FGF9 van kanker-geassocieerde fibroblasten is een mogelijke mediator van de invasie en anti-apoptose van maagkanker cells

FGF9 van kanker-geassocieerde fibroblasten is een mogelijke mediator van de invasie en anti-apoptose van maagkanker cellen
De abstracte Achtergrond
-kanker geassocieerde fibroblasten (cafe's), die wonen rond tumorcellen, worden voorgesteld om een ​​centrale rol spelen bij tumorprogressie. Hier voerden we microarray analyses genexpressieprofielen tussen CAF en niet-kanker maag fibroblasten (NGF) vergelijken van een patiënt met maagkanker en vonden dat fibroblastgroeifactor 9
(FGF9
) werd een nieuwe groeifactor overexpressie in cafe's. Vervolgens onderzochten de biologische effecten van FGF9 tijdens progressie van maagkanker.

Werkwijzen Expressie van FGF9 in cafe's en NGF's en hun uitgescheiden produkten werden onderzocht door Western blotting. De effecten van FGF9 voor AGS en MKN28 maagkanker cellen qua proliferatie, invasie en anti-apoptose werd vastgesteld door WST-1 test kamer invasie assay en FACS respectievelijk. Bovendien werd de intracellulaire signalering waarmee FGF9 oefent zijn biologische rollen in vitro
onderzocht.
Resultaten
FGF9 werd sterk tot expressie gebracht in CAF vergeleken met NGF, verenigbaar met microarray data aangeeft dat FGF9 een nieuwe groei factor overexpressie in cafe's. Behandeling met FGF9 bevorderd invasie en anti-apoptose door het activeren van de ERK en Akt signaalwegen in AGS en MKN28 cellen, terwijl deze effecten waren verzwakt door behandeling met anti-FGF9 neutraliserende antilichamen. Bovendien FGF9 behandeling significant verhoogde expressie van matrix metalloproteinase 7 (MMP7) in beide cellijnen.
Conclusies
FGF9 een mogelijke mediator CAF uitgescheiden door de anti-apoptose en invasieve vermogen van maagkanker cellen bevordert.
Trefwoorden
FGF kanker-geassocieerde fibroblast Invasion Anti-apoptose ERK Akt Maagkanker Achtergrond
De vorming van kankerletsels is nauw verbonden met hun unieke micro-omgeving. Vooruitgang is nauw gecorreleerd met het vermogen van kankercellen te rekruteren en activeren de omringende stromale cellen en vervolgens uitbuiten [1]. Kanker omringende stromale cellen, zoals fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen, kan tumorvorming en metastase orkestreren via cel-cel interacties en /of productie van oplosbare groeifactoren /cytokinen /chemokinen [1-3]. In dit verband worden in fibroblasten van kanker bekend als kanker geassocieerde fibroblasten (cafe's) en veel aandacht gekregen wat hun rol in tumorprogressie [4,5]. Hoewel cafe's zijn bekend grotendeels verschillend van normale fibroblasten in niet-neoplastische weefsels qua genprofiel zijn, het mechanisme waarmee CAF promoten tumorprogressie onduidelijk. We hebben daarom de genexpressieprofielen van cafe's, met bijzondere aandacht voor groeifactoren /cytokinen /chemokinen, met die van niet-carcinomateuze maag fibroblasten (NGF) via microarray analyse, en vervolgens geïsoleerd fibroblastgroeifactor 9
(FGF9
) als een nieuw gen dat CAF werd overexpressie bij maagkanker.
FGF9 een secretorisch eiwit van de FGF-familie, is naar verluidt uitgedrukt in stromale cellen, waaronder fibroblasten [6-8]. In het algemeen FGF signalering gebeurt via FGF-receptoren (FGFR's) van verschillende celbiologische gedrag, waaronder proliferatie, differentiatie, overleving en beweeglijkheid [9], en expressie van FGF9 regelen FGFR2c, FGFR3b en FGFR3c is aangetroffen in de maag en colon kanker [10]. Aldus zoals andere FGF-familie eiwitten, FGF9 kan een centrale rol in de interactie tussen kankercellen en hun omringende stromale cellen spelen, en het is opmerkelijk dat FGF9 sterk uitgedrukt in CAF bij maagkanker. In de onderhavige studie hebben we onderzocht op verschillen in genexpressie tussen CAF en NGF's van een patiënt met maagkanker. We onderzochten het effect van FGF9 voor proliferatie, invasie en anti-apoptose van maagkanker cellen, en bovendien verduidelijkt de intracellulaire signalering waarmee FGF9 oefent zijn biologische effecten op maagkanker cellen.
Werkwijzen
Reagentia en celkweek
menselijk recombinant FGF9 en anti-humaan FGF9 neutraliserende antilichamen werden gekocht bij R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anti-extracellulair signaalgereguleerde proteïne kinase (ERK), anti-fosfo-specifieke ERK (p-ERK), anti-Akt, anti-fosfo-specifieke Akt (p-Akt, Ser473), en anti-β-actine antilichamen gekocht bij Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) Ondernemingen De maagkanker cellijnen AGS werd gekweekt in Ham's F-12 medium (Sigma, Aurora, Ohio, USA) met 10% foetaal runderserum (FBS;. Biowest, Nuaillé, Frankrijk) in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met een atmosfeer van 5% CO 2. Evenzo MKN28 werd gekweekt in RPMI 1640 medium met 10% foetaal runderserum, en vijf andere maagkanker cellijnen MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY en KATOIII werden gehandhaafd zoals eerder beschreven [11].
Isolatie en kweek van menselijke maag fibroblasten
Human maagkanker (slecht gedifferentieerd adenocarcinoom) monsters werden verkregen van een patiënt die gastrectomie ondergingen in Hyogo College of Medicine Ziekenhuis in 2012. kanker-geassocieerde fibroblasten (cafe's) werden bereid uit de kankercellen gedeelte in de maag. Goedaardige gastrische fibroblasten (NGF) werden bereid uit niet-carcinomateuze gedeelte met atrofische gastritis minstens 50 mm lang tumor in de maag. De weefselmonsters werden ontdaan van vet en necrotisch weefsel, gehakt met scalpels en gewassen in PBS met antibiotica-antimycotische reagens (Anti-Anti®, GIBCO). Het weefsel stukken werden overgebracht naar een 12-well microplaat (IWAKI, Tokyo, Japan) en een fragment /putje. De cellen werden gekweekt in DMEM medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) met 10% hitte-geïnactiveerd FBS bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2. De fibroblasten die initieel gegroeid in monolaag werden verzameld, overgebracht naar een schotel en gebruikt voor experimenten binnen de 10e passage. Deze studies werden gedaan met de goedkeuring van de Review Board van Hyogo College of Medicine, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënt.
Microarray analyse
behulp Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), totaal RNA was gewonnen uit drie sets van cafe's en NGF's gekweekt. cDNA etikettering, hybridisaties, scanning en data-analyse werden uitgevoerd door Hokkaido System Science Co., Ltd (Sapporo, Japan). Kort samengevat, cyanine-3 (Cy3) gemerkte cRNA werd bereid uit totaal RNA (0,05 ug) met een lage input Quick Amp Labeling Kit (Agilent) volgens de instructies van de fabrikant, gevolgd door RNAeasy kolomzuivering (QIAGEN, Valencia, CA) . Dye oprichting en cRNA opbrengst werden gecontroleerd met een NanoDrop ND-1000 spectrofotometer. Cy3-gelabelde cRNA (0,60 ug) werd gedurende 30 minuten in een reactievolume van 25 pl uit 1x Agilent fragmentatie buffer en 2x Agilent blokkeermiddel volgens de instructies van de fabrikant gefragmenteerd bij 60 ° C. Na afloop van de fragmentatiereactie, werd 25 gl 2x Agilent hybridisatiebuffer fragmentatie mengsel toegevoegd en gehybridiseerd aan Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression Microarray (8x60K Ver.2.0) gedurende 17 uur bij 65 ° C in een roterende Agilent hybridisatieoven. Na hybridisatie werden de microarrays gewassen gedurende 1 min bij kamertemperatuur GE Wash Buffer 1 (Agilent) en gedurende 1 min bij 37 ° C met GE wasbuffer 2 (Agilent), vervolgens gedroogd direct door korte centrifugatie. Dia's werden gescand direct na het wassen op een Agilent DNA Microarray Scanner (G2565CA) vinden via een kleur scan instelling voor 8x60K reeks dia's (Scan Area 61 × 21,6 mm, scanresolutie 3 pm, Dye kanaal voor Green PMT ingesteld op 100%). De gescande beelden werden geanalyseerd en genormaliseerd met Feature Extraction Software 10.7.3.1 (Agilent).
RNA-extractie en reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (RT-PCR)
Totaal RNA werd uit maagkanker cellijnen geëxtraheerd met behulp van Trizol reagens (Invitrogen). Vier microgram van totaal RNA werd reverse getranscribeerd met oligo dT (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA) en 200 U Superscript ™ II reverse transcriptase (Invitrogen) in een totaal volume van 20 pi. De volgende PCR paar oligonucleotideprimers voor humaan FGFR
werden bereid zoals eerder beschreven [12]. Human FGFR2c extra's: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(Voorwaarts) en 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (omgekeerde); human FGFR3b extra's: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Voorwaarts) en 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 '(omgekeerde); human FGFR3c extra's: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Voorwaarts) en 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (omgekeerde); menselijke GAPDH extra's: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(Voorwaarts) en 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (omgekeerde). Eén microliter van RT product (cDNA) werd geamplificeerd door PCR in een 50 pl reactievolume bevattende 20 pmol van de hierboven primersets, 1,25 U van Ampli-Taq DNA polymerase (Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA), en het uiteindelijke PCR-buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl2, 10 mM dithiothreïtol en 1 mM dNTP. De PCR-amplificatie werd als volgt uitgevoerd: voor FGFR
, bij 95 ° C gedurende 5 minuten eenmaal 40 cycli bij 95 ° C gedurende 30 s bij 57 ° C gedurende 30 s en bij 72 ° C gedurende 1 min; vervolgens bij 72 ° C gedurende 7 min; voor GAPDH
, bij 95 ° C gedurende 7 min eenmaal 40 cycli bij 95 ° C gedurende 30 s bij 55 ° C gedurende 1 minuut en bij 72 ° C gedurende 30 seconden; vervolgens bij 72 ° C gedurende 7 min.
real-time RT-PCR
real-time RT-PCR werd uitgevoerd met behulp 7900H Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem) zoals eerder beschreven [13]. De volgende sets van primers voor menselijke matrix metalloproteinase 2
(MMP2
), MMP3
, MMP7
, MMP9
en GAPDH
werden bereid (Extra file 1: Tabel S1) . Real-time RT-PCR-tests werden uitgevoerd met 200 ng RNA-equivalent cDNA, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) en 500 nmol /l gen-specifieke primers uitgevoerd. De PCR cycling condities waren 50 ° C gedurende 15 s en 60 ° C gedurende 60 s. De intensiteit van de fluorescente kleurstof werd bepaald, en elk van mRNA expressie werd genormaliseerd naar GAPDH
mRNA expressie.
Celproliferatie assay
AGS (4 x 10 3) en MKN28 cellen (1 × 10 4) werden in compleet medium geënt in 96 putjes microplaten. Het medium werd daarna vervangen door een met recombinant FGF9 (0-10 ng /ml). WST-1-oplossing werd toegevoegd na 72 uur incubatie, en de platen werden gedurende 1 uur geïncubeerd bij 37 ° C. De platen werden geanalyseerd met een ELISA-plaatlezer bij 450 nm met referentie golflengte bedraagt ​​600 nm.
Invasie assay
invasie assay werd uitgevoerd met behulp BioCoat Matrigel invasie kamers (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Kort samengevat, AGS cellen (1 x 10 5) of MKN28 cellen (3 x 10 5) werden uitgezaaid in het inzetstuk van het Matrigel-beklede invasie kamer (24 wells, 8 urn poriegrootte) gevuld met serum -vrij medium dat verschillende concentraties FGF9 (0-10 ng /ml). Daarna werden de cellen geïncubeerd met medium dat 10% FBS in de onderste kamer bij 37 ° C in 5% CO2. Om de effecten van FGF9 remmen, werd anti-FGF9 antilichaam (1 ug /ml) ook toegevoegd aan de bovenste kamer. Na incubatie gedurende 27 uur werden de niet-binnendringende cellen verwijderd met een wattenstaafje en de cellen die naar het onderste oppervlak van het membraan was binnengedrongen werden gefixeerd met ethanol. De binnenvallende cellen werden vervolgens gekleurd met hematoxyline en geteld met behulp van een microscoop in vijf verschillende visuele velden (vergroting x200).
Apoptoseassay
AGS (2 × 10 5) en MKN28 (2,5 x 10 5) cellen werden gezaaid in zes-well platen in routine medium voor 24 uur. De cellen werden vervolgens serum onthouden en behandeld met of zonder recombinant FGF9 (1-10 ng /ml) gedurende 48 uur. Om de effecten van FGF9 remmen, werd anti-FGF9 antilichaam (1 ug /ml) ook toegevoegd aan het kweekmedium. Na behandeling werden zowel drijvende en gehechte cellen geoogst, gewassen met PBS en gekleurd met AnnexinV-FITC en propidiumjodide (PI) met een MEBCYTO Apoptose Kit (MBL, Nagoya, Japan). Gekleurde cellen werden geanalyseerd op een FACScalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), en de verkregen gegevens werden geanalyseerd met behulp van CellQuest software (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).
Western blotanalyse
Western blot analyses werden uitgevoerd zoals eerder [14] beschreven. Kort na behandeling met of zonder reagens werden cellen gelyseerd in proteïne extractiebuffer en eiwitextract (30 ug) werd gefractioneerd door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese en overgebracht op een nitrocellulose membraan blotting. Het membraan werd geïncubeerd met een primair antilichaam en een peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam. Eiwitten werden gedetecteerd met behulp van een versterkte chemiluminescentie (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK).
Immunohistochemie
totaal 20 maagkanker weefsels werden verkregen uit monsters chirurgisch uitgesneden in Hyogo College of Medicine. Het weefselspecimen werden gefixeerd in 10% formaline-oplossing en ingebed in paraffine. Deze studie werd goedgekeurd door de Review Board van Hyogo College of Medicine, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten. De kenmerken van maagkanker patiënten toonde in aanvullende bestandsinformatie 2: Tabel S2
Immunohistochemische kleuring voor FGF9 werd uitgevoerd met een LSAB + kit met behulp van anti-FGF9 antilichaam (1:40; R &D Systems, Minneapolis, MN, USA). zoals eerder beschreven [15]. Tenslotte werden de secties geïncubeerd in 3,3'-diaminobenzide tetrahydrochloride met 0,05% H2O2 gedurende 3 min, en vervolgens tegengekleurd met Mayer's hematoxyline. De immunoreactiviteit van FGF9 evalueren, werden ten minste vijf verschillende gezichtsvelden waargenomen bij invasieve voor maagkanker laesies. Een monster werd als positief beschouwd wanneer FGF9-positieve fibroblast nesten in de visuele gebieden onderzocht werden waargenomen. &Statistieken analyse Leer Alle waarden werden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van ongepaarde tweezijdige t
-test. P
waarden kleiner dan 0,05 werden als statistisch significant geven.
Resultaten
Microarray analyse van CAF bij maagkanker weefsels
Wij geïsoleerd CAF en NGF (figuur 1A) en vergeleek het genexpressieprofiel van CAF met die van NGF via microarray analyse. Ten representatieve genen die werden opgereguleerd in CAF staan ​​in tabel 1. Van deze genen gerichte we FGF9 de meest tot expressie gebracht gen om de rol van het CAF-geproduceerde groeifactor op maagkanker cellen te onderzoeken, en in feite voordat in vitro
studies bevestigden we dat CAF cellen die veel grotere hoeveelheid dan FGF9 eiwit NGF-cellen (Figuur 1B). Bovendien bevestigden we FGF9 sterk tot expressie gebracht in fibroblasten in de stroma van de maagkanker laesie waarvan CAF werd geïsoleerd (Figuur 1C). Figuur 1 Expressie van FGF9 en zijn receptoren in cafe's en maagkanker cellen. (A) morfologie van de maag cafe's en NGF's. (B) De productie van FGF9 in de maag cafe's, NGF's en hun geconditioneerd medium (CM). (C) Expressie van FGF9 in cafe's van de maagkanker laesie. Pijlen cafe's. (D) Expressie van FGF-receptoren
verantwoordelijk voor FGF9 bij maagkanker cellijnen.
Tabel 1 vertegenwoordiger genen verschillend tot expressie in cafe's van NGF's
No. Toetreding
Symbol

naam Gene
Vouw verandering
Up-gereguleerde
NM_014333
CADM1
celadhesiemolecuul 1, transcript variant 1
273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
gb | is39c09.y1 HR85 eilandje Homo sapiens cDNA kloon IMAGE: 6.554.705 5 ', mRNA-sequentie
254,8
NM_001113207
TSTD1
Thiosulfaat sulfurtransferase (rhodanase) -achtig domein met 1, transcript variant 1
237,5
NM_000867
HTR2B
5-hydroxytryptamine (serotonine) receptor 2B
171,5
NM_001008539
SLC7A2
opgeloste carrier familie 7 (kationische aminozuur transporter, y + systeem), lid 2, transcript variant 2
142,5
NM_002010
FGF9
fibroblast groeifactor 9 (-glia activerende factor)
141,1
NM_005559
LAMA1
Laminin, alpha 1
119,0
NM_001040058
SPP1
uitgescheiden fosfoproteïne 1, transcript variant 1
116.1
A_24_P247454
A_24_P247454
Unknown
112.6
NM_014398
LAMP3
Lysosomal-associated membraaneiwit 3
111,3
stads gereguleerd
NM_001141919
XG
Xg bloedgroep (XG), transcript variant 2,
0,0035
NM_175569
XG
Xg bloedgroep (XG), transcript variant 1
0,0044
NM_000609
CXCL12
chemokine (CXC motief) ligand 12 (CXCL12), transcript variant 2
0,0071
NM_014817
TRIL
TLR4 interactor met leucine-rijke herhalingen
0,0099
NM_002839
PTPRD
Proteïne tyrosine fosfatase, het type receptor D, transcript variant 1
0,0138
NR_021485
EGFEM1P
EGF-achtige en EMI domein met 1, pseudogenen, niet-coderende RNA
0,0141
NM_198285
WDR86
WD repeat domein 86
0,0145
NM_001164000
MECOM
MDS1 en EVI1 complex locus (MECOM), transcript variant 6
0,0166
NM_004335
BST2
beenmerg stromale cel antigen 2
0,0168
ENST00000484765
XLOC_002912
Hypothetisch LOC100507661 (LOC100507661), miscRNA
0,0172
Fold change waarden werden geëvalueerd als een verhouding van genormaliseerde cafe's /genormaliseerd NGF's.
Expressie van FGFR2c Kopen en FGFR3b /c
bij maagkanker cellijnen
FGF9 is beschreven dat hoge affiniteit voor het FGFR2c isovorm en FGFR3b /c isovormen [12] blijkt. Daarom onderzochten we de expressie van deze FGFR
verschillende maagkanker lijnen middels RT-PCR. Zoals getoond in figuur 1D, expressie van FGFR2c
werd gedetecteerd in alle zeven maagkanker cellijnen, terwijl expressie van FGFR3b /c
werd gedetecteerd in zes van de zeven, behalve MKN74. Deze bevindingen suggereerden dat maagkanker cellen hebben het vermogen om te reageren op FGF9 stimulatie.
FGF9 activeert de ERK en AKT signaalwegen in maagkanker cellen
Wij onderzochten het effect van FGF9 stimulatie over mogelijke trajecten waaronder ERK en Akt in de maag kankercellijnen [16]. Expressie van zowel p-Akt en p-ERK werd dosisafhankelijk verhoogd door FGF9 stimulatie bij AGS en MKN28 cellen (Figuur 2A). De versterking bleek uit 15 minuten na FGF9 (10 ng /ml) behandeling in beide cellijnen (figuur 2B). Bovendien onderzochten we het effect van anti-FGF9 neutraliserend antilichaam op maagkanker cellen en vond dat de verhoogde expressie van p-Akt en p-ERK opgewekt door FGF9 stimulatie werd verminderd door gelijktijdige toediening van anti-FGF9 neutraliserend antilichaam (Figuur 2C). Figuur 2 Effect van FGF9 behandeling op intracellulaire signalering bij maagkanker cellen. (A) Fosforylering van Akt en ERK bij maagkanker cellen behandeld met FGF9. AGS (4 x 105) en MKN28 (4 x 105) werden gekweekt in platen met zes putjes en behandeld met verschillende concentraties FGF9 gedurende 30 min. Geëxtraheerd eiwit werd geanalyseerd door Western blotting, zoals beschreven in Materialen en Werkwijzen. (B) Tijd koersverandering in Akt en ERK fosforylering bij maagkanker cellen behandeld met FGF9. AGS en MKN28 cellen werden op dezelfde wijze behandeld met FGF9 (10 ng /ml) gedurende de aangegeven tijden. (C) Effect van anti-FGF9 neutraliserend antilichaam op FGF9 geïnduceerde Akt en ERK fosforylatie bij maagkanker cellen. AGS en MKN28 cellen werden voorbehandeld met anti-FGF9 antilichaam (Ab; 1 ug /ml) gedurende 45 min en vervolgens gestimuleerd met FGF9 (10 ng /ml) gedurende 30 min
Effect van FGF9 op celproliferatie, invasie en anti. -apoptosis bij maagkanker cellen
FGF9 Aangezien bekend is dat een mitogeen effect op sommige celtypen [17] hebben we eerst het effect van FGF9 getest op de kinetica van maagkanker cellen. Echter, we vonden geen effect van FGF9 op cel proliferatie in de AGS en MKN28 cellijnen (figuur 3A). Figuur 3 Effect van FGF9 groei en anti-apoptose van maagkanker cellen. (A) Effect van FGF9 op de groei van maagkanker cellen. (B-D) Effect van FGF9 anti-apoptose vermogen van maagkanker cellen. (B) Representatieve grafieken van FACS analyse met Annexine V-FITC kleuring. AGS cellen werden behandeld met FGF9 (10 ng /ml) en geëvalueerd zoals beschreven in Materialen en Werkwijzen. (C) veranderingen in het aantal apoptotische AGS en MKN28 cellen behandeld met FGF9. (D) Effect van anti-FGF9 neutraliserend antilichaam (Ab Neu; 1 ug /ml) op FGF9 (10 ng /ml) geïnduceerde anti-apoptose in AGS en MKN28 cellen. Alle resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD van vier monsters. Significant lager dan controle: * P Restaurant < 0,05, ** P Restaurant < 0,01. Aanzienlijk groter zijn dan de-FGF9 behandelde groep: # P Restaurant < 0,05, ## P Restaurant < 0,01 Belgique Om de mogelijke rol van FGF9 in tumor progressie verder te identificeren, we onderzocht of exogene FGF9 verleent een. anti-apoptotisch effect op maagkanker cellen. FACS analyses bleek dat het aantal annexine V-positieve cellen AGS was aanzienlijk kleiner in de met FGF9 behandelde groep dan bij de controlegroep en soortgelijke bevindingen werden MKN28 cellen (Figuur 3B en C) verkregen. Bovendien is dit effect van FGF9 werd opgeheven door gelijktijdige toediening van anti-FGF9 neutraliserend antilichaam in beide cellijnen (figuur 3D).
Bovendien we vervolgens onderzocht het effect van FGF9 op het invasieve vermogen van maagkanker cellen. Wanneer AGS cellen werden gestimuleerd met FGF9 (1-10 ng /ml), werd het aantal invasieve cellen significant verhoogd (Figuur 4A). Evenzo werd het invasieve vermogen van cellen aanzienlijk verbeterd MKN28 dosisafhankelijk door FGF9 stimulatie (Figuur 4A). Vervolgens hebben we onderzocht of deze pro-invasieve effect van FGF9 kan worden afgeschaft door het toevoegen van een neutraliserend antilichaam. In beide cellijnen na gelijktijdige toediening van FGF9 neutraliserend antilichaam (1 ug /ml), het aantal invasieve cellen was significant verminderd in vergelijking met cellen behandeld met FGF9 alleen (10 ng /ml) (Figuur 4B). Daarnaast hebben we onderzocht of FGF9 induceerde de expressie van MMP's, die een cruciale rol spelen bij de invasie van verschillende kankers. Zoals getoond in figuur 4C, FGF9 stimulatie algemeen verhoogde de expressie van MMP7
zowel AGS en MKN28 cellen. Figuur 4 Effect van FGF9 op invasie en MMP expressie van maagkanker cellen. (A) Effect van FGF9 op maagkanker cel invasie. Verandering in aantal invasieve AGS en MKN28 cellen behandeld met FGF9 werden onderzocht. Foto's die representatieve beelden van invasieve maagkanker cellen in de controle en behandelde groepen FGF9. (B) Effect van anti-FGF9 neutraliserend antilichaam (Ab Neu; 1 ug /ml) op FGF9 (10 ng /ml) geïnduceerde invasie van AGS en MKN28 cellen. (C) Effect van FGF9 op de expressie van MMP's
bij maagkanker cellen. Alle resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD van vier monsters. Significant groter dan controle: * P Restaurant < 0,05, ** P Restaurant < 0,01. Aanzienlijk lager dan de-FGF9 behandelde groep: # P Restaurant < 0,05, ## P Restaurant < 0,01
klinisch-pathologische betekenis van FGF9 expressie in de maag-kanker-geassocieerde fibroblasten
Van de 20 maagkanker. weefselmonsters onderzocht zestien (80%) was positief voor FGF9 expressie. Betrekking tot de klinische kenmerken, geen enkele parameter ─ leeftijd, geslacht, tumor plaats, weefseltype, of tumor stadium ─ een significante relatie FGF9 expressie (aanvullende bestandsinformatie 2: Tabel S2)
Bespreking
Aangenomen wordt. die tumorontwikkeling en progressie afhankelijk overspraak tussen kankercellen en hun omringende stromale cellen. Als grote populatie stroma, "geactiveerd" fibroblasten, aangeduid als cafe's, zijn voorgesteld om het ontstaan ​​van tumoren bevorderen via verschillende moleculaire signalen, en in deze studie die we FGF9
een nieuw gen dat CAF werd overexpressie in maagkanker . Accumuleren bewijs, met inbegrip van onze huidige gegevens, hebben aangetoond dat cafe's afwijken van NGF's in termen van niet alleen de morfologie, maar ook de genexpressie profielen [18,19], hoewel de onderliggende mechanismen die verantwoordelijk zijn voor deze verschillen zijn nog onduidelijk. Op basis van recente gegevens, is het verleidelijk om dat tumorcellen initiëren van een overgang van NGF's naar cafe's voor te stellen door middel van enige vorm van signalering [20], of dat cafe's afkomstig zijn van kankercellen door middel van epitheliale-mesenchymale transitie [21,22]. Interessant is algemeen aanvaard dat de FGF-familie is cruciaal voor epitheliale-mesenchymale overgang, niet alleen tijdens de ontwikkeling maar ook bij carcinogenese [9,23]. In deze studie hebben we aangetoond dat CAF een mogelijke bron van FGF9, en dat verder maagkanker cellen receptoren die reageren op FGF9 erop wijst dat FGF9 kan een potentiële mediator tussen CAF en maagkanker cellen.
Wat de mogelijke rol van FGF9 in de pathogenese van maagkanker? Aangezien FGF9 dient als mitogeen voor prostaatkanker of eierstokkanker [17,24] We onderzochten eerst de proliferatie van maagkanker cellen in de aanwezigheid van FGF9 in vitro
. Vervolgens FGF9 niet de proliferatie van zowel AGS en MKN28 maagkanker cellijnen bevorderen; echter, kunnen we de mogelijkheid dat FGF9 kunnen dienen als mitogeen voor andere vormen van maagkanker cellen omdat FGF9 bevordert de proliferatie van andere cellen maagkanker zoals AZ521 of SGC-7901 [25,26] niet uitsluiten. Anderzijds, we verduidelijkt in de onderhavige studie die FGF9 een anti-apoptotisch effect op maagkanker cellen, in overeenstemming met de resultaten van een aantal eerdere studies [26,27]. Ter ondersteuning van deze bevinding, Akt en ERK route signalering cruciaal voor anti-apoptose, werd vaak geactiveerd in beide maagkanker cellijnen. Bovendien werd FGF9-geïnduceerde Akt en /of ERK fosforylatie en de resulterende celinvasie opgeheven door het blokkeren FGF9 stimulatie, wat suggereert dat FGF9 minstens werkt als een anti-apoptotische factor.
We onderzochten ook of FGF9 bevordert het invasieve vermogen van maag kankercellen. In vitro studies toonden aan dat
FGF9 behandeling steeg het aantal binnenvallende maagkanker cellen, terwijl deze toegenomen invasief vermogen werd onderdrukt door het toevoegen van FGF9 neutraliserende antilichamen. Hoewel het onduidelijk hoe FGF9 bevordert de invasie van maagkanker cellen, afbraak van de extracellulaire matrix is ​​een belangrijk onderdeel van dit proces [28]. In dit verband wordt aanvaard dat MMP's spelen een centrale rol in een dergelijke cel gedrag en het bevorderen van de invasieve capaciteit van verscheidene maligniteiten [29]. Daarom hebben we getest op MMP's die zijn gekoppeld aan FGF9 stimulatie en vonden dat MMP7 potentieel betrokken was. Interessant is dat recente studies het belang van MMP7 bij maagkanker progressie benadrukt, aangezien MMP7 heeft het potentieel om niet alleen de extracellulaire matrix afbreken maar ook een anti-apoptotisch effect op kankercellen [30-32] verlenen. Dienovereenkomstig, in een toekomstige studie, zijn we van plan om zich te concentreren op de FGF /MMP7 as in het kader van maagkanker cel invasie.
Conclusie
Samenvattend, hebben we aangetoond dat de maag cafe's verschilt van hun corresponderende NGF's op het gebied van hun genexpressie profielen, en stellen dat FGF9 is een potentieel molecuul dat overspraak tussen cafe's en maagkanker cellen bemiddelt. Bovendien hebben we verduidelijkt dat FGF bevordert de anti-apoptose en invasieve vermogen van maagkanker cellen. Samengevat, onze gegevens suggereren dat FGF9 een mogelijke mediator uitgescheiden uit met kanker geassocieerde fibroblasten dat de anti-apoptose en invasieve vermogen van maagkanker cellen bevordert.
merkt
Chao Zon en Hirokazu Fukui eveneens bijgedragen aan dit werk.
Afkortingen
FGF:
fibroblast groeifactor
MMP:
Matrix metalloproteinase
ERK :
extracellulaire-signaal gereguleerd proteïne kinase
CAF:
-kanker geassocieerd fibroblast
verklaringen
Dankwoord
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies-in-hulp voor Wetenschappelijk Onderzoek van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie, Japan (23591949 naar MS, 25460466 tot SK en 26460953 naar HF). Dit werk werd ook gesteund voor een deel door Grant-in-Aid voor onderzoekers, Hyogo College of Medicine en gesteund programma voor de Strategic Research Foundation bij Private Universiteiten (MS). Ondernemingen De auteurs danken Noriko Kamiya (Afdeling Maag-, Department interne Geneeskunde) en Yuko Yasui (Department of Surgery) voor hun technische bijstand en waarderen ook Nobuyuki Adachi en Ryota Shinozaki (HCM Joint-Use Onderzoeksfaciliteiten) voor technische bijdragen
Extra bestanden
Extra file 1:. Tabel S1 . Primers voor real-time RT-PCR analyse. Extra file 2: Tabel S2. Relatie tussen clinicopathologische functies en stromale FGF9 expressie bij patiënten met maagkanker. Tegenstrijdige belangen Ondernemingen De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen. Bijdragen
Authors '
CS en HF ontworpen en uitgevoerd alle experimenten, geanalyseerde gegevens, en schreef het manuscript. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• De diagnostische uitdaging van de longtumor trombotische microangiopathie als een presentatie voor gemetastaseerde maagkanker: een case report en overzicht van de literatuur
• Xpert MTB /RIF assay kan worden gebruikt gearchiveerde maagaspiraat en sputum monsters voor gevoelige diagnose van tuberculose pediatrische