FGF9 származó rákkal összefüggő fibroblasztok egy lehetséges közvetítő invázió és anti-apoptózis gyomorrák cells

FGF9 származó rákkal összefüggő fibroblasztok egy lehetséges közvetítő invázió és anti-apoptózis gyomorrák sejtek katalógusa Abstract Background katalógusa
rákhoz kapcsolódó fibroblasztok (CAF-eket), amely tartózkodnak körül tumorsejtek, azt javasolta, hogy döntő szerepet játszanak a tumor progresszióját. Itt végeztünk microarray elemzések összeh génexpressziós profilok között CAF-ek és a nem rákos gyomor fibroblasztok (NGF) szenvedő beteg gyomorrák és megállapította, hogy a fibroblaszt növekedési faktor 9
(FGF9
) volt új növekedési faktor túlexpresszálódik CAF. Ezután vizsgáltuk a biológiai hatásait FGF9 alatt progressziója gyomorrák.
Módszerek
expressziója FGF9 a CAF-ek és NGF, valamint ezek szekretált termékeket, vizsgáltuk Western-blottal. A hatások a FGF9 az AGS és MKN28 gyomorrák sejtek szempontjából proliferáció, invázió és anti-apoptózis értékelték WST-1 vizsgálati, invázió kamra vizsgálat és FACS, ill. Továbbá, a jelátviteli amellyel FGF9 fejti ki biológiai szerepek vizsgáltuk in vitro katalógusa.
Eredmények katalógusa FGF9 erősen kifejezett CAF képest NGF, amely összeegyeztethető microarray adatok igazolják, hogy FGF9 volt új növekedési tényező túltermelõdik CAF. Kezelés FGF9 támogatni invázió és anti-apoptózis aktiválása révén az ERK és Akt jelátviteli utak AGS és MKN28 sejtek, míg ezek a hatások mérsékelhetők kezelés anti-FGF9 semlegesítő antitest. Ezen túlmenően, FGF9 kezelés szignifikánsan fokozta a kifejezés a mátrix metalloproteináz 7 (MMP7) mindkét sejtvonalban.
Következtetések
FGF9 egy lehetséges közvetítő által szekretált CAF-ek, amely elősegíti az anti-apoptosis és invazív képességét gyomor rákos sejteket.
kulcsszavak
FGF rákhoz kapcsolódó fibroblaszt Invasion Anti-apoptózis ERK Akt Gyomorrák alapon
A formáció rákos elváltozások szorosan társítva egyedi mikrokörnyezetet. Progression szorosan összefügg azzal a képességgel, a rákos sejtek toborzása és aktiválja a környező kötőszöveti sejteket, később használni őket. [1] Rák-körülvevő stromális sejtek, mint például a fibroblasztok, endoteliális sejtek és az immunsejtek, lehet hangszerel tumorigenezis és metasztázis keresztül a sejt-sejt kölcsönhatás és /vagy termelési oldható növekedési faktorok /citokinek /kemokinek [1-3]. Ebben az összefüggésben, a fibroblasztok rákos léziók ismertek rákhoz kapcsolódó fibroblasztok (CAF-eket), és sok figyelmet kaptak, tekintettel azok szerepét a tumor progresszióját [4,5]. Bár a CAF-ek ismert, hogy nagymértékben különbözik a normális fibroblasztok nem neoplasztikus szövetekben szempontjából a gén profil, a mechanizmus, amely által CAF-ek elősegítik a tumor progresszióját nem tisztázott. Ezért összehasonlítottuk a génexpressziós profilokat CAF-ek, különös figyelemmel a növekedési faktorok /citokinek /kemokinek, azokkal a nem-rákos gyomor fibroblasztok (NGF) mikroarray vizsgálat, és ezt követően izoláljuk a fibroblaszt növekedési faktor 9 katalógusa (FGF9
), mint egy új gént, amelyet túltermelõdik CAF gyomorrákban. katalógusa FGF9, szekréciós fehérje az FGF család, állítólag kifejezett kötőszöveti sejteket, köztük a fibroblasztok [6-8]. Általánosságban, az FGF jelátvitel útján történik FGF-receptorok (FGFRs), hogy szabályozza a különböző sejt biológiai viselkedés, beleértve a szaporodást, a differenciálódást, túlélést és motilitás [9], és kifejezése FGF9, FGFR2c, FGFR3b és FGFR3c mutatták ki a gyomor és a vastagbél rákok [10]. Ezért, akárcsak egyéb FGF családba tartozó proteinek, FGF9 játszhat döntő szerepet közötti kölcsönhatás a rákos sejtek és az őket körülvevő stromális sejtek, és figyelemre méltó, hogy FGF9 erősen fejezik CAF-ek a gyomorrák. A jelen tanulmányban azt szűrni különbségek génexpresszió között CAF-ek és NGF szenvedő beteg gyomorrák. Vizsgáltuk a hatását FGF9 a proliferáció, invázió és anti-apoptosis gyomorrák-sejtek, és ráadásul tisztázta az intracelluláris jelátviteli amellyel FGF9 fejti ki biológiai hatását a gyomor rákos sejtekben.
Módszerek
Reagensek és sejttenyészetben
humán rekombináns FGF9 és anti-humán FGF9 semlegesítő ellenanyag cégtől vásároltuk R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anti-extracelluláris szignál-szabályozott fehérje-kináz (ERK), anti-foszfo-specifikus ERK (p-ERK), anti-Akt, anti-foszfo-specifikus Akt (p-Akt, Ser473), és anti-β-aktin antitestek vásárolt Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).
A gyomor rákos sejtvonalak AGS volt tenyésztjük Ham-féle F-12 közegben (Sigma, Aurora, Ohio, USA) 10% magzati borjúszérummal (FBS; Biowest, Nuaillé, Franciaország), párásított inkubátorban, 37 ° C-atmoszférában, 5% CO 2. Hasonlóképpen, MKN28 tenyésztettünk RPMI 1640 tápközegben, amely 10% magzati borjúszérumot, és a többi öt gyomor rákos sejtvonalak MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY, és KATOIII tartottuk a korábban leírtak [11].
Izolálása és tenyésztése emberi gyomor fibroblasztok
emberi gyomorrák (gyengén differenciált adenocarcinoma) mintákat vettünk a beteg átesett gastrectomián át Hyogo College of Medicine Kórház 2012. rákhoz kapcsolódó fibroblasztok (CAF-eket) állítottunk elő a rákos rész a gyomorban. Nem rákos gyomor fibroblasztok (NGF) készítettünk a nem rákos rész sorvadásos gyomorhurut legalább 50 mm távolságra a tumor a gyomorban. A szöveti mintákat zsírtól és elhalt szövetek, darált és szikék és PBS-ben mostuk tartalmazó antibiotikum gombaölő reagens (Anti-Anti®, GIBCO). A szövet darabokat átvittük egy 12 lyukú mikrotitráló lemez (IWAKI, Tokió, Japán) az egyik fragmens /lyuk. A sejteket DMEM-táptalajban (GIBCO, Grand Island, NY, USA), amely 10% hővel inaktivált FBS-t 37 ° C hőmérsékleten olyan atmoszférában, 5% CO2. A fibroblasztok kezdetben nőtt egyrétegű gyűjtötték, át egy másik edénybe, és kísérletek során felhasznált belül a 10. szakasz. Ezek a vizsgálatok az volt a jóváhagyást a Review Board Hyogo College of Medicine, és beleegyezését adta a beteg. Katalógusa microarray analízis katalógusa Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), a teljes RNS-t kivont három CAF és NGF művelt. cDNS címkézés, hibridizációk, szkennelés és adatelemzés végeztük Hokkaido rendszer Science Co., Ltd. (Sapporo, Japán). Röviden, cianin-3 (Cy3) -jelzett cRNS-t készítettünk teljes RNS-t (0,05 ug) használva alacsony bemeneti Quick Amp Labeling Kit (Agilent), összhangban a gyártó utasításainak, majd RNAeasy oszlop tisztítás (Qiagen, Valencia, CA) . Dye beépítése és cRNS hozam ellenőrizték a NanoDrop ND-1000 spektrofotométer. Cy3-jelzett cRNS (0,60 ug) töredezett 60 ° C-on 30 percig a reakció térfogatát 25 ul tartalmazó 1x Agilent fragmentáció puffer és 2x Agilent blokkoló szerrel összhangban a gyártó utasításai szerint. Befejezésekor a töredezettség reakció, 25 ul 2x Agilent hibridizációs puffert adtunk a fragmentáció keveréket, és hibridizáltuk Agilent SurePrint G3 Humán Gene Expression Microarray (8x60K Ver.2.0) 17 órán át 65 ° C-on egy forgó Agilent hibridizációs kemencében. A hibridizálás után a microarray mostuk 1 percig szobahőmérsékleten, a GE Wash Buffer 1 (Agilent), és 1 percig 37 ° C-GE Mosópuffer 2 (Agilent), majd szárítjuk azonnal rövid centrifugálással. A metszeteket beolvasott közvetlenül mosás után Agilent DNS Microarray Scanner (G2565CA) segítségével egy színes szkennelési beállítás 8x60K tömb diák (Scan Area 61 × 21,6 mm, Scan felbontás 3μm, Dye csatorna Zöld PMT beállítása 100%). A beszkennelt képek elemeztük és normalizált Feature Extraction Software 10.7.3.1 (Agilent). Katalógusa RNS izoláció és reverz transzkripció-polimeráz láncreakció (RT-PCR) hotelben Teljes RNS-t vontunk ki gyomor rákos sejtvonalak Trizol reagens (Invitrogen). Négy mikrogramm össz-RNS-t reverz transzkripcióval oligo dT (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA) és 200 U Superscript ™ II reverz transzkriptáz (Invitrogen) a teljes térfogatban 20 jil. A következő PCR-pár oligonukleotid primerek az emberi FGFRs
állítottunk elő a korábban leírtak [12]. Emberi FGFR2c katalógusa: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(előre) és az 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (Reverse); emberi FGFR3b katalógusa: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(előre) és az 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 '(Reverse); emberi FGFR3c katalógusa: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(előre) és az 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (Reverse); humán GAPDH katalógusa: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(előre) és az 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (Reverse). Egy mikroliter RT termék (cDNS) amplifikáltuk PCR-rel egy 50 ul-es reakció-térfogatban, amely 20 pmol a fenti láncindító, 1,25 U Ampli-Taq DNS-polimeráz (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia., USA), és a végső PCR-puffer: 20 mM Tris-HCl-t (pH = 8,4), 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol és 1 mM dNTP. A PCR-amplifikáció a következőképpen végeztük: a FGFRs
, 95 ° C-on 5 percig egyszer; 40 ciklus 95 ° C-on 30 s, 57 ° C-on 30 s, és 72 ° C-on 1 perc; majd 72 ° C-on 7 perc; a GAPDH
, 95 ° C-on 7 percig egyszer; 40 ciklus 95 ° C-on 30 s, 55 ° C 1 perc, és 72 ° C-on 30 másodpercig; majd 72 ° C-on 7 percig.
Real-time RT-PCR
Real-time RT-PCR-t végeztünk 7900H Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem) a korábban leírtak [13]. A következő láncindító emberi mátrix metalloproteináz 2 | (MMP2 katalógusa), MMP3 katalógusa, MMP7 katalógusa, MMP9 katalógusa, és GAPDH katalógusa készítettünk (Plusz fájl 1: Táblázat S1) . Real-time RT-PCR vizsgálatokat végeztünk 200 ng RNS-megfelelőjét cDNS, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), és 500 nmol /l-gén specifikus primerek. A PCR ciklus körülmények 50 ° C-on 15 s, és 60 ° C-on 60 másodpercig. Az intenzitás a fluoreszcens festék meghatároztuk, és az egyes mRNS expressziós szintek normalizáltuk GAPDH
mRNS expressziós szinteket.
Cell proliferációs vizsgálati
AGS (4 × 10 3) és MKN28 sejteket (1 × 10 4) oltottuk komplett tápközegben 96-lukas mikrotiter. A táptalajt ezután helyettesítjük egy tartalmazó rekombináns FGF9 (0-10 ng /ml). WST-1 oldatot adtunk 72 órás inkubálás után, és a lemezeket inkubáljuk 37 ° C-on 1 órán át. A lemezeket elemeztük egy ELISA lemezleolvasóval 450 nm-en a referencia hullámhossz beállított 600 nm-nél.
Cell inváziós vizsgálati eljárás
sejtek invázióját vizsgálatot végeztünk BioCoat Matrigel inváziós kamrák (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) szerint a gyártó protokollja. Röviden, AGS sejteket (1 × 10 5), vagy MKN28 sejteket (3 x 10 5) oltunk a betétet a Matrigel-bevonatú invázió kamra (24 kutak, 8-um pórusméretű) töltött szérum -mentes közeg különböző koncentrációit tartalmazó FGF9 (0-10 ng /ml). Ezután a sejteket inkubáltuk közegben, amely 10% FBS-t az alsó kamrában 37 ° C hőmérsékleten, 5% CO2. Ahhoz, hogy gátolják a FGF9, anti-FGF9 antitesttel (1 ug /ml) is adtunk hozzá a felső kamrába. Az inkubálás után 27 órán, nem-behatoló sejteket eltávolítottuk segítségével egy vattacsomót és a sejteket, amelyek megtámadta az alsó felület a membrán fixáltuk etanolban. A behatoló sejteket ezután hematoxilin és megszámoljuk mikroszkóp öt különböző látótérben (nagyítás, x200).
Apoptózis assay katalógusa AGS (2 × 10 5) és MKN28 (2,5 × 10 5) sejteket szélesztettünk hat lyukú lemezekre rutin közegben 24 órán át. A sejteket ezután megfosztott szérum és a kezelt vagy anélkül rekombináns FGF9 (1-10 ng /ml) 48 órán keresztül. Ahhoz, hogy gátolják a FGF9, anti-FGF9 antitesttel (1 ug /ml) is adtunk hozzá a tenyésztő tápközeghez. A kezelés után, mind a lebegő és a csatolt sejteket összegyűjtöttük, PBS-sel mostuk, és festettük Annexin V-FITC-vel és propidium-jodid (PI) használatával MEBCYTO Apoptosis Kit (MBL, Nagoya, Japán). Festett sejteket FACSCalibur áramlási citométerrel (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), és a kapott adatok alkalmazásával elemeztük CellQuest szoftvert (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).
Western blot analízis
Western blot analízist végeztünk a korábban leírtak szerint [14]. Röviden, a kezelés után vagy anélkül reagens a sejteket lizáltuk fehérje extrakciós pufferben, és a fehérje kivonat (30 ug) frakcionáltuk nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél elektroforézis és átvisszük egy nitro-cellulóz-blot membránt. A membránt inkubáltuk primer antitesttel, majd egy peroxidázzal konjugált másodlagos antitesttel. A fehérjéket alkalmazásával detektáltuk egy továbbfejlesztett kemilumineszcenciás rendszert (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Egyesült Királyság).
Immunhisztokémia
Összesen 20 gyomor rákos szöveteket nyert minták reszekált sebészeti úton Hyogo College of Medicine. A szövetmintát fixáltuk 10% -os formalin-oldatot, és paraffinba ágyaztuk. Ez a tanulmány által jóváhagyott Review Board Hyogo College of Medicine, és beleegyezését adta az összes betegnél. A jellemzői a gyomorrák betegek mutatott Kiegészítő fájl 2: táblázat S2.
Immunhisztokémiai festését FGF9 végeztük egy LSAB + kit felhasználásával anti-FGF9 antitestet (1:40; R &D Systems, Minneapolis, MN, USA) a korábban leírtak szerint [15]. Végül a metszeteket inkubáltuk 3,3'-diaminobenzide tetrahidroklorid 0,05% H2O2 3 percig, majd kontrasztfestést Mayer-féle hematoxilinnel. Értékelni immunreaktivitására FGF9, legalább öt különböző látótérben volt megfigyelhető az invazív előtt gyomorrák elváltozások. Egy minta tekintettük pozitívnak, ha FGF9-pozitív fibroblaszt fészkeket figyeltünk meg a vizuális területeken megvizsgálták.
Statisztika elemzés
Minden értéket fejeztük ki az átlag ± SD. Az adatokat elemeztük páratlan kétfarkú t
-próba. P katalógusa értéke kisebb, mint 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa Eredmények katalógusa microarray elemzések CAF gyomorrákban szövetek katalógusa izoláltuk CAF és NGF (1A), és összehasonlítottuk a génexpressziós profilját CAF azzal az NGF mikroarray vizsgálat. Tíz reprezentatív géneket, amelyek felülszabályozott CAF-ek vannak az 1. táblázatban felsorolt ​​Ezek közül a gének, mi a célzott FGF9, mint a legtöbb nagy mennyiségben expresszált gén szerepét vizsgálja ennek CAF termelt növekedési faktor a gyomor rákos sejteket, és valójában megkezdése előtt az in vitro
tanulmányok azt megerősítette, hogy a CAF előállított sejtek sokkal nagyobb mennyiségű fehérjét tartalmaz, mint FGF9 NGF sejtek (1B). Sőt, azt megerősítette, hogy a FGF9 erősen kifejeződik a fibroblasztok stroma a gyomor daganatos elváltozás, amelyből CAF izoláltunk (1C). 1. ábra expressziója FGF9 és receptorai a CAF-ek és a gyomor rákos sejteket. (A) Morfológia A gyomor CAF-ek és NGF. (B) A termelés FGF9 a gyomor CAF, NGF és kondicionált médium (CM). (C) kifejezése FGF9 a CAF, a gyomor daganatos elváltozás. Nyilak CAF. (D) kifejezése FGF receptor
felelős FGF9 gyomorrákban sejtvonalak. Katalógusa 1. táblázat reprezentatív gének eltérő módon fejeződnek ki CAF származó NGF katalógusa hozzáférési szám Matton Symbol katalógusa
Gene név Matton szeres változást Matton Up szabályozott katalógusa NM_014333 katalógusa CADM1 katalógusa Cell adhéziós molekula 1 transzkripciós variáns 1 katalógusa 273,6 katalógusa CB178477 katalógusa XLOC_l2_007424 katalógusa gb | is39c09.y1 HR85 szigetecske Homo sapiens cDNS KÉP: 6554705 5 'mRNS szekvencia katalógusa 254,8 katalógusa NM_001113207 katalógusa TSTD1 katalógusa Thiosulfate sulfurtransferase (enzimnek) -szerű domén, amely 1, átirat 1. változat katalógusa 237,5 katalógusa NM_000867 katalógusa HTR2B katalógusa 5-hidroxi (szerotonin) receptor 2B katalógusa 171,5 katalógusa NM_001008539 katalógusa SLC7A2 katalógusa Oldott hordozó család 7 (kationos aminosav transzporter, y + rendszer) tagja 2, transzkripciós variáns 2 | 142,5 katalógusa NM_002010 katalógusa FGF9 katalógusa fibroblaszt növekedési faktor 9 (glia-aktiváló faktor) hotelben 141,1 katalógusa NM_005559 katalógusa LAMA1
laminin, alfa 1 katalógusa 119,0 katalógusa NM_001040058 katalógusa SPP1 katalógusa szekretált foszfoprotein 1. transzkripciós variáns 1
116.1
A_24_P247454
A_24_P247454
Unknown
112.6
NM_014398
LAMP3
Lysosomal-associated membrán protein 3 katalógusa 111,3 katalógusa leszabályozott katalógusa NM_001141919 katalógusa XG katalógusa Xg vércsoport (XG), transzkripciós variáns 2 katalógusa 0,0035 katalógusa NM_175569 katalógusa XG katalógusa xg vércsoport (XG), transzkripciós variáns 1 katalógusa 0,0044 katalógusa NM_000609 katalógusa CXCL12 katalógusa kemokin (CXC motívum) ligand 12 (CXCL12), transzkripciós variáns 2 | 0,0071 katalógusa NM_014817 katalógusa Tril katalógusa TLR4 interaktor leucin gazdag ismétlődő
0,0099 katalógusa NM_002839 katalógusa PTPRD katalógusa protein tirozin foszfatáz, receptor D típusú, transzkripciós variáns 1 katalógusa 0,0138 katalógusa NR_021485 katalógusa EGFEM1P
EGF-szerű és az EMI domént, amely 1, pszeudogén, nem kódoló RNS-katalógusa 0,0141 katalógusa NM_198285 katalógusa WDR86 katalógusa WD ismétlés tartomány 86 katalógusa 0,0145 katalógusa NM_001164000 katalógusa MECOM
MDS1 és EVI1 komplex locus (MECOM), transzkripciós variáns 6 katalógusa 0,0166 katalógusa NM_004335 katalógusa BST2 katalógusa csontvelő-kötőszöveti sejt antigén 2 | 0,0168 katalógusa ENST00000484765 katalógusa XLOC_002912 katalógusa feltételezett LOC100507661 (LOC100507661), miscRNA
0,0172
szeres változást értékeket értékelték arányként normalizált CAF-ek /normalizált NGF.
expressziója FGFR2c
és FGFR3b /c
gyomor rákos sejtvonalakban
FGF9 leírták, hogy nagy affinitást mutatnak a FGFR2c izoforma és FGFR3b /c izoformái [12]. Ezért megvizsgáltuk a kifejezés ezeknek FGFRs
különböző gyomorrák vonalak segítségével RT-PCR-rel. Amint az 1D ábra expressziója FGFR2c katalógusa kimutatható volt mind a hét gyomor rákos sejtvonalak, mivel expressziója FGFR3b /C
kimutatható volt hat hét, kivéve a MKN74. Ezek az eredmények azt javasolta, hogy a gyomorrák sejtek képesek reagálni FGF9 stimuláció. Katalógusa FGF9 aktiválja az ERK és AKT jelátviteli utak gyomorrák sejtek katalógusa Megvizsgáltuk a hatását FGF9 stimuláció lehetséges utakat, beleértve a ERK és az Akt a gyomor rákos sejtvonalak [16]. Expressziója mindkét p-Akt és p-ERK dózisfüggő fokozható FGF9 stimuláció AGS és MKN28 sejtek (2A ábra). A fokozás nyilvánvaló volt 15 perc után FGF9 (10 ng /ml) kezelés mindkét sejtvonalban (2b ábra). Továbbá megvizsgáltuk az anti-FGF9 semlegesítő antitest a gyomor rákos sejteket, és megállapította, hogy a fokozott expresszióját p-Akt és p-ERK által kiváltott FGF9 stimuláció gyengítette együttes adása elleni FGF9 semlegesítő antitest (2C ábra). 2. ábra hatása FGF9 kezelés jelátviteli gyomorrákban sejtekben. (A) Akt foszforiiáció és ERK gyomorrákban kezelt sejtek FGF9. AGS (4 × 105) és MKN28 (4 × 105) tenyésztünk hat lyukú lemezeken, és az oldathoz különböző koncentrációjú FGF9 30 percig. Extrahált fehérjét analizáltuk Western-blot, leírtak az Anyagok és módszerek. (B) Az idő folyamán változás Akt és ERK foszforiláció gyomorrákban kezelt sejtek FGF9. AGS és MKN28 sejteket hasonlóan kezeltük FGF9 (10 ng /ml) a feltüntetett időtartamig. (C) Az anti-FGF9 semlegesítő antitest on FGF9-indukált Akt és ERK foszforiláció a gyomor rákos sejtekben. AGS és MKN28 sejteket előkezeltük anti-FGF9 antitest (Ab; 1 ng /ml) 45 percig, majd stimuláltuk FGF9 (10 ng /ml) 30 percig.
Hatása FGF9 a sejt proliferációra, invázió és anti -apoptosis a gyomorrák sejtek
Mivel FGF9 ismert, hogy mitogén hatást gyakorolnak bizonyos sejttípusokban [17], először azt vizsgáltuk, hatását FGF9 a növekedési kinetikát a gyomor rákos sejteket. Ugyanakkor azt találtuk, nincs hatása FGF9 sejtproliferációra a AGS és MKN28 sejtvonalak (3A ábra). 3. ábra hatása FGF9 a növekedésre és az anti-apoptosis gyomorrák-sejtek. (A) hatása FGF9 a növekedésre a gyomor rákos sejteket. (B-D) hatása FGF9 az anti-apoptosis képessége gyomor rákos sejteket. (B) Reprezentatív grafikonok FACS analízis segítségével Annexin V-FITC festés. AGS sejteket kezeltünk FGF9 (10 ng /ml) és értékelni leírt Anyagok és módszerek. (C) számának változása apoptotikus AGS és MKN28 kezelt sejtek FGF9. (D) Az anti-FGF9 semlegesítő antitest (Neu Ab; 1 ng /ml) FGF9 (10 ng /ml) indukált anti-apoptózis AGS és MKN28 sejteket. Minden eredményeket mint az átlag ± SD, négy mintát. Szignifikánsan alacsonyabb, mint kontroll: * p
<0,05, ** p
< 0,01. Lényegesen nagyobb, mint a FGF9 kezelt csoport: # P katalógusa < 0,05, ## P katalógusa < 0,01.
Továbbá azokat a lehetséges szerepét FGF9 tumorprogresszióban azt vizsgáltuk, hogy az exogén FGF9 ruház anti-apoptotikus hatását a gyomor rákos sejteket. A FACS vizsgálatok során kiderült, hogy a szám Annexin V-pozitív AGS sejtek szignifikánsan kisebb volt a FGF9 kezelt csoportban, mint a kontroll csoportban, és hasonló eredményeket kaptunk MKN28 sejtek (3B és C). Továbbá, ez a hatás FGF9 megszüntették egyidejű alkalmazása anti-FGF9 semlegesítő antitest mindkét sejtvonalban (ábra 3D).
Sőt, mi következő hatását vizsgálta FGF9 a invazív képességét gyomor rákos sejteket. Amikor AGS sejteket stimulálunk FGF9 (1-10 ng /ml), a szám az invazív sejtek szignifikánsan emelkedett (4a ábra). Hasonlóképpen, a invazív képességét MKN28 sejtek jelentősen továbbfejlesztett dózisfüggő által FGF9 stimuláció (4A). Ezután megvizsgálták, hogy ez pro-invazív hatása FGF9 lehetne szüntetni hozzáadásával semlegesítő ellenanyag. Mindkét sejtvonal után egyidejű alkalmazása FGF9 semlegesítő antitestet (1 ng /ml), a szám az invazív sejtek szignifikánsan csökkent összehasonlítva kezelt sejtek FGF9 önmagában (10 ng /ml) (4b ábra). Ezen túlmenően, azt vizsgáltuk, hogy FGF9 indukált expressziója az MMP-k, amelyek döntő szerepet játszanak invázióban különféle rákok. Amint azt a 4C, FGF9 stimuláció általánosan fokozott expresszióját MMP7 katalógusa mind AGS és MKN28 sejteket. 4. ábra hatása FGF9 a invázió és az MMP-k kifejeződését gyomor rákos sejteket. (A) hatása FGF9 a gyomorrák sejtek invázióját. Számában bekövetkezett változásra invazív AGS és MKN28 kezelt sejtek FGF9 vizsgáltunk. Fényképeket bemutató reprezentatív képeit invazív gyomor rákos sejtek a kontroll és FGF9 kezelt csoportokban. (B) Az anti-FGF9 semlegesítő antitest (Neu Ab; 1 ng /ml) FGF9 (10 ng /ml) indukált invázióját AGS és MKN28 sejteket. (C) hatása FGF9 expressziójának MMP katalógusa gyomorrákban sejtekben. Minden eredményeket mint az átlag ± SD, négy mintát. Lényegesen nagyobb, mint kontroll: * p
<0,05, ** p
< 0,01. Lényegesen alacsonyabb, mint a FGF9 kezelt csoport: # P katalógusa < 0,05, ## P katalógusa < 0,01. Katalógusa Klinikopatológiai jelentősége FGF9 kifejezés gyomorrákban összefüggő fibroblasztok katalógusa A 20 gyomorrák szövetminták vizsgált tizenhat (80%) volt pozitív FGF9 kifejezést. Ami a klinikopatológiai jellemzők, sem a paraméterek ─ kora, neme, a tumor helye, szövettani típus, vagy a tumor stádiuma ─ szignifikáns összefüggés volt a FGF9 kifejezés (Plusz fájl 2: táblázat S2). Katalógusa Vita katalógusa Úgy véljük hogy a tumor kialakulásában és fejlődésében függ közötti áthallás a rákos sejtek és az őket körülvevő stromális sejtek. Mint egy nagy stromalis lakosság, "aktivált" fibroblasztok, a továbbiakban CAF, azt sugallják, hogy támogassák tumorogenezisben különféle molekuláris jeleket, és a jelen tanulmányban elszigetelt FGF9 katalógusa mint új gént, amelyet túltermelõdik CAF gyomorrákban . Egyre több bizonyíték, beleértve a jelenlegi adatok azt mutatták, hogy a CAF-ek eltérnek NGF szempontjából nemcsak a morfológia, hanem génexpressziós profilokat [18,19], bár a mögöttes mechanizmus felelős ezek a különbségek még nem tisztázott. Alapján újabb bizonyítékok, hogy a kísértés, hogy javasolja, hogy a daganatos sejtek indítják a váltás NGF a CAF valamilyen formában a jelző [20] vagy a CAF származnak rákos sejtek révén epithelialis mesenchymalis átmenet [21,22]. Érdekes, hogy széles körben elfogadott, hogy az FGF család kulcsfontosságú epithelialis-mesenchymalis átalakulás, és nem csak a fejlődés során, hanem a karcinogenezis [9,23]. A jelen vizsgálatban kimutattuk, hogy a CAF-ek egy lehetséges forrása FGF9, és hogy továbbá a gyomor rákos sejtek receptorok, amelyek reagálnak a FGF9, ami arra utal, hogy a FGF9 lehet egy potenciális közvetítő között CAF-ek és a gyomor rákos sejteket.
Mi lehetséges szerepét FGF9 patogenezisében gyomorrák? Mivel FGF9 szolgál mitogén prosztata- vagy petefészekrák [17,24], először vizsgáltuk proliferációját gyomorrák-sejtek jelenlétében FGF9 in vitro katalógusa. Ezt követően FGF9 nem támogatta elterjedése mind AGS és MKN28 gyomorrák-sejtvonalak; azonban nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy FGF9 szolgálhat mitogén más típusú gyomorrák sejtek mert FGF9 elősegíti elterjedése más gyomorrák sejtek, mint a AZ521 vagy SGC-7901 [25,26]. Másrészt, tisztáztuk a jelen tanulmány FGF9 van egy anti-apoptotikus hatását a gyomor rákos sejtek is, összhangban a vizsgálat eredményeit több korábbi vizsgálat [26,27]. Ennek alátámasztására a megállapítás, Akt és ERK jelátviteli, létfontosságú az anti-apoptózis-t gyakran aktiválódik mindkét gyomor rákos sejtvonalak. Továbbá FGF9-indukált Akt és /vagy ERK foszforiláció, és a kapott sejtek invázióját eltörölte blokkoló FGF9 stimuláció, ami arra utal, hogy FGF9 legalább működik, mint egy anti-apoptotikus tényező.
Azt is megvizsgálták, hogy FGF9 elősegíti a invazív képességét gyomor rákos sejteket. In vitro vizsgálatokban kimutatták, hogy katalógusa FGF9 kezelés növelte a betörő gyomorrák sejtek, mivel ez fokozott invazív képességét elnyomták hozzáadásával FGF9 semlegesítő ellenanyag. Bár nem világos, hogyan FGF9 elősegíti az invázió a gyomor rákos sejtek, lebomlása az extracelluláris mátrix egy fontos része ennek a folyamatnak [28]. Ebben az összefüggésben, elfogadott, hogy az MMP-k központi szerepet játszanak az ilyen sejtek viselkedésének és elősegíti a invazív képességét különböző daganatos [29]. Ezért átvizsgáljuk az MMP-k, amelyek kapcsolódnak FGF9 stimuláció és megállapította, hogy az MMP7 potenciálisan részt. Érdekes, hogy a legutóbbi vizsgálatok fontosságát hangsúlyozta MMP7 gyomorrákban progresszió, hiszen MMP7 van arra, hogy ne csak rontja az extracelluláris mátrix hanem biztosítanak egy anti-apoptotikus hatása a rákos sejtek [30-32]. Ennek megfelelően a jövőben tanulmányban kívánunk összpontosítani FGF /MMP7 tengely keretében gyomorrák sejtek invázióját. Katalógusa Következtetés
Összegezve, megmutattuk, hogy a gyomorsav a CAF eltér a megfelelő NGF szempontjából azok génexpressziós profilokat, és javasolja, hogy FGF9 potenciális molekula, amely közvetíti közötti áthallás CAF-ek és a gyomor rákos sejteket. Sőt, már egyértelművé tette, hogy az FGF elősegíti az anti-apoptózis és invazív képességét gyomorrák sejtek. Mindezzel együtt, az adatok arra utalnak, hogy FGF9 egy lehetséges közvetítő kiválasztódnak rákkal összefüggő fibroblasztok, amely elősegíti az anti-apoptózis és invazív képességét gyomorrák sejtek. Katalógusa Notes katalógusa Chao Sun és Hirokazu Fukui hozzájárult egyaránt ezt a munkát.
Rövidítések
FGF: katalógusa fibroblaszt növekedési faktor
MMP: mátrix metalloproteináz katalógusa
ERK
extracelluláris szignál által szabályozott protein kináz
CAF: katalógusa rákkal összefüggő fibroblaszt
nyilatkozatok katalógusa Köszönetnyilvánítás Ez a munka katalógusa részben támogatta a Grants-in-támogatás Tudományos Kutatási Minisztérium Oktatási, Kulturális, Sport, Tudományos és Technológiai, Japán (23591949 MS, 25460466 SK és 26460953 HF). Ezt a munkát is részben támogatta Grant-in-Aid Kutatók, Hyogo College of Medicine és támogatott program a Stratégiai Kutatási Alapítvány magánegyetemekre (MS).
A szerzők köszönetet Noriko Kamiya (Division of Gastroenterology Tanszék Belgyógyászati) és Yuko Yasui (Department of Surgery) azok a technikai segítségnyújtás, valamint értékelik Nobuyuki Adachi és Ryota Shinozaki (HCM vegyes felhasználású Kutatóberendezések) műszaki hozzájárulást. katalógusa További fájlok
További fájl 1: táblázat S1 . Primerek a real-time RT-PCR analízis. Kiegészítő fájl 2. táblázat S2. Közötti kapcsolat klinikopatológiai jellemzők és stroma FGF9 kifejezést gyomorrákos betegeknél. Versengő érdekek
A szerzők kijelentik, hogy nem ellentétes érdekek. Katalógusa szerzôk hozzájárulása katalógusa CS és HF tervezték meg és hajtották végre a kísérletet, adatait elemezte, és írta a kéziratot. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• A diagnosztikus kihívást pulmonális tumor thromboticus microangiopathia, mint egy bemutató az áttétes gyomorrák: a esetismertetés és irodalmi áttekintés
• Xpert MTB /RIF assay lehet használni archivált gyomor Pipettázzunk és indukált köpet mintákat érzékeny diagnosztizálására gyermekgyógyászati ​​tuberkulózis