FGF9 à partir de fibroblastes associés au cancer est un médiateur possible d'invasion et anti-apoptose de gastrique cells

cancer FGF9 à partir de fibroblastes associés au cancer est un médiateur possible d'invasion et anti-apoptose des cellules cancéreuses gastriques
Résumé
fond
fibroblastes associés au cancer (CEFA), qui résident dans les cellules tumorales, sont proposées pour jouer un rôle central dans la progression tumorale. Ici nous avons effectué des analyses de micropuce pour comparer les profils d'expression génique entre CAFs et les fibroblastes gastriques non cancéreuses (NGF) à partir d'un patient ayant un cancer gastrique et constaté que le facteur de croissance des fibroblastes 9
(FGF9
) a été un facteur de croissance roman surexprimé dans CAFs. Nous avons ensuite examiné les effets biologiques du FGF9 lors de la progression du cancer gastrique. L'expression de
Méthode de FGF9 dans les EFC et NGF, ainsi que leurs produits sécrétés ont été examinés par Western Blot. Les effets du FGF9 sur AGS et des cellules de cancer de l'estomac MKN28 en termes de prolifération, l'invasion et anti-apoptose a été évaluée par dosage WST-1, le dosage de la chambre d'invasion et FACS, respectivement. Le FGF9: Résultats de plus, la signalisation intracellulaire par lequel FGF9 exerce ses rôles biologiques a été examiné in vitro.
a été fortement exprimé dans CAFs en comparaison avec les NGF, étant compatible avec les données de microréseau indiquant que FGF9 était un roman de croissance facteur surexprimé dans les EFC. Traitement avec FGF9 favorisé l'invasion et l'anti-apoptose par l'activation des voies de signalisation Akt et de ERK dans les cellules AGS et MKN28, alors que ces effets ont été atténués par un traitement avec un anti-anticorps neutralisant FGF9. Conclusions de En outre, le traitement FGF9 améliorée de manière significative l'expression de la matrice métalloprotéinase 7 (MMP7) dans les deux lignées cellulaires.
FGF9 est un médiateur possible sécrétée par CAFs qui favorise l'anti-apoptose et de la capacité invasive des cellules de cancer gastrique. fibroblaste FGF cancer-associé Invasion Anti-apoptose ERK Akt cancer gastrique Contexte de
Mots-clés
La formation de lésions cancéreuses est intimement liée à leur microenvironnement unique. Progression est étroitement corrélée à la capacité des cellules cancéreuses à recruter et à activer les cellules stromales environnantes, puis les exploiter [1]. cellules stromales Cancer-entourant, comme les fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires, peuvent orchestrer la tumorigenèse et la métastase grâce à l'interaction de cellule à cellule et /ou la production de facteurs de croissance solubles /cytokines /chimiokines [1-3]. Dans ce contexte, les fibroblastes dans les lésions cancéreuses sont connus comme les fibroblastes associés au cancer (CAF) et ont reçu beaucoup d'attention en ce qui concerne leur rôle dans la progression tumorale [4,5]. Bien que les CAF sont connues pour être largement différente de celle des fibroblastes normaux dans les tissus non-néoplasiques, en fonction de leur profil de gènes, le mécanisme par lequel CAFs favorisent la progression de la tumeur est peu claire. Par conséquent, nous avons comparé les profils d'expression génique de CAFs, en se concentrant en particulier sur les facteurs de croissance /cytokines /chimiokines, avec celles des fibroblastes gastriques non cancéreuses (NGF) en utilisant un dosage de microréseau, et ensuite isolé le facteur de croissance des fibroblastes 9
(FGF9
) en tant que nouveau gène qui a été surexprimé dans les EFC dans le cancer gastrique.
FGF9, une protéine sécrétoire de la famille des FGF, serait exprimée dans les cellules stromales, y compris les fibroblastes [6-8]. D'une manière générale, la signalisation FGF se produit par l'intermédiaire FGFs récepteurs (FGFR) pour réguler une variété de comportement biologique des cellules, y compris la prolifération, la différenciation, la survie et la motilité [9], et l'expression du FGF9, FGFR2c, FGFR3b et FGFR3c a été détectée dans l'estomac et du côlon cancers [10]. Ainsi, comme d'autres protéines de la famille FGF, FGF9 peut jouer un rôle central dans l'interaction entre les cellules cancéreuses et leurs cellules stromales environnantes, et il est à noter que FGF9 est fortement exprimée dans les EFC dans le cancer gastrique. Dans la présente étude, nous avons projeté des différences dans l'expression des gènes entre CAFs et NGF d'un patient avec un cancer gastrique. Nous avons examiné l'effet de FGF9 sur la prolifération, l'invasion et anti-apoptose des cellules de cancer gastrique, et d'ailleurs clarifié la signalisation intracellulaire par lequel FGF9 exerce ses effets biologiques sur les cellules de cancer gastrique. De méthodes Réactifs et culture cellulaire
FGF9 recombinant humain et de l'anticorps neutralisant anti-FGF9 humain ont été achetés auprès de R & D Systems (Minneapolis, MN, États-Unis). Anti-extracellulaire de la protéine kinase régulée par un signal (ERK), anti-phospho-spécifique ERK (p-ERK), anti-Akt, anti-phospho-spécifique Akt (p-Akt; Ser473) anticorps, et anti-β-actine étaient acheté auprès de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)
Les cellulaires de cancer gastrique lignes AGS a été cultivée dans F-12 du milieu de Ham (Sigma, Aurora, Ohio, USA) avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS;. Biowest, Nuaillé, France) dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec une atmosphère de 5% de CO 2. De même, MKN28 a été cultivée dans du milieu RPMI 1640 avec 10% de sérum bovin fœtal, et cinq autres lignées cellulaires de cancer gastrique MKN1, MKN 45, MKN74, GCIY et KATOIII ont été maintenues comme décrit précédemment [11].
Isolement et culture de fibroblastes gastriques humains
cancer gastrique (adénocarcinome peu différencié) les échantillons humains ont été obtenus à partir d'un patient qui a subi une gastrectomie à Hyogo College of Hospital Medicine en 2012. fibroblastes associés au cancer (CAFs) ont été préparés à partir de la partie cancéreuse dans l'estomac. fibroblastes gastriques non-cancéreuses (NGF) ont été préparés à partir de la partie non-cancéreuse avec gastrite atrophique au moins 50 mm loin de la tumeur dans l'estomac. Les échantillons de tissus ont été coupés du tissu adipeux et nécrotique, hachée avec scalpels et lavé dans du PBS contenant un réactif antibiotique-antimycosique (Anti-Anti®, GIBCO). Les morceaux de tissu ont été transférés dans une microplaque à 12 puits (IWAKI, Tokyo, Japon) à un fragment /puits. Les cellules ont été cultivées dans du milieu DMEM (GIBCO, Grand Island, NY, USA) avec 10% inactivé par la chaleur FBS à 37 ° C dans une atmosphère de 5% de CO2. Les fibroblastes initialement poussaient dans une monocouche ont été recueillies, transférées dans un autre plat et utilisé pour des expériences dans le 10e passage. Ces études ont été réalisées avec l'approbation du Conseil de Hyogo College of Medicine Review, et le consentement éclairé a été obtenu auprès du patient.
Analyse de Microarray
Utilisation réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), l'ARN total a été extrait de trois séries de CAFs et NGF cultivées. l'étiquetage des ADNc, des hybridations, la numérisation et l'analyse des données ont été effectuées par Hokkaido Science System Co., Ltd (Sapporo, Japon). En bref, la cyanine 3 (Cy3), marqué à l'ARNc a été préparé à partir d'ARN total (0,05 pg) en utilisant une faible entrée Amp rapide Labeling Kit (Agilent) conformément aux instructions du fabricant, suivi de RNAeasy purification sur colonne (Qiagen, Valencia, CA) . Dye incorporation et le rendement ARNc ont été contrôlés avec un NanoDrop ND-1000 spectrophotomètre. ARNc marqué au Cy3 (0,60 ug) a été fragmentée à 60 ° C pendant 30 min dans un volume réactionnel de 25 ul contenant du tampon Agilent 1x et 2x de fragmentation Agilent agent de blocage conformément aux instructions du fabricant. A l'issue de la réaction de fragmentation, 25 ul de tampon d'hybridation 2x Agilent a été ajouté au mélange de fragmentation et hybridées Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression microréseau (8x60K Ver.2.0) pendant 17 h à 65 ° C dans une rotative Agilent four à hybridation. Après hybridation, les microarrays ont été lavés pendant 1 min à température ambiante avec GE Wash Buffer 1 (Agilent) et pendant 1 min à 37 ° C avec un tampon GE Wash 2 (Agilent), puis séchées immédiatement par une brève centrifugation. Les lames ont été scannés immédiatement après le lavage sur un Agilent micropuce à ADN Scanner (G2565CA) à l'aide d'un balayage de couleur réglage pour les diapositives de tableau 8x60K (Zone de numérisation 61 x 21,6 mm, Résolution de numérisation 3 pm, canal Dye Green PMT réglé à 100%). Les images numérisées ont été analysées et normalisées par extraction d'entité logicielle 10.7.3.1 (Agilent).
Extraction de l'ARN et transcription inverse en chaîne par polymérase (RT-PCR)
L'ARN total a été extrait à partir de lignées cellulaires de cancer gastrique en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen). Quatre microgramme de l'ARN total a été une transcription inverse en utilisant oligo dT (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, USA) et 200 U de Superscript ™ II transcriptase inverse (Invitrogen) dans un volume total de 20 pi. Pour la PCR ci-dessous, des paires d'amorces d'oligonucléotides pour l'homme
FGFR ont été préparées comme décrit précédemment [12]. FGFR2c humain
: 5'-TGGTCGGAGGAGACGTAGAG-3 '(Forward) et 5'-AAAGTTACATTCCGAATATAGAGAACC-3' (marche arrière); FGFR3b humaine
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Forward) et 5' -GTGAACGCTCAGCCAAAAG-3 '(marche arrière); FGFR3c humaine
: 5'-GGAGTTCCACTGCAAGGTGT-3 '(Forward) et 5'-AAGCGGGAGATCTTGTGC-3' (marche arrière); GAPDH humaine
: 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(Forward) et 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGT-3' (marche arrière). Un microlitre du produit de RT (ADNc) a été amplifié par PCR dans un volume réactionnel de 50 pi contenant 20 pmoles des ensembles ci-dessus des amorces, 1,25 U d'Ampli Taq ADN polymerase (Applied Biosystems, Foster City, Californie., États-Unis), et le tampon de PCR final: 20 mM de Tris-HCl (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, dithiothréitol 10 mM et 1 mM dNTP. L'amplification par PCR a été effectuée comme suit: pour le FGFR
, à 95 ° C pendant 5 minutes une fois; 40 cycles à 95 ° C pendant 30 s, à 57 ° C pendant 30 s et à 72 ° C pendant 1 min; puis à 72 ° C pendant 7 min; pour GAPDH
, à 95 ° C pendant 7 minutes une fois; 40 cycles à 95 ° C pendant 30 s, à 55 ° C pendant 1 min et à 72 ° C pendant 30 secondes; puis à 72 ° C pendant 7 min.
temps réel RT-PCR en temps réel
-RT-PCR a été réalisée en utilisant le système de 7900H rapide Real-Time PCR (Applied Biosystems) tel que décrit précédemment [13]. Les ensembles d'amorces pour métalloprotéinase de matrice humaine 2
(MMP2
), MMP3
, MMP7
, MMP9
et GAPDH
ont été préparés (fichiers supplémentaires 1: Tableau S1) . En temps réel des tests de RT-PCR ont été réalisées avec 200 ng d'ADNc de l'ARN équivalent, SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), et 500 nmol /l gène d'amorces spécifiques. Les conditions de cycle de PCR étaient 50 ° C pendant 15 secondes, et 60 ° C pendant 60 s. L'intensité du colorant fluorescent a été déterminé et chacun des niveaux d'expression d'ARNm a été normalisé à la GAPDH de niveaux d'expression d'ARNm.
Test de prolifération cellulaire
AGS (4 x 10 3) et des cellules MKN28 (1 × 10 4) ont été ensemencées dans un milieu complet en microplaques de 96 puits. Le milieu a ensuite été remplacé par celui contenant le FGF9 recombinante (0-10 ng /ml). WST-1 solution a été ajoutée après 72 h d'incubation, et les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant 1 h. Les plaques ont été analysées en utilisant un lecteur de plaque ELISA à 450 nm avec la longueur d'onde de référence fixée à 600 nm.
Test d'invasion cellulaire
test d'invasion des cellules a été réalisée en utilisant des chambres d'invasion BioCoat Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) selon le protocole du fabricant. En bref, les cellules AGS (1 x 10 5) ou des cellules MKN28 (3 x 10 5) ont été ensemencées dans l'insert de la chambre d'invasion de Matrigel revêtue (24 puits, 8 um de taille des pores) rempli de sérum milieu exempt contenant différentes concentrations de FGF9 (0-10 ng /ml). Ensuite, les cellules ont été incubées avec un milieu contenant 10% de FBS dans la chambre inférieure à 37 ° C dans 5% de CO2. Pour inhiber les effets de FGF9, l'anticorps anti-FGF9 (1 ​​pg /ml) a également été ajouté à la chambre supérieure. Après incubation pendant 27 h, les cellules non-envahissant ont été éliminés en utilisant un coton-tige et les cellules qui avaient envahi dans la surface inférieure de la membrane ont été fixées avec de l'éthanol. Les cellules ont ensuite été envahissants colorées à l'hématoxyline et comptées en utilisant un microscope à cinq champs visuels différents (grossissement, x200). Le plus Apoptose dosage
AGS (2 x 10 5) et MKN28 (2,5 x 10 5), les cellules ont été ensemencées dans des plaques à six puits dans du milieu de routine pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été privées de sérum et traitées avec ou sans FGF9 recombinante (1-10 ng /ml) pendant 48 heures. Pour inhiber les effets de FGF9, l'anticorps anti-FGF9 (1 ​​pg /ml) a également été ajouté au milieu de culture. Après le traitement, les cellules flottantes ont été recueillies et fixées, lavées avec du PBS et colorées avec du FITC AnnexinV et l'iodure de propidium (PI) en utilisant une trousse MEBCYTO Apoptose (MBL, Nagoya, Japon). Les cellules colorées ont été analysées sur un cytomètre de flux FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA), et les données obtenues ont été analysées en utilisant un logiciel CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).
analyse par Western blot
analyses Western blot ont été effectuées comme décrit précédemment [14]. En bref, après le traitement avec ou sans réactif, les cellules ont été lysées dans un tampon d'extraction de protéines et de l'extrait de protéines (30 pg) a été fractionné par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl de sodium et on les transfère sur une membrane de nitrocellulose Blot. La membrane a été incubée avec un anticorps primaire, puis avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase. Les protéines ont été détectées à l'aide d'un système de chimioluminescence amélioré (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Royaume-Uni).
Immunohistochimie
Un total de 20 cancers gastriques tissus ont été obtenus à partir d'échantillons réséqués chirurgicalement à Hyogo College of Medicine. Les échantillons de tissu ont été fixées dans une solution de formol à 10% et inclus dans de la paraffine. Cette étude a été approuvée par le Conseil de Hyogo College of Medicine Review, et le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients. Les caractéristiques des patients atteints de cancer gastrique ont été montré dans le fichier supplémentaires 2: Tableau S2
coloration immunohistochimique pour FGF9 a été réalisée avec un LSAB + kit en utilisant un anticorps anti-FGF9 (1:40; R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). comme décrit précédemment [15]. Enfin, les coupes ont été incubées dans du tétrachlorhydrate de 3,3'-diaminobenzide avec 0,05% de H2O2 pendant 3 min, puis contre-colorées avec de l'hématoxyline de Mayer. Pour évaluer la réactivité immunologique du FGF9, au moins cinq champs visuels différents ont été observés à l'avant invasif des lésions cancéreuses gastriques. Un spécimen a été considéré comme positif lorsque les nids fibroblastiques FGF9 positifs ont été observés dans les champs visuels examinés
. Analyse de Statistique
Toutes les valeurs sont exprimées par la moyenne ± écart-type. Les données ont été analysées à l'aide apparié t bilatéral
-test. Les valeurs P
inférieures à 0,05 ont été considérées pour indiquer la signification statistique. Résultats de
microarray analyses de CAFs dans les tissus de cancer gastrique
Nous avons isolé CAFs et NGF (figure 1A) et ont comparé le profil d'expression génique de CAFs avec celle de NGF en utilisant dosage des microréseaux. Dix gènes représentatifs qui sont régulés positivement dans les EFC sont énumérées dans le tableau 1. Parmi ces gènes, nous avons ciblé FGF9 que le gène le plus fortement exprimé pour examiner le rôle de ce facteur de croissance CAF produite sur des cellules de cancer gastrique et, en fait, avant de commencer in vitro
études, nous avons confirmé que les cellules CAF ont produit beaucoup plus grande quantité de protéine que les cellules FGF9 NGF (figure 1B). Par ailleurs, nous avons confirmé que le FGF9 est fortement exprimé dans les fibroblastes du stroma de la lésion gastrique du cancer à partir de laquelle la CAF a été isolé (figure 1C). Figure 1: Expression du FGF9 et ses récepteurs dans les EFC et les cellules cancéreuses gastriques. (A) Morphologie des CAFs et NGF gastriques. (B) Production de FGF9 dans les EFC gastriques, NGF et leur milieu conditionné (CM). (C) Expression du FGF9 dans CAFs de la lésion du cancer gastrique. Les flèches indiquant CAFs. (D) L'expression des récepteurs de FGF
responsables de FGF9 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique.
Tableau 1 gènes représentatifs exprimés de manière différentielle dans les EFC de n ° d'accession de NGF
Symbole

nom de Gene
Pliez changement
Up réglementé
NM_014333
CADM1
cellulaire molécule d'adhésion 1, variante de transcription 1
273,6
CB178477
XLOC_l2_007424
gb | is39c09.y1 HR85 îlot Homo sapiens cDNA clone IMAGE: 6554705 5 ', la séquence d'ARNm
254,8
NM_001113207
TSTD1
thiosulfate sulfurtransferase (rhodanese) -like domaine contenant 1, transcription variante 1
237,5
NM_000867
HTR2B
5-hydroxytryptamine (sérotonine) récepteur 2B
171,5
NM_001008539
soluté famille porteuse 7 (transporteur d'acides aminés cationiques de SLC7A2, y système +), membre 2, variante de transcription 2
142,5
NM_002010
FGF9
Fibroblast facteur de croissance 9 (facteur de glie activation)
141,1
NM_005559
LAMA1
laminine, alpha 1
119,0
NM_001040058
SPP1
sécrétée phosphoprotéine 1, variante de transcription 1
116.1
A_24_P247454
A_24_P247454
Unknown
112.6
NM_014398
LAMP3
Lysosomal-associated protéine membranaire 3
111,3
Bas-réglementé
NM_001141919
XG
Xg groupe sanguin (XG), transcription variante 2,
0,0035
NM_175569
XG
Xg groupe sanguin (XG), variante de transcription 1
0,0044
NM_000609
CXCL12
chimiokine (CXC motif) ligand 12 (CXCL12), variante de transcription 2
0,0071
NM_014817
TRIL
TLR4 interacteur avec des répétitions riches en leucine
0,0099
NM_002839
protéine tyrosine phosphatase de de PTPRD, type de récepteur D, variante de transcription 1
0,0138
NR_021485
EGFEM1P
domaine EGF-like et EMI contenant 1, pseudogène, non codant le domaine 0,0141
NM_198285
WDR86
WD répétée de l'ARN 86
0,0145
NM_001164000
MECOM
MDS1 et EVI1 locus complexe (MECOM), variante de la transcription 6
antigène de cellules stromales de la moelle 0,0166
NM_004335
BST2
Bone 2
0,0168
ENST00000484765
XLOC_002912
hypothétique LOC100507661 (LOC100507661), miscRNA
0,0172
valeurs de changement Fold ont été évaluées en tant que rapport des CAFs normalisés /NGF normalisés
. L'expression de FGFR2c
et FGFR3b /c
dans des lignées cellulaires de cancer gastrique
FGF9 a été rapporté pour montrer une forte affinité pour l'isoforme FGFR2c et FGFR3b /c isoformes [12]. Par conséquent, nous avons examiné l'expression de ces FGFR
dans diverses lignées de cancer gastrique à l'aide de RT-PCR. Comme on le voit sur la figure 1D, l'expression de FGFR2c
a été détectée dans toutes les sept lignées cellulaires de cancer de l'estomac, alors que l'expression de FGFR3b /c
a été détectée dans six des sept, à l'exception des MKN74. Ces résultats suggèrent que les cellules de cancer gastrique ont la capacité de répondre à une stimulation de FGF9.
FGF9 active les ERK et AKT les voies de signalisation dans les cellules de cancer gastrique
Nous avons étudié l'effet de la stimulation de FGF9 sur les voies possibles, y compris ERK et Akt dans l'estomac des lignées cellulaires de cancer [16]. Expression à la fois de p-Akt et le p-ERK était dépendante de la dose augmentée par la stimulation FGF9 dans les cellules AGS et MKN28 (figure 2A). L'amélioration était évidente à partir de 15 minutes après le FGF9 (10 ng /mL) de traitement dans les deux lignées cellulaires (figure 2B). En outre, nous avons examiné l'effet de l'anti-FGF9 anticorps neutralisant sur les cellules cancéreuses gastriques et on a trouvé que l'augmentation de l'expression de la p-Akt et le p-ERK induite par la stimulation du FGF9 a été atténuée par l'administration concomitante d'anticorps anti-FGF9 anticorps neutralisant (figure 2C). Figure 2 Effet du traitement sur le FGF9 la signalisation intracellulaire dans les cellules cancéreuses gastriques. (A) La phosphorylation de Akt et de ERK dans les cellules cancéreuses gastriques traitées avec FGF9. AGS (4 x 105) et MKN28 (4 x 105) ont été cultivées dans des plaques à six puits et traitées avec diverses concentrations de FGF9 pendant 30 min. protéine extraite a été analysée par transfert de Western, comme décrit dans Matériels et Méthodes. (B) Temps changement de cap dans Akt et la phosphorylation de ERK dans les cellules de cancer gastrique traités avec FGF9. les cellules AGS et MKN28 ont été traités de façon similaire avec FGF9 (10 ng /ml) pendant les temps indiqués. (C) Effet des anticorps anti-FGF9 anticorps neutralisant induit par le FGF9-Akt et la phosphorylation de ERK dans les cellules cancéreuses gastriques. les cellules AGS et MKN28 ont été prétraitées avec un anticorps anti-FGF9 (Ab; 1 pg /ml) pendant 45 min, puis stimulées avec FGF9 (10 ng /ml) pendant 30 min
Effet du FGF9 sur la prolifération cellulaire, l'invasion et anti. -apoptosis dans les cellules cancéreuses gastriques
depuis le FGF9 est connu pour avoir un effet mitogene sur certains types de cellules [17], nous avons testé l'effet du premier FGF9 sur la cinétique de cellules cancéreuses gastriques de croissance. Cependant, nous avons trouvé aucun effet du FGF9 sur la prolifération des cellules AGS et des lignées de cellules MKN28 (figure 3A). Figure 3: Effet du FGF9 pour la croissance et l'anti-apoptose des cellules cancéreuses gastriques. (A) Effet du FGF9 sur la croissance des cellules cancéreuses gastriques. (B-D) Effet du FGF9 sur la capacité anti-apoptose des cellules cancéreuses gastriques. (B) des graphiques représentatifs de l'analyse FACS en utilisant Annexin V-FITC coloration. les cellules AGS ont été traitées avec FGF9 (10 ng /ml) et évalués comme décrit dans Matériels et Méthodes. (C) Les variations du nombre d'AGS apoptotiques et les cellules MKN28 traitées avec FGF9. (D) Effet des anticorps anti-FGF9 anticorps neutralisant (Neu Ac; 1 pg /ml) sur le FGF9 (10 ng /ml) induite par l'anti-apoptose dans les cellules AGS et MKN28. Tous les résultats sont exprimés par la moyenne ± écart-type de quatre échantillons. Significativement plus faible que le contrôle: * P
< 0,05, ** P
< 0,01. Significativement supérieur au FGF9-groupe traité: # P
< 0,05, ## P
< 0,01 Comment faire pour mieux identifier le rôle éventuel de FGF9 dans la progression tumorale, nous avons examiné si FGF9 exogène confère un. l'effet anti-apoptotique sur les cellules cancéreuses gastriques. Les analyses FACS a révélé que le nombre de cellules AGS V-positives annexine était significativement plus faible dans le groupe traité par le FGF9 que dans le groupe témoin, et des résultats similaires ont été obtenus dans des cellules MKN28 (figure 3B et C). En outre, cet effet de FGF9 a été supprimée par l'administration concomitante d'anti-FGF9 anticorps neutralisant dans les deux lignées cellulaires (figure 3D).
En outre, nous avons ensuite examiné l'effet du FGF9 sur la capacité invasive des cellules cancéreuses gastriques. Lorsque les cellules ont été stimulées avec AGS FGF9 (1-10 ng /ml), le nombre de cellules invasives a augmenté de manière significative (figure 4A). De même, la capacité invasive des cellules MKN28 a été significativement améliorée dose-dépendante par la stimulation FGF9 (figures 4A). Nous avons ensuite examiné si cet effet pro-invasive de FGF9 pourrait être abolie par l'ajout d'un anticorps neutralisant. Dans les deux lignées cellulaires, à la suite de l'administration concomitante d'anticorps neutralisant le FGF9 (1 ​​pg /ml), le nombre de cellules invasives a été significativement diminuée par comparaison avec les cellules traitées avec le FGF9 seul (10 ng /ml) (figure 4B). En outre, nous avons examiné si FGF9 induit l'expression de MMP, qui jouent un rôle central dans l'invasion de divers cancers. Comme on le voit sur la figure 4C, la stimulation FGF9 généralement amélioré l'expression de MMP7
dans les cellules AGS et MKN28. Figure 4: Effet du FGF9 sur l'invasion et l'expression de MMP cellules cancéreuses gastriques. (A) Effet du FGF9 gastrique sur l'invasion des cellules cancéreuses. Évolution du nombre d'AGS invasives et les cellules MKN28 traitées avec FGF9 ont été examinés. Photographies montrant des images représentatives de cellules cancéreuses gastriques envahissantes dans le contrôle et les groupes FGF9 traités. (B) Effet anti-FGF9 anticorps neutralisant (Neu Ac; 1 pg /ml) sur le FGF9 (10 ng /ml) induite par l'invasion des cellules AGS et MKN28. (C) Effet du FGF9 sur l'expression des MMPs
dans les cellules cancéreuses gastriques. Tous les résultats sont exprimés par la moyenne ± écart-type de quatre échantillons. Significativement plus de contrôle: * P
< 0,05, ** P
< 0,01. Significativement plus faible que le FGF9-groupe traité: # P
< 0,05, ## P
< 0,01
signification clinicopathologique d'expression de FGF9 dans les fibroblastes associés au cancer gastrique
Du cancer gastrique 20. des échantillons de tissus examinés, seize (80%) était positif pour l'expression de FGF9. En ce qui concerne les caractéristiques clinico, aucun des paramètres ─ âge, le sexe, la localisation de la tumeur, le type histologique, ou stade de la tumeur ─ avait une relation significative à l'expression de FGF9 (fichier supplémentaires 2: Tableau S2) Rapport
Il de le croit. que le développement et la progression tumorale dépendent de la diaphonie entre les cellules cancéreuses et leurs cellules stromales environnantes. Comme une population importante de stroma, fibroblastes "activés", appelés CAFs, ont été suggérées pour promouvoir la tumorigenèse en utilisant différents signaux moléculaires, et dans la présente étude, nous avons isolé FGF9
comme un nouveau gène qui a été surexprimé dans les EFC dans le cancer gastrique . L'accumulation des données, y compris nos données actuelles, ont montré que CAFs diffèrent de NGF en termes de non seulement la morphologie, mais aussi des profils d'expression génique [18,19], bien que les mécanismes sous-jacents responsables de ces différences sont encore peu claires. Sur la base des données récentes, il est tentant de proposer que les cellules tumorales lancer un commutateur de NGF à CAFs par une forme de signalisation [20] ou que CAFs proviennent de cellules cancéreuses par épithéliale-mésenchymateuse transition [21,22]. Fait intéressant, il est largement admis que la famille de FGF est crucial pour la transition épithéliale-mésenchymateuse, non seulement au cours du développement, mais aussi dans la carcinogenèse [9,23]. Dans la présente étude, nous avons montré que CAFs sont une source possible de FGF9, et que les cellules cancéreuses en outre gastriques ont des récepteurs qui sont sensibles à FGF9, suggérant que FGF9 peut être un médiateur potentiel entre CAFs et les cellules de cancer gastrique.
Qu'est-ce que le rôle possible du FGF9 dans la pathogenèse du cancer de l'estomac? Etant donné que le FGF9 sert mitogene pour la prostate ou le cancer de l'ovaire [17,24], nous avons d'abord examiné la prolifération des cellules cancéreuses gastriques en présence du FGF9
in vitro. Par la suite, le FGF9 n'a pas favorisé la prolifération des deux AGS et MKN28 lignées cellulaires de cancer gastrique; cependant, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que FGF9 peut servir de mitogène pour d'autres types de cellules de cancer gastrique parce FGF9 favorise la prolifération d'autres cellules de cancer gastrique tels que AZ521 ou SGC-7901 [25,26]. D'autre part, nous avons clarifié dans la présente étude que FGF9 a un effet anti-apoptotique sur les cellules de cancer gastrique, en accord avec les conclusions de plusieurs études antérieures [26,27]. À l'appui de cette constatation, Akt et de ERK signalisation de la voie, cruciale pour anti-apoptose, a été fréquemment activées dans les deux lignées cellulaires de cancer gastrique. En outre, Akt et /ou la phosphorylation de ERK et la cellule résultante invasion induite par le FGF9-a été abolie en bloquant la stimulation FGF9, suggérant que FGF9 au moins agit comme un facteur anti-apoptotique.
Nous avons également examiné si FGF9 favorise la capacité invasive de l'estomac cellules cancéreuses. Des études in vitro ont démontré que
traitement FGF9 augmenté le nombre d'envahir les cellules de cancer de l'estomac, alors que cette augmentation de la capacité invasive a été supprimée par l'addition d'anticorps neutralisant le FGF9. Bien qu'il soit difficile de savoir comment FGF9 favorise l'invasion des cellules cancéreuses gastriques, la dégradation de la matrice extracellulaire est une partie importante de ce processus [28]. Dans ce contexte, il est admis que les MMP jouent un rôle central dans ce type de comportement cellulaire et favorisent la capacité invasive de diverses tumeurs malignes [29]. Par conséquent, nous avons projeté pour MMP qui sont liés à la stimulation de FGF9 et a constaté que MMP7 était potentiellement impliqué. Fait intéressant, des études récentes ont mis l'accent sur l'importance de MMP7 dans la progression du cancer de l'estomac, puisque MMP7 a le potentiel de dégrader non seulement la matrice extracellulaire, mais confère également un effet anti-apoptotique sur les cellules cancéreuses [30-32]. En conséquence, dans une étude future, nous avons l'intention de se concentrer sur l'axe FGF /MMP7 dans le contexte de l'estomac invasion des cellules cancéreuses.
Conclusion
En résumé, nous avons montré que CAFs gastriques diffèrent de leurs NGF correspondantes en termes de leurs profils d'expression génique, et proposent que le FGF9 potentiel est une molécule qui induit la diaphonie entre les CAF et les cellules cancéreuses gastriques. De plus, nous avons précisé que le FGF favorise l'anti-apoptose et de la capacité invasive des cellules cancéreuses gastriques. Pris ensemble, nos données suggèrent que FGF9 est un médiateur possible sécrétée à partir de fibroblastes associés au cancer qui favorise l'anti-apoptose et de la capacité invasive des cellules de cancer gastrique.
Chao Sun Notes et Hirokazu Fukui a contribué également à ce travail.
abréviations
FGF:
Fibroblast facteur de croissance
MMP:
métalloprotéinase matricielle
ERK :
extracellulaires protéine kinase régulée par un signal
CAF:
fibroblaste cancer associé
Déclarations Remerciements
Ce travail a été soutenu en partie par des subventions-en-aide pour la recherche scientifique du Ministère de l'Education, Culture, sports, science et technologie, Japon (23591949 à MS, 25460466 à SK et 26460953 à HF). Ce travail a également été soutenu en partie par Grant-in-Aid pour les chercheurs, Hyogo College of Medicine et le programme pris en charge pour la Fondation pour la recherche stratégique dans les universités privées (à MS).
Les auteurs remercient Noriko Kamiya (Division de gastro-entérologie, Département de médecine interne) et Yuko Yasui (Département de chirurgie) pour leur assistance technique et aussi apprécier Nobuyuki Adachi et Ryota Shinozaki (installations d'utilisation conjointe de recherche HCM) pour les contributions techniques fichiers
supplémentaires
fichiers supplémentaires 1:. Tableau S1 . Des amorces pour l'analyse en temps réel RT-PCR. Fichier supplémentaire 2: Tableau S2. Relation entre les caractéristiques clinico et stromal expression FGF9 chez les patients atteints de cancer gastrique. Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts. Les contributions de
Auteurs
CS et HF conçus et exécutés toutes les expériences, a analysé les données, et a écrit le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

• Le défi de diagnostic de la tumeur pulmonaire microangiopathie thrombotique comme une présentation pour le cancer gastrique métastatique: un rapport de cas et revue de la littérature
• Xpert MTB /RIF d'essai peut être utilisé sur l'aspiration gastrique archivé et des échantillons d'expectoration induite pour le diagnostic de la tuberculose sensible pédiatrique