FGF9 da fibroblasti cancro-associata è un possibile mediatore di invasione e anti-apoptosi delle cellule di cancro gastrico

FGF9 da fibroblasti cancro-associata è un possibile mediatore di invasione e anti-apoptosi delle cellule di cancro gastrico
Abstract
sfondo
fibroblasti cancro-associata (CAF), che si trovano in giro per le cellule tumorali, sono suggerite a svolgere un ruolo chiave nella progressione tumorale. Qui abbiamo effettuato microarray analisi per confrontare profili di espressione genica tra CAF e fibroblasti gastrici non-cancerose (NGFs) da un paziente con cancro gastrico e ha scoperto che il fattore di crescita dei fibroblasti 9
(FGF9
) è stato un fattore di crescita romanzo sovraespresso in CAF. Abbiamo poi esaminato gli effetti biologici di FGF9 durante la progressione del cancro gastrico.
Metodi
Espressione di FGF9 nei CAFS e NGFs, ei loro prodotti secreti, sono stati esaminati mediante Western blotting. Gli effetti di FGF9 su AGS e cellule di cancro gastrico MKN28 in termini di proliferazione, invasione e anti-apoptosi sono stati valutati da WST-1 test, test camera di invasione e FACS, rispettivamente. Inoltre, la segnalazione intracellulare che FGF9 esercita i suoi ruoli biologici è stata esaminata in vitro
.
Risultati
FGF9 è stata fortemente espressa nel CAF in confronto con NGFs, essendo compatibile con i dati di microarray che indica che FGF9 stata una crescita romanzo fattore sovraespresso in CAF. Il trattamento con FGF9 promosso l'invasione e anti-apoptosi attraverso l'attivazione delle ERK e AKT vie di segnalazione nelle cellule AGS e MKN28, che tali effetti sono stati attenuati da un trattamento con anti-FGF9 di anticorpi neutralizzanti. Inoltre, il trattamento FGF9 sensibilmente accentuata l'espressione della metalloproteinasi della matrice 7 (MMP7) in entrambe le linee cellulari.
Conclusioni
FGF9 è un possibile mediatore secreto dal CAF che promuove l'anti-apoptosi e la capacità invasiva delle cellule di cancro gastrico.
Parole
fibroblasti FGF cancro-associata Invasion anti-apoptosi ERK Akt cancro gastrico Sfondo
La formazione di lesioni cancerose è intimamente associata con la loro microambiente unico. La progressione è strettamente correlata con la capacità delle cellule tumorali di reclutare e attivare le cellule stromali circostanti, e successivamente li sfruttano [1]. cellule stromali cancro circostante, come fibroblasti, cellule endoteliali e cellule del sistema immunitario, possono orchestrare tumorigenesi e delle metastasi attraverso l'interazione cellula-cellula e /o produzione di solubili crescita fattori /citochine /chemochine [1-3]. In questo contesto, i fibroblasti in lesioni cancerose sono noti come fibroblasti cancro-associata (CAF) e hanno ricevuto molta attenzione per quanto riguarda il loro ruolo nella progressione tumorale [4,5]. Sebbene CAF sono noti per essere molto diversi dai fibroblasti normali nei tessuti non neoplastici in termini di profilo genico, il meccanismo con cui CAF promuovere la progressione tumorale è chiaro. Pertanto, abbiamo confrontato i profili di espressione genica di CAF, concentrandosi in particolare sulla crescita fattori /citochine /chemochine, con quelli dei fibroblasti gastrici non-cancerose (NGFs) utilizzando analisi microarray, e successivamente isolato fattore di crescita dei fibroblasti 9
(FGF9
) come un nuovo gene che è stato sovraespresso nel CAF nel carcinoma gastrico.
FGF9, una proteina secretoria della famiglia FGF, viene riferito, espresso in cellule stromali inclusi i fibroblasti [6-8]. In generale, la segnalazione FGF avviene attraverso FGF recettori (FGFRs) per regolare una varietà di comportamento biologico delle cellule, tra cui la proliferazione, la differenziazione, la sopravvivenza e la motilità [9], e l'espressione di FGF9, FGFR2c, FGFR3b e FGFR3c è stato rilevato nel gastrica e del colon tumori [10]. Così, come altre proteine ​​della famiglia FGF, FGF9 può giocare un ruolo fondamentale nell'interazione tra le cellule tumorali e le loro cellule stromali circostanti, ed è da notare che FGF9 è fortemente espresso nei CAFS nel cancro gastrico. Nel presente studio, abbiamo proiettato per le differenze di espressione genica tra CAF e NGFs da un paziente con cancro gastrico. Abbiamo esaminato l'effetto di FGF9 sulla proliferazione, invasione e anti-apoptosi delle cellule di cancro gastrico, ed inoltre chiarito la segnalazione intracellulare che FGF9 esercita i suoi effetti biologici su cellule di cancro gastrico.
Metodi
Reagenti e coltura cellulare
FGF9 ricombinante umana e anticorpi neutralizzanti FGF9 anti-umano sono stati acquistati da R & D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anti-extracellulare chinasi segnale regolata proteine ​​(ERK), anti-fosfo-specifici ERK (p-ERK), anti-Akt, anti-fosfo-specifici Akt (p-Akt; ser473) gli anticorpi, e anti-β-actina erano acquistato da Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA): Le cellule di cancro gastrico linee AGS è stato colto in F-12 di media di Ham (Sigma, Aurora, Ohio, Stati Uniti d'America) con il 10% di siero fetale bovino (FBS,. BioWest, Nuaillé, Francia) in un incubatore umidificato a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO 2. Allo stesso modo, MKN28 era coltivato in terreno RPMI 1640 con 10% di siero fetale bovino, e altre cinque linee di cellule di cancro gastrico MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY, e KATOIII sono stati mantenuti come descritto in precedenza [11].
Isolamento e la coltura di fibroblasti gastriche umane
cancro gastrico (adenocarcinoma scarsamente differenziato) campioni umani sono stati ottenuti da un paziente che ha subito una gastrectomia a Hyogo college of Medicine Hospital nel 2012. fibroblasti cancro-associata (CAF) sono stati preparati dalla porzione cancerosa nello stomaco. fibroblasti gastrici non-cancerose (NGFs) sono stati preparati da parte di non-cancerose con gastrite atrofica almeno 50 mm lontano dal tumore allo stomaco. I campioni di tessuto sono stati tagliati del tessuto adiposo e necrotico, macinata con bisturi e lavati in PBS contenente antibiotico-antimicotico reagente (anti-Anti®, GIBCO). I pezzi di tessuto sono stati trasferiti ad un 12-pozzetti di micropiastre (IWAKI, Tokyo, Giappone) ad un frammento /pozzetto. Le cellule sono state coltivate in terreno DMEM (GIBCO, Grand Island, NY, USA) con il 10% inattivato al calore FBS a 37 ° C in una atmosfera di CO2 al 5%. I fibroblasti che inizialmente cresciute in monostrato sono stati raccolti, trasferito ad un altro piatto e utilizzati per esperimenti entro il 10 di passaggio. Questi studi sono stati fatti con l'approvazione del Consiglio di Hyogo College of Medicine Review, e il consenso informato è stato ottenuto dal paziente.
Analisi microarray
Utilizzando reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), l'RNA totale è stato di estratto da tre serie di CAF e NGFs coltivate. etichettatura cDNA, ibridazioni, la scansione e l'analisi dei dati sono state eseguite da Hokkaido Sistema Science Co., Ltd (Sapporo, Giappone). In breve, cianina-3 (Cy3) -labeled cRNA è stato preparato da RNA totale (0,05 mg) con un basso input rapido Amp Labeling Kit (Agilent) in accordo con le istruzioni del produttore, seguito da RNAeasy purificazione colonna (QIAGEN, Valencia, CA) . Dye incorporazione e la resa cRNA sono stati controllati con un NanoDrop ND-1000 spettrofotometro. Cy3-marcato cRNA (0,60 mg) è stato frammentato a 60 ° C per 30 min in un volume di reazione di 25 microlitri tampone contenenti frammentazione 1x Agilent e 2x Agilent agente bloccante in conformità con le istruzioni del produttore. Al termine della reazione frammentazione, 25 microlitri di tampone di ibridazione 2x Agilent è stato aggiunto alla miscela di frammentazione e ibridati Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression Microarray (8x60K ver.2.0) per 17 ore a 65 ° C in un rotante Agilent ibridazione forno. Dopo l'ibridazione, i microarray sono stati lavati per 1 min a temperatura ambiente con GE Wash Buffer 1 (Agilent) e per 1 min a 37 ° C con tampone GE Wash 2 (Agilent), quindi essiccati immediatamente breve centrifugazione. I vetrini sono stati digitalizzati subito dopo il lavaggio su un Agilent DNA microarray scanner (G2565CA) utilizzando l'impostazione per le diapositive di array 8x60K una scansione a colori (Area di scansione 61 × 21,6 millimetri, risoluzione 3μm di scansione, il canale Colorante per Green PMT impostato al 100%). Le immagini acquisite sono state analizzate e normalizzata con Feature Extraction Software 10.7.3.1 (Agilent).
Estrazione di RNA e trascrizione inversa-reazione a catena della polimerasi (RT-PCR)
RNA totale è stato estratto da linee cellulari di cancro gastrico mediante Trizol reagente (Invitrogen). Quattro microgrammo di RNA totale è stato retrotrascritto utilizzando oligo dT (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA) e 200 U di Superscript ™ II trascrittasi inversa (Invitrogen) in un volume totale di 20μl. Per il seguente PCR, coppie di primers per FGFRs umani
sono stati preparati come precedentemente descritto [12]. Umana FGFR2c
: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(Avanti) e 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (Reverse); umano FGFR3b
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Avanti) e 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 '(Reverse); umano FGFR3c
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Avanti) e 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (Reverse); umano GAPDH
: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(Avanti) e 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (Reverse). Un microlitro di prodotto RT (cDNA) è stato amplificato mediante PCR in un volume di reazione di 50 ml contenente 20 pmol dei set precedenti di primer, 1,25 U di polimerasi Ampli-Taq DNA (Applied Biosystems, Foster City, in California., Stati Uniti d'America), e il buffer PCR finale: 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolo e 1 mM dNTP. L'amplificazione PCR è stata eseguita come segue: per FGFRs
, a 95 ° C per 5 min volta; 40 cicli a 95 ° C per 30 s, a 57 ° C per 30 s, e a 72 ° C per 1 min; poi a 72 ° C per 7 min; per GAPDH
, a 95 ° C per 7 minuti una volta; 40 cicli a 95 ° C per 30 s, a 55 ° C per 1 min, e a 72 ° C per 30 sec; poi a 72 ° C per 7 minuti. Real-time RT-PCR Real-time RT-PCR è stata effettuata utilizzando 7900H veloce Real-Time PCR (Applied Biosystem) come descritto in precedenza [13]. I seguenti set di primer per metalloproteinasi della matrice umana 2
(MMP2
), MMP3
, MMP7
, MMP9
, e GAPDH
sono stati preparati (sui file 1: Tabella S1) . Real-time saggi RT-PCR sono state effettuate con 200 ng di RNA cDNA equivalente, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), e 500 nmol /l gene primers specifici. Le condizioni di ciclo di PCR erano 50 ° C per 15 s, e 60 ° C per 60 s. L'intensità del colorante fluorescente è stato determinato, e ciascuno dei livelli di espressione di mRNA è stato normalizzato a GAPDH
livelli di espressione di mRNA.
Saggio di proliferazione cellulare
AGS (4 × 10 3) e le cellule MKN28 (1 × 10 4) sono state seminate in terreno completo in 96 pozzetti. Il mezzo è stato poi sostituito con un altro contenente FGF9 ricombinante (0-10 ng /ml). WST-1 soluzione venne aggiunto dopo 72 h di incubazione, e le piastre sono state incubate a 37 ° C per 1 h. I piatti sono stati analizzati utilizzando un lettore di piastre ELISA a 450 nm con lunghezza d'onda di riferimento fissato a 600 nm.
Saggio cellulare invasione
saggio cellulare invasione è stata effettuata utilizzando BIOCOAT Matrigel camere Invasion (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) secondo il protocollo del produttore. In breve, le cellule AGS (1 × 10 5) o cellule MKN28 (3 × 10 5) sono stati seminati nell'inserto della camera di invasione Matrigel rivestite (24 pozzi, di 8 micron di dimensione dei pori) riempito con siero medio-free contenente diverse concentrazioni di FGF9 (0-10 ng /ml). Poi, le cellule sono state incubate con terreno contenente 10% FBS nella camera inferiore a 37 ° C in 5% CO2. Per inibire gli effetti di FGF9, anticorpo anti-FGF9 (1 ​​mg /ml) è stato aggiunto alla camera superiore. Dopo incubazione per 27 ore, le cellule non invasivi sono stati rimossi con un batuffolo di cotone e le cellule che avevano invaso nella superficie inferiore della membrana sono stati fissati con etanolo. Le cellule invasori sono state poi colorate con ematossilina e contate utilizzando un microscopio in cinque diversi campi visivi (ingrandimento, x200).
Apoptosi test
AGS (2 × 10 5) e MKN28 (2,5 × 10 5) cellule sono state seminate in piastre a sei pozzetti in terreno routine per 24 h. Le cellule sono state private del siero e trattate con o senza FGF9 ricombinante (1-10 ng /ml) per 48 ore. Per inibire gli effetti di FGF9, anticorpo anti-FGF9 (1 ​​mg /ml) è stata aggiunta al mezzo di coltura. Dopo il trattamento, sia le cellule galleggianti e allegate sono state raccolte, lavate con PBS e colorate con AnnexinV-FITC e ioduro di propidio (PI) utilizzando un kit MEBCYTO apoptosi (MBL, Nagoya, Giappone). cellule colorate sono state analizzate su un FACScalibur citofluorimetro (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), ei dati ottenuti sono stati analizzati utilizzando il software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).
analisi Western Blot
analisi Western blot sono stati eseguiti come precedentemente descritto [14]. Brevemente, dopo il trattamento con o senza il reagente, le cellule sono state lisate in tampone di estrazione di proteine, ed estratto proteico (30 mg) è stato frazionati da sodio dodecil solfato SDS-PAGE e trasferite su una membrana di nitrocellulosa blotting. La membrana è stata incubata con un anticorpo primario e poi con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi. Le proteine ​​sono state rilevate mediante un sistema di chemiluminescenza potenziata (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Regno Unito).
Immunoistochimica
Un totale di 20 tumori gastrici tessuti sono stati ottenuti da campioni asportati chirurgicamente a Hyogo College of Medicine. I campioni di tessuto sono stati fissati in formalina al 10% ed inclusi in paraffina. Questo studio è stato approvato dal Consiglio di Hyogo College of Medicine Review, e il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti. Le caratteristiche dei pazienti affetti da cancro gastrico hanno mostrato nel file aggiuntive 2: Tabella S2
colorazione immunoistochimica per FGF9 è stata eseguita con un LSAB + kit con anticorpo anti-FGF9 (01:40; R & D Systems, Minneapolis, MN, Stati Uniti d'America). come precedentemente descritto [15]. Infine, le sezioni sono state incubate in 3,3'-diaminobenzide tetraidrocloride con 0,05% H2O2 per 3 minuti, e poi di contrasto con ematossilina di Mayer. Per valutare l'immunoreattività di FGF9, almeno cinque diversi campi visivi sono stati osservati al fronte invasiva delle lesioni cancro gastrico. Un campione è stato considerato positivo quando sono stati osservati nidi fibroblastic FGF9-positivo nei campi visivi esaminati
. Analisi Statistiche
Tutti i valori sono stati espressi come media ± SD. I dati sono stati analizzati utilizzando spaiato a due code t
-test. I valori P
inferiori a 0,05 sono stati considerati per indicare la significatività statistica.
Risultati
microarray analisi dei CAF nei tessuti di cancro gastrico
abbiamo isolato CAF e NGFs (Figura 1A) e confrontato il profilo di espressione genica di CAF con quella di NGFs utilizzando saggio microarray. Dieci geni rappresentativi che erano sovraregolati nei CAF sono elencati nella Tabella 1. Tra questi geni, abbiamo mirato FGF9 come il gene più altamente espresso per esaminare il ruolo di questo fattore di crescita CAF-prodotte su cellule di cancro gastrico, e infatti prima di iniziare in vitro
studi che hanno confermato che le cellule prodotte CAF molto più grande quantità di proteine ​​FGF9 di cellule NGF (Figura 1B). Inoltre, abbiamo confermato che FGF9 è fortemente espresso nei fibroblasti nello stroma della lesione cancro gastrico da cui è stato isolato CAF (Figura 1C). Figura 1 L'espressione di FGF9 e dei suoi recettori nei CAFS e cellule di cancro gastrico. (A) Morfologia della CAF gastrici e NGFs. (B) Produzione di FGF9 in CAF gastrici, NGFs e il loro mezzo condizionato (CM). (C) Espressione di FGF9 in CAF della lesione cancro gastrico. Le frecce indicano CAF. (D) Espressione dei recettori FGF
responsabile FGF9 nelle linee di cellule di cancro gastrico.
Tabella 1 geni rappresentativi differenzialmente espressi nei CAFS da NGFs
No. adesione
Simbolo

del gene
Piegare cambiamento
up-regolati
NM_014333
CADM1
cellulare molecola di adesione 1, variante di trascrizione 1
273.6
CB178477
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gb

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