FGF9 fra kreft-assosiert fibroblaster er en mulig formidler av invasjon og anti-apoptose av magekreftceller

FGF9 fra kreft-assosiert fibroblaster er en mulig formidler av invasjon og anti-apoptose av magekreftceller
Abstract
Bakgrunn
kreft-assosiert fibroblaster (kafeer), som bor rundt kreftceller, er foreslått å spille en sentral rolle i tumorprogresjon. Her utførte vi microarray-analyser for å sammenligne genuttrykk profiler mellom kafeer og ikke-kreft mage fibroblaster (NGFs) fra en pasient med magekreft og funnet ut at fibroblast vekstfaktor 9 plakater (FGF9
) ble en ny vekstfaktor overexpressed i kafeer. Vi deretter undersøkt de biologiske effektene av FGF9 under progresjon av magekreft.
Metoder
Uttrykk av FGF9 i kafeer og NGFs og deres utskilte produkter, ble undersøkt ved Western blotting. Effektene av FGF9 på AGS og MKN28 magekreftceller i form av spredning, invasjon og anti-apoptose ble vurdert av WST-1-analysen, invasjon kammer analysen og FACS, henholdsvis. Videre ble det intracellulære signal der FGF9 utøver sine biologiske roller undersøkt in vitro
.
Resultater
FGF9 ble sterkt uttrykt i kafeer i sammenligning med NGFs, å være kompatibel med microarray data som indikerer at FGF9 var en roman vekst faktor overexpressed i kafeer. Behandling med FGF9 fremmet invasjon og anti-apoptose gjennom aktivering av ERK og Akt signalveier i AGS og MKN28 celler, mens disse effektene ble dempet ved behandling med anti-FGF9 nøytraliserende antistoff. I tillegg FGF9 behandling vesentlig forbedret uttrykk for matriksmetalloproteinase 7 (MMP7) i begge cellelinjer.
Konklusjoner
FGF9 er en mulig megler som skilles ut av kafeer som fremmer anti-apoptose og invasiv evnen til mage kreftceller.
nøkkelord
FGF kreft-assosiert fibroblast Invasion Anti-apoptose ERK Akt Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP Bakgrunn
dannelsen av kreft lesjoner er intimt forbundet med deres unike mikromiljøet. Progresjon er nært forbundet med evnen til kreftceller til å rekruttere og aktivere de omkringliggende stromaceller, og deretter utnytte dem til [1]. Kreft-området stromale celler, slik som fibroblaster, endotelceller og immunceller, kan organisere tumorigenesis og metastase gjennom celle-til-celle-interaksjon og /eller produksjon av oppløselige vekstfaktorer /cytokiner /kjemokiner [1-3]. I denne sammenheng er fibroblaster i til kreft er kjent som kreftassosiert fibroblaster (kafeer) og har fått mye oppmerksomhet med hensyn til deres rolle i tumorprogresjon [4,5]. Selv kafeer er kjent for å være i stor grad forskjellig fra normale fibroblaster i ikke-neoplastiske vev i form av deres gene-profil, den mekanismen som kafeer fremme tumorprogresjon er uklart. Derfor, sammenlignet vi genekspresjonsprofiler fra kafeer, og fokuserer spesielt på vekstfaktorer /cytokiner /kjemokiner, med de av ikke-kreft mage fibroblaster (NGFs) ved hjelp av mikromatriseanalyse, og deretter isolert fibroblastvekstfaktor 9 plakater (FGF9
) som et nytt gen som ble overuttrykt i kafeer i magekreft.
FGF9, en sekretorisk protein av FGF-familien, er angivelig uttrykt i stromale celler innbefattende fibroblaster [6-8]. Vanligvis oppstår FGF signalering via FGF reseptorer (FGFRs) for å regulere en rekke celle biologisk atferd, herunder spredning, differensiering, overlevelse og bevegelighet [9], og uttrykk for FGF9, FGFR2c, FGFR3b og FGFR3c er påvist i mage og tykktarm -kreft [10]. Dermed som andre FGF familie proteiner, kan FGF9 spille en sentral rolle i samspillet mellom kreftceller og deres omkringliggende stromale celler, og det er bemerkelsesverdig at FGF9 er sterkt uttrykt i kafeer i magekreft. I denne studien har vi undersøkt forskjeller i genuttrykk mellom kafeer og NGFs fra en pasient med magekreft. Vi undersøkte effekten av FGF9 på spredning, invasjon og anti-apoptose av magekreftceller, og dessuten avklares den intracellulære signal der FGF9 utøver sine biologiske effekter på mage kreftceller.
Metoder
Reagenser og cellekultur
menneskelig rekombinant FGF9 og anti-human FGF9 nøytraliserende antistoff ble kjøpt fra R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anti-ekstracellulære signalregulerte protein kinase (ERK), anti-fosfo-spesifikke ERK (p-ERK), anti-Akt, anti-fosfo-spesifikke Akt (p-Akt, Ser473), og anti-β-aktin-antistoffer var kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)
ventrikkelkreftstudien cellelinjer AGS var dyrket i Hams F-12 medium (Sigma, Aurora, Ohio, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS,. BioWest, Nuaille, Frankrike) i en fuktet inkubator ved 37 ° C med en atmosfære av 5% CO 2. Tilsvarende MKN28 ble dyrket i RPMI 1640 medium med 10% føtalt bovint serum, og andre fem gastrisk cancer-cellelinjer MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY, og KATOIII ble opprettholdt som tidligere beskrevet [11].
Isolering og kulturen menneskelige mage fibroblaster
menneskemagekreft (dårlig differensiert adenokarsinom) prøver ble hentet fra en pasient som gjennomgikk gastrektomi ved Hyogo College of Medicine Hospital i 2012. kreft-assosiert fibroblaster (kafeer) ble fremstilt fra cancerous del i magen. Ikke-kreft gastriske fibroblaster (NGFs) ble fremstilt fra ikke-kreft parti med atrofisk gastritt minst 50 mm langt fra tumor i magen. Vevsprøvene ble trimmet av fett og nekrotisk vev, hakket med skalpeller og vasket i PBS inneholdende antibiotisk antimykotisk-reagens (anti-Anti®, GIBCO). Vevet Stykkene ble overført til en 12-brønns mikroplate (Iwaki, Tokyo, Japan) ved en fragment /brønn. Cellene ble dyrket i DMEM-medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) med 10% varme-inaktivert FBS ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO2. Fibroblaster som opprinnelig vokste i et monosjikt ble oppsamlet, overført til en annen skål og anvendt for forsøk innen den 10. passasje. Disse studiene ble utført med godkjenning av Review Board of Hyogo College of Medicine, og informert samtykke ble innhentet fra pasienten.
Microarray analyse
Bruke Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), total RNA var hentet fra tre sett med kafeer og NGFs kultiverte. cDNA merking, hybridizations, skanning og dataanalyse ble utført ved Hokkaido System Science Co., Ltd (Sapporo, Japan). Kort, cyanine-3 (Cy3) -merket cRNA ble fremstilt fra total RNA (0,05 mikrogram) med en lav inngang Hurtig Amp Merking Kit (Agilent) i henhold til produsentens anvisninger, etterfulgt av RNAeasy kolonne rensing (Qiagen, Valencia, CA) . Dye innlemmelse og cRNA utbyttet ble sjekket med en Nanodrop ND-1000 spektrofotometer. Cy3-merket cRNA (0,60 ug) ble fragmentert ved 60 ° C i 30 minutter i et reaksjonsvolum på 25 pl inneholdende 1 x Agilent fragmentering buffer og 2 x Agilent-blokkerende middel i henhold til produsentens instruksjoner. Ved fullføring av fragmentering reaksjonen, ble 25 ul av 2x Agilent hybridiseringsbuffer tilsatt til blandingen fragmentering og hybridisert til Agilent SurePrint G3 Humant Gene Expression Microarray (8x60K Ver.2.0) i 17 h ved 65 ° C i en roterende ovn Agilent hybridisering. Etter hybridisering, ble mikromatriser vasket i 1 minutt ved romtemperatur med GE vaskebuffer 1 (Agilent) og i 1 min ved 37 ° C med GE vaskebuffer 2 (Agilent), deretter tørket umiddelbart ved kort sentrifugering. Lysbilder ble skannet umiddelbart etter vask på et Agilent DNA microarray Scanner (G2565CA) ved hjelp av en fargeskanning innstilling for 8x60K matrise lysbilder (Skann.område 61 × 21,6 mm, Skanneoppløsning 3 um, Dye kanal for Grønn PMT satt til 100%). De skannede bildene ble analysert og normalisert med Feature Extraction programvare 10.7.3.1 (Agilent).
RNA ekstraksjon og revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra magekreftcellelinjer ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen). Fire mikrogram av total RNA ble revers-transkribert ved å bruke oligo dT (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA) og 200 enheter av Superscript II revers transkriptase ™ (Invitrogen) i et totalt volum på 20 ul. For den følgende PCR, par av oligonukleotidprimere for humane FGFRs
ble fremstilt som tidligere beskrevet [12]. Menneskelig FGFR2c
: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(Forward) og 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (bakover); menneskelig FGFR3b
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Forward) og 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 '(bakover); menneskelig FGFR3c
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Forward) og 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (bakover); menneskelig GAPDH
: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(Forward) og 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (revers). En mikroliter RT produkt (cDNA) ble amplifisert ved PCR i et 50 ul reaksjonsvolum inneholdende 20 pmol av de ovennevnte sett av primere, 1,25 U av Ampli-Taq DNA-polymerase (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA), og den endelige PCR-buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, og 1 mM dNTP. PCR-amplifikasjon ble utført som følger: for FGFRs
, ved 95 ° C i 5 minutter en gang; 40 sykluser ved 95 ° C i 30 s, ved 57 ° C i 30 s, og ved 72 ° C i 1 min; og deretter ved 72 ° C i 7 minutter; for GAPDH
, ved 95 ° C i 7 min gang; 40 sykluser ved 95 ° C i 30 s, ved 55 ° C i 1 min, og ved 72 ° C i 30 sek; og deretter ved 72 ° C i 7 min. Sanntids RT-PCR
Sanntids RT-PCR ble utført ved anvendelse av 7900H Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem) som tidligere beskrevet [13]
. Følgende sett med primere for menneskelig matriksmetalloproteinase to plakater (MMP2
), MMP3
, MMP7
, MMP9
, og GAPDH
ble utarbeidet (tilleggsfiler 1: Tabell S1) . Sanntids RT-PCR-analyser ble utført med 200 ng RNA tilsvarende cDNA, SYBR grønn Master Mix (Applied Biosystems), og 500 nmol /l genet spesifikke primere. PCR sykkel betingelsene var 50 ° C i 15 s, og 60 ° C i 60 sek. Intensiteten av det fluorescerende fargestoff ble bestemt, og hver av mRNA-ekspresjonsnivåer ble normalisert til GAPDH
mRNA ekspresjonsnivåer.
Celleproliferasjonsanalyse
AGS (4 x 10 3) og MKN28-celler (1 x 10 4) ble sådd ut i komplett medium i 96-brønners mikrotiterplater. Mediet ble deretter erstattet med en inneholdende rekombinant FGF9 (0-10 ng /ml). WST-1-oppløsning ble tilsatt etter 72 timers inkubering, og platene ble inkubert ved 37 ° C i 1 time. Platene ble analysert ved bruk av en ELISA-plateavleser ved 450 nm med referanse bølgelengde innstilt på 600 nm.
Celle invasjon assay
celle invasjon analysen ble utført ved anvendelse av BioCoat Matrigel invasjons kamre (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) henhold til produsentens protokoll. I korthet AGS-celler (1 x 10 5) eller MKN28 celler (3 x 10 5) ble sådd ut i innsatsen av Matrigel-belagte invasjon kammer (24 brønner, 8-um porestørrelse) fylt med serum -fri medium inneholdende forskjellige konsentrasjoner av FGF9 (0-10 ng /ml). Deretter ble cellene inkubert med medium inneholdende 10% FBS i det nedre kammer ved 37 ° C i 5% CO2. For å hemme effektene av FGF9, ble anti-FGF9 antistoff (1 ug /ml) også tilsatt til det øvre kammer. Etter inkubering i 27 timer ble ikke-invaderende celler fjernet ved hjelp av en bomullspinne og cellene som hadde invadert inn i den nedre overflaten av membranen ble fiksert med etanol. Invaderende Cellene ble deretter farget med hematoksylin og telles ved hjelp av et mikroskop i fem forskjellige visuelle felt (forstørrelse, x200).
Apoptose analysen
AGS (2 × 10 5) og MKN28 (2,5 × 10 5) celler ble sådd ut i seks-brønns plater i rutine medium i 24 timer. Cellene ble deretter fratatt serum og behandlet med eller uten rekombinant FGF9 (1-10 ng /ml) i 48 timer. For å hemme effektene av FGF9, ble anti-FGF9 antistoff (1 ug /ml) også tilsatt til kulturmediet. Etter behandling ble både flytende og knyttet cellene høstet, vasket med PBS og farget med AnnexinV-FITC og propidiumjodid (PI) med en MEBCYTO apoptose Kit (MBL, Nagoya, Japan). Fargede celler ble analysert på en FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), og data innhentet ble analysert ved hjelp Cellquest-programvare (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).
Western blot analyse
Western blot analyser ble utført som tidligere beskrevet [14]. I korthet, etter behandling med eller uten reagens ble cellene lysert i proteinekstraksjon buffer, og proteinekstrakt (30 ug) ble fraksjonert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til en nitrocelluloseblotting-membran. Membranen ble inkubert med et primært antistoff, og deretter med et peroksidase-konjugert sekundært antistoff. Proteiner ble påvist ved hjelp av en forbedret kjemiluminescens system (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK).
Immunohistochemistry
Totalt 20 mage kreftformer vev ble oppnådd fra prøver resected kirurgisk ved Hyogo College of Medicine. Vevspreparat ble fiksert i 10% formalin løsning og innstøpt i parafin. Denne studien ble godkjent av Review Board of Hyogo College of Medicine, og informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. Karakteristikken av magekreftpasienter var viste igjen fil 2: Tabell S2
Immunhistokjemisk farging for FGF9 ble utført med en LSAB + kit bruker anti-FGF9 antistoff (1:40; R & D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). som tidligere beskrevet [15]. Til slutt ble seksjonene inkubert i 3,3'-diaminobenzide tetrahydroklorid med 0,05% H2O2 i 3 minutter, og deretter motfarget med Mayers hematoksylin. For å evaluere immunoreaktiviteten av FGF9, ble minst fem forskjellige synsfelt observert på invasiv forsiden av magekreft lesjoner. Et eksemplar ble ansett positiv når FGF9-positive fibrinoblast reir ble observert i synsfelt undersøkt
. Statistisk analyse
Alle verdier ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Dataene ble analysert ved hjelp av uparet tosidige t
-test. P
verdier på mindre enn 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans.
Resultater
microarray analyser av kafeer i mage kreft vev
Vi isolerte kafeer og NGFs (figur 1A) og sammenlignet genuttrykket profilen kafeer med at av NGFs bruker microarray analyse. Ti representative gener som ble oppregulert i kafeer er angitt i tabell 1. Blant disse genene, målrettet vi FGF9 som den mest høyt uttrykt gen for å undersøke rollen til denne CAF-vekstfaktor produsert på magekreftceller, og i virkeligheten før in vitro
studier vi bekreftet at CAF celler produseres mye større mengde FGF9 protein enn NGF celler (Figur 1b). Videre fikk vi bekreftet at FGF9 er sterkt uttrykt i fibroblaster i stroma av magekreft lesjon som CAF ble isolert (figur 1C). Figur 1 Uttrykk for FGF9 og dets reseptorer i kafeer og mage kreftceller. (A) Morfologi av mage kafeer og NGFs. (B) Produksjon av FGF9 i mage kafeer, NGFs og deres kondisjonert medium (CM). (C) Uttrykk for FGF9 i kafeer av magekreft lesjon. Piler indikerer kafeer. (D) Uttrykk for FGF-reseptorer
ansvarlig for FGF9 i mage kreft cellelinjer.
Tabell 1 representant genene forskjellig uttrykt i kafeer fra NGFs
aksesjonsnr
Symbol

Gene navn
Brett endring
oppregulert
NM_014333
CADM1
Cell adhesjonsmolekyl 1, avskrift variant 1
273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
gb

• Den diagnostiske utfordringen med lungesvulst trombotisk mikroangiopati som en presentasjon for magekreft med spredning: en kasuistikk og gjennomgang av literature
• Xpert MTB /RIF-analysen kan brukes på arkiv gastrisk aspirat og indusert sputum prøver for sensitiv diagnostisering av pediatrisk tuberculosis