Yksi mikrolitra RT tuotteen (cDNA) monistettiin PCR: llä 50-ul: n reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 20 pmol edellä alukkeiden sarjaa, 1,25 U Ampli-Taq-DNA-polymeraasia (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA), ja lopullinen PCR-puskuria: 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCI, 2,5 mM MgCI2, 10 mM ditiotreitolia ja 1 mM dNTP: tä. PCR-monistus suoritettiin seuraavasti: ja FGFR: ää
, 95 ° C: ssa 5 min kerran; 40 sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 57 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 1 min; sitten 72 ° C: ssa 7 min; GAPDH
, 95 ° C: ssa 7 min, kun; 40 sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 55 ° C 1 min, ja 72 ° C 30 s; sitten 72 ° C: ssa 7 min.
Reaaliaikainen RT-PCR
Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin käyttäen 7900H Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems), kuten aiemmin on kuvattu [13]. Seuraavat alukejoukkoa Ihmisille matriksimetalloproteinaasi 2
(MMP2
), MMP3
, MMP7
, MMP9
, ja GAPDH
valmistettiin (Additional tiedosto 1: Taulukko S1) . Reaaliaikainen RT-PCR-määritykset suoritettiin 200 ng RNA: ta vastaavan cDNA: n, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), ja 500 nmol /l alukkeilla. PCR-syklien olivat 50 ° C 15 s, ja 60 ° C: ssa 60 s. Intensiteetti fluoresoiva väriaine määritettiin, ja kunkin mRNA: n ilmentymisen tasot normalisoitiin GAPDH
mRNA: n ilmentymisen tasoja.
Soluproliferaatiomääritys
AGS (4 x 10 3) ja MKN28 soluja (1 × 10 4) ympättiin täydellisessä väliaineessa 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä. Elatusaine korvattiin sitten, joka sisältää yhdistelmä-DNA-FGF9 (0-10 ng /ml). WST-1-liuosta lisättiin sen jälkeen 72 h inkubaation, ja levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h. Levyt analysoitiin käyttämällä ELISA-levyn lukijaa 450 nm: ssä viite aallonpituus asetetaan 600 nm: ssä.
Cell invaasiomääritys
Cell invaasiomääritys suoritettiin käyttäen BioCoat Matrigel invaasiota kammioiden (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, AGS-soluja (1 x 10 5) tai MKN28 soluja (3 x 10 5) ympättiin insertti Matrigel päällystetty invaasio kammion (24 kuopat, 8 um huokoskoko) täytetty seerumin vapaata alustaa, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia FGF9 (0-10 ng /ml). Sitten soluja inkuboitiin elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää alemmassa kammiossa 37 ° C: ssa 5% CO2: ta. Estää vaikutuksia FGF9, anti-FGF9-vasta-ainetta (1 ug /ml) lisättiin myös ylempään kammioon. Kun oli inkuboitu 27 h, ei-tunkeutuvat solut poistettiin käyttäen pumpulipuikolla ja solut, jotka olivat tunkeutuneet alapinnalle kalvon vahvistettu etanolilla. Tunkeutuvat solut värjättiin sitten hematoksyliinillä ja laskettiin käyttämällä mikroskooppia viidessä eri näkökentät (suurennos, x200).
Apoptosis määritys
AGS (2 x 10 5) ja MKN28 (2,5 x 10 5) solut siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille rutiini väliaineessa 24 tunnin ajan. Sitten solut seerumipuut- ja käsiteltiin kanssa tai ilman rekombinantti FGF9 (1-10 ng /ml) 48 tuntia. Estää vaikutuksia FGF9, anti-FGF9-vasta-ainetta (1 ug /ml) lisättiin myös viljelyalustaan. Hoidon jälkeen sekä kelluvat ja kiinnittyneet solut kerättiin, pestiin PBS: llä ja värjättiin anneksiiniV-FITC ja propidiumjodidilla (PI) käyttäen MEBCYTO Apoptosis Kit (MBL, Nagoya, Japani). Stained Solut analysoitiin FACSCalibur-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), ja saadut tiedot analysoitiin käyttämällä CellQuest -ohjelmistoa (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).
Western blot-analyysi
Western blot-analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [14]. Lyhyesti, sen jälkeen, kun hoidon kanssa tai ilman reagenssin, solut hajotettiin proteiini uuttopuskuriin, ja proteiini-uutetta (30 ug) fraktioitiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja siirrettiin nitroselluloosalle blotting kalvo. Kaivoa inkuboitiin primäärisen vasta-aineen kanssa ja sitten peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Proteiinit todettiin käyttäen parannetun kemiluminesenssi (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK).
Immunohistokemia
yhteensä 20 mahasyövistä kudokset saatiin näytteitä resektoitiin kirurgisesti at Hyogo College of Medicine. Kudosnäyte kiinnitettiin 10% formaliinilla ratkaisu ja upotettiin parafiiniin. Tutkimus hyväksyi Review Board of Hyogo College of Medicine, ja suostumus saatiin kaikilta potilailta. Ominaisuudet mahasyöpä potilasta osoitti Muita tiedosto 2: Taulukko S2.
Immunohistokemiallinen värjäys FGF9 suoritettiin kanssa LSAB + kit käyttäen anti-FGF9 vasta-ainetta (1:40; R &D Systems, Minneapolis, MN, USA) kuten aiemmin on kuvattu [15]. Lopuksi leikkeitä inkuboitiin 3,3'-diaminobenzide tetrahydrochloride 0,05% H2O2: ta 3 minuutin ajan, ja sitten vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä. Arvioida immunoreaktiivisuus FGF9, ainakin viisi erilaista näkökentät havaittiin leviämisrintamassa mahasyövän vaurioita. Näyte katsottiin positiiviseksi, kun FGF9-positiivisia sidekudosta pesiä havaittiin visuaalisella kentällä tutkittiin.
Tilastot analyysi
Kaikki arvot ilmaistiin keskiarvona ± SD. Aineisto analysoitiin käyttämällä paritonta kaksisuuntaisella t
-testi. P
arvot alle 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkittävyyttä.
Tulokset
Microarray analyysit valuuttalisiin mahasyövän kudoksissa
Me eristetty valuuttalisiin ja NGF: ien (kuvio 1A) ja verrattiin geeniekspression profiilin valuuttalisiin kanssa, NGF: ien avulla microarray määritystä. Kymmenen edustaja geenejä, jotka ilmentyivät valuuttalisiin on lueteltu taulukossa 1. Näistä geeneistä, suunnattiin FGF9 kaikkein voimakkaasti ilmentyvän geenin tutkia roolia tämän CAF-kasvutekijä mahalaukun syövän soluja, ja itse asiassa ennen in vitro
tutkimuksissa olemme vahvistaneet, että CAF-solut tuottivat paljon suurempi määrä FGF9 proteiinia kuin NGF-soluja (kuvio 1 B). Lisäksi olemme vahvistaneet, että FGF9 ilmentyy voimakkaasti fibroblastit stroomaan mahasyövän vaurio, josta CAF eristettiin (kuvio 1C). Kuvio 1 ekspressio FGF9 ja sen reseptorien valuuttalisiin ja mahalaukun syövän soluissa. (A) morfologiset mahalaukun valuuttalisiin ja NGF: ien. (B) tuotanto FGF9 mahalaukun valuuttalisiin, NGF: ien ja niiden kunnostetun alustan (CM). (C) Expression of FGF9 vuonna valuuttalisiin mahalaukun syövän vaurion. Nuolet osoittavat valuuttalisien. (D) Expression of FGF-reseptorien
vastuussa FGF9 mahasyövän solulinjoissa.
Taulukko 1 edustaja geenit ilmentyvät differentiaalisesti valuuttalisiin peräisin NGF: ien
tulonumerolla
Symbol

Gene nimi
kertaluokkamuutos
Up-säännelty
NM_014333
CADM1
adheesiomolekyyli 1, transkriptio variantti 1
273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
gb

• Diagnostinen haaste keuhkojen kasvain tromboottisen mikroangiopatian kuin esitys metastaattinen mahasyövän: tapausselostus ja katsaus literature
• Xpert MTB /RIF määritystä voidaan käyttää arkistoituja mahalaukun aspiraatista ja aiheuttama yskös näytteitä herkille diagnosointiin lapsipotilaiden tuberculosis