CDK-associerad Cullin en kan främja celltillväxt och hämma cisplatin-inducerad apoptos i AGS magcancer cell line

CDK-associerad Cullin en kan främja celltillväxt och hämma cisplatin-inducerad apoptos i AGS magcancer cellinje Bild Sammanfattning
bakgrund
Gastric cancer är en vanlig och mycket dödlig malignitet i världen, men dess patogenes förblir gäckande. I denna studie fokuserar vi på de biologiska funktionerna hos CDK-associerad Cullin1 (CAC1
), en ny gen i Cullin familjen, i magcancer, som kan hjälpa oss att ytterligare förstå ursprunget till denna malignitet.
metoder sälja The AGS och MGC803 gastric cancercellinjer och GES-1 magslemhinnan cellinje valdes för studien. Till en början var CAC1
uttryck för dessa cellinjer undersöktes genom kvantitativ realtids-RT-PCR (QRT-PCR) och Western blot undersökningar, då CAC1
små störande RNA (CAC1
-siRNA) utformades och transfekterades in i AGS-cellinjen med en relativt hög nivå av CAC1
. När CAC1
tystades en serie biologiska egenskaper AGS celler såsom celltillväxt, cellcykeln, apoptos, och uttryck av apoptosrelaterade gener (P53
, BCL2 Mössor och BAX
) var bestämdes genom MTT, flödescytometri, QRT-PCR och Western blot, respektive.
Resultat
CAC1
expression av AGS eller MGC803 var mycket högre än den för GES-1. Efter CAC1
uttryck effektivt deprimerad av RNA-interferens i AGS celler skedde betydande celltillväxthämning. Vidare ökade andelen celler som behandlats med CAC1
-siRNA i G1-fasen och minskade i S-fasen, indikativ för G1-cellcykeluppehåll. Ännu viktigare var proportionerna av tidig /sen apoptos i AGS celler förstärkt med cis-diaminedichloroplatinum (cisplatin, CDDP) behandling, men till en högre grad med cisplatin plus CAC1
-siRNA. Intressant BCL2
mRNA kopior visade ungefär en 30% minskning av cisplatin gruppen, men minskade med ca 60% i cisplatin plus CAC1
-siRNA grupp. Omvänt, p53
mRNA uttryck erhålls nästan en två-faldig ökning av den cisplatin-gruppen, i tillägg till en fem-faldig ökning av cisplatin plus CAC1
-siRNA grupp, och BAX
mRNA-nivåer hade nästan en två- och fyrfaldig ökning, respektive. Under tiden, P53
, BAX
och BCL2
visade samma ändringsmönster i Western blöt undersökningar.
Slutsatser
CAC1
kan främja cellproliferation i AGS gastric cancer-cellinjen. Dessutom kan det hindra AGS celler från att uppleva cisplatin-inducerad apoptos genom att modulera uttryck av P53
, BCL2 Mössor och BAX
.
Nyckelord
Magcancer CDK-associerad Cullin1 spridning Cellcykel Apoptos Bakgrund
Gastric cancer är en av de vanligaste maligna tumörer och den andra ledande orsaken av cancerdöd i världen, med ansvar för totalt 989,600 nya fall och 738,000 dödsfall årligen [1]. Under de senaste åren har det skett en stadig nedgång i förekomsten och dödligheten risk för magcancer i de flesta länder [2], på grund av de enorma utvecklingen inom diagnos och behandlingsmetoder. Men fortfarande magcancer ett stort hot mot människor, särskilt de i utvecklingsländerna [1], och överlevnaden av alla drabbade patienter, även efter kurativ kirurgisk resektion och adjuvant terapi, är mindre än 40% Epidemiologiska
[3]. undersökningar har avslöjat många riskfaktorer för magcancer, och molekylärbiologisk forskning visar vidare att gastric cancer omfattar ett stort antal genetiska och epigenetiska händelser, som involverar ett kluster av onkogener, tumörsuppressorgener, cellcykelregulatorer, celladhesionsmolekyler och DNA-reparationsgener [4] . Men de exakta mekanismerna bakom magcancer inte väldefinierad.
CDK-associerad Cullin1 är en ny gen som identifierats i kolorektal cancer. Den omfamnar en öppen läsram-sekvens som kodar för ett protein 37 kDa av 369 aminosyror [5]. Den CAC1
protein innehåller en Cullin domän mellan aminosyrorna 137 och 250, och räknas därför som en medlem av Cullin familjen E3 ubiquitin ligas [5]. Histologiska undersökningar hade etablerat ett möjligt samband med CAC1
uttryck med patologiska funktioner och kliniska stadier av kolorektalcancer patienter [5]. Dessutom CAC1
, in vitro
, uttrycktes i ett cellcykelberoende sätt med högt uttryck i det sena G1 till S-fasen [5]. Notably, kunde CAC1
befrämja cellcykelprogression och stimulera kinasaktiviteten av CDK2
[5]. Ändå lite är känt om dess uttryck och biologiska egenskaper i magcancer.
Aktuella studien genomfördes för att undersöka uttrycket av CAC1 Mössor och att utforska den funktion som CAC1
utför i gastric carcinoma cellinjer. AGS cellinje valdes som modell för att studera eftersom det uttrycks relativt hög CAC1
, då CAC1
uttryck tystas genom RNA-interferens (RNAi), och en serie av biologiska parametrar som är relevanta för celltillväxt, cell cykel och apoptos undersöktes, på motsvarande sätt.
metoder
Cellodlings
mänskliga gastric cancercellinjer (AGS och MGC803) och magslemhinnan cellinje (gES-1) tillhandahölls från Central Laboratory of Medical College, Xi "en Jiaotong University, Kina. Cellerna odlades i RPMI 1640-medium (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) kompletterat med 10% serum från nyfödd kalv (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 kU /L penicillin, 0,1 g /L streptomycin, 0,3 g /L L-glutamin och 0,85 g /L NaHCOs 3 vid 37 ° C i en fuktig atmosfär innehållande 5% CO 2.
siRNA transfektion
CAC1
-siRNA (avkänning- GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT 3 ', antisens-5 ' UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG3 '), CAC1
negativ kontroll siRNA (NC-siRNA, känsla-5 'UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT 3 ', antisens-5 'ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3 ') syntetiserades kemiskt genom Shanghai GenePharma Corporation (SGC, Shanghai, Kina). Alla siRNA blandades i Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) och transfekterades enligt siRNA Transfektion protokollet. Effektiviteten i CAC1
knockdown utvärderades med QRT-PCR och Western blot tester.
MTT-analys
MTT (3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid tiazolyl blå indikator-färgämne) chemosensitivity assay applicerades för att bestämma proliferationshastigheten för AGS gastric celler. Celler såddes vid en koncentration av 5 x 10 3 celler per brunn i 96-brunnsplattor. Alla experiment utfördes i triplikat. Celler inkuberades under 24 timmar och delades in i fem grupper med fem olika behandlingar (null, NC-siRNA (60 nmol /L (nM)), siRNA (30 nM), siRNA (60nm), siRNA (90 nM)) för 0, 24, 48, 72 och 96 timmar, i motsvarande grad. Tjugo mikroliter av 5 mg /ml MTT (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tillsattes per brunn och cellerna kvar inuti inkubatorn för ytterligare 4 h vid 37 ° C, följt av tillsats av 150 | il DMSO. Absorbans av den färgade lösningen mättes genom ett helt automatiskt multidetektering mikroplattläsare (Polarstar Optima, BMG Labtechnologies, Offenburg, Tyskland) vid 490 nm.
Flödescytometrisk analys
celler (1 x 10 5-celler /brunn) skördades i 6-brunnsplattor i 24 timmar, och behandlades med olika medel (null, NC-siRNA, siRNA (60nm)) under 48 timmar. Sedan var de samlas för att tvättas med 0,01 mol /L kall (4 ° C) PBS genom centrifugering vid 800 rpm, 4 ° C under 8 minuter, och sedan fixeras i 4 ° C, 75% etanol under en natt. Fixerade celler centrifugerades (såsom ovan) och tvättades igen med PBS. Då cellerna behandlades med 100 pl av DNas-fritt, RNasA (10 mg /ml) och inkuberades vid 37 ° C under 10 minuter. Slutligen färgades cellerna med 100 | il av 100 | ig /ml propidiumjodid (ljuskänsligt) och inkuberades vid rumstemperatur under 30 minuter. Celler från varje prov placerades i Falcon-rör och läsa på en FAC sorterare (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey, USA). De cellcykelprofiler tolkades med B-D FAC Sortera Cell Quest mjukvara.
Apoptos analys
Celler (1 x 10 5 celler /brunn) inkuberades i sex-brunnars plattor. Efter 24 timmar var de adresseras med olika medel (null, cisplatin (10 pM), cisplatin (10 ^ M) + NC-siRNA (60nm), cisplatin (10 ^ M) + siRNA (60nm)) i serumfritt medium under 24 timmar, uppsamlades därefter färgades cellerna med Annexin V /PI med hjälp Vybrant apoptos analyssats nr 2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) och analyserades med flödescytometri.
Kvantitativ realtids omvänd transkriptions-PCR
Expression av CAC1 i magcancer cellinjer
Totalt RNA isolerades från olika cellinjer (AGS, MGC803 och GES-1) med syra guanidinium-fenol-kloroform-metoden (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, USA), och cDNA syntetiserades använder PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). Primersekvenser används för amplifiering utformades av Takara (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) och har följande: framåt primer 5'-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; omvänd primer 5'-CAT TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3 '. β-aktin
framåtriktad primer 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A -3 '; omvänd primer 5'-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A -3 '. Primrar användes i vanliga PCR-reaktioner med cDNA från celler i syfte att utvärdera deras lämplig utformning och syntes. Därefter överfördes PCR-produkterna sekvenserades och deras likhet med de önskade nukleotidsekvenserna bekräftas. Den relativa mängden av mRNA bestämdes med användning av SYBR Green PCR Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) med genspecifika primrar för CAC1
eller β-aktin
. Alla steg utfördes i enlighet med tillverkarens protokoll. Real-time PCR reaktioner utfördes på en ABI 7500 thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) med BioRad iQ5 och MyiQTM realtids-PCR Detection System (BioRad Laboratories, Hercules, Kalifornien, USA). Tre oberoende PCR-test genomfördes från varje RT prov. Uttrycket av CAC1
mRNA i varje prov normaliserades mot β-aktin Mössor och uttrycksnivån beräknades med ΔΔCT (Delta Delta tröskelcykel) Expression av apoptosrelaterade gener i AGS cellinje metod.

RNA-isolering och cDNA-syntes utfördes såsom noterats. En serie av primrar designades och syntetiserades genom TaKaRa inklusive P53
(framåt-5 '- CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3 ', reverse-5 '- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 '), BCL2
(framåt 5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 ', reverse-5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), BAX
(framåt 5 ' - GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 ', omvänd-5 ' - AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ') och β-aktin
(framåt 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 ', omvänd 5 '- CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A -3 ") gener. Såsom angivits ovan realtids-PCR utfördes tre gånger. PCR-produkterna detekterades genom mätning av emitterande fluorescensen vid slutet av varje reaktionscykel. Tröskelcykeln motsvarar antalet cykler som krävs för att detektera en fluorescenssignal ovanför baslinjen. Den β-aktin
gen fungerade som den interna kontrollen av reaktionen.
MRNA expressionsnivåer beräknades med hjälp av två -ΔΔCT metod och uttrycks i relativa kvantifiering heter. I detalj var tröskel cykler av housekeepinggen β-aktin
och målgener BCL2
, BAX
och P53
bestämdes i varje prov och för varje tidsperiod. CT-värden normaliserades (ΔCT) genom att subtrahera de expressionsnivåer av referens genen β-aktin
från de motsvarande expressionsnivåer av BCL2
, BAX
och P53
i varje prov. Den normaliserade genuttryck i de behandlade AGS-celler analyserades i förhållande till sina matchande obehandlade celler, som fungerade som kalibratorzoner prover (ΔΔCT).
Western blot undersökningar
Femtio mikrogram av totalt protein från AGS-cellinjen separerades på en 10% Trisglycine SDS-polyakrylamidgel och överfördes till ett nitrocellulosamembran (BioRad, Hercules, Kalifornien, USA). Blotten sonderades med monoklonala antikroppar från mus inklusive anti-CAC1
(GeneTex, Irvine, Kalifornien, USA, 1: 1500), anti-β-aktin
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 5000), anti-P53
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), anti-BCL2
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), och anti-BAX
(Santa Cruz, CA , USA; 1: 2000). Antikroppsbindning detekterades genom att använda Gel Blot Imaging Systems (Syngene G: BOX, Cambridge, UK). Enligt tillverkarens protokoll
Statistisk analys
Alla statistiska analyser genomfördes med hjälp av SPSS 13,0 programvara (http: //www -01. IBM. com /software /analys /SPSS /). Varje analys utfördes minst tre gånger. Data uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse, och One-way ANOVA test (dubbelsidig) utfördes för att bestämma signifikansen av skillnader i multipla jämförelser. Resultaten ansågs vara statistiskt signifikant vid P Hotel <. Resultat 0,05
differentiellt uttryck av CAC1
i magcancer och mucosal cellinjer
CAC1
mRNA-uttryck utvärderades med realtids-RT-PCR i tre cellinjer. Uppenbarligen var CAC1
uttryckt i var och en av de undersökta cellinjer (Figur 1A). Emellertid AGS och MGC803 cellinjer uppvisade högre nivåer av CAC1
mRNA än GES-1-cellinjen (1,0000 ± 0,0000 och 0,9507 ± 0,0176 kontra
0,4340 ± 0,0414, P
< 0,05). Dessutom CAC1
proteinuttryck i western blot-undersökningar visade samma föränderliga trend som CAC1
mRNA (Figur 1A). Figur 1 CAC1 uttryck i humana magcancer och mucosal cellinjer. (A) i realtid omvänd transkription (RT) -PCR och western blot-analys av CAC1
uttryck i AGS, MGC803 och GES-1-cellinjer (* representerar P Hotel < 0,05 mellan GES-1-cellinje och andra cellinjer). (B) CAC1
uttryck effektivt deprimerad av 60nm CAC1
-siRNA i AGS-cellinje på mRNA och proteinnivå (* representerar P Hotel < 0,05 mellan kontrollgruppen och CAC1
-siRNA grupp).
Endogenous uttryck av CAC1
tystades av RNAi teknik
Transient transfektion av AGS-celler med CAC1
-siRNA oligos (60nm) utformad mot CAC1
sekvens effektivt hämmade uttryck av CAC1
. CAC1
mRNA-expression undersöktes genom realtids-RT-PCR. Som väntat, var mRNA-nivån av CAC1
minskat avsevärt i CAC1
-siRNA grupp (1,0000 ± 0,0000 kontra
0,3583 ± 0,0244, P
< 0,05), men visade ingen signifikant skillnad mellan kontroll och NC-siRNA grupper (1,0000 ± 0.0000 mot
0,9597 ± 0,0407 P Hotel > 0,05) (Figur 1B). Under tiden var CAC1 proteinuttryck även deprimerad efter siRNA behandling i Western blot-undersökningar (Figur 1B).
CAC1
ljuddämpnings hämmar cellproliferation i AGS-cellinjen
För att undersöka rollen CAC1
spelar i reglering av celltillväxt, var AGS celler behandlas av övergående transfektion med CAC1
-siRNA av tre olika doser (30 nM, 60 nm och 90 nm) utsattes för MTT-analys. Inom fyra dagar, CAC1
tystande uppvisade en distinkt inhiberande effekt på cellproliferation i enlighet med olika doser av CAC1
-siRNA (Figur 2). Optiska densiteter (ODS) i kontrollgruppen, NC-siRNA-gruppen och 30 nM CAC1
-siRNA gruppen visade ingen signifikant skillnad med varandra (P
> 0,05), men var högre än de av 60 nm och 90 nM CAC1
-siRNA grupper (P
< 0,05). Interestingly, celler behandlade med 60 nm och 90 nM CAC1
-siRNA visade nästan identiska OD från början till slutet (P
> 0,05). Figur 2 Celltillväxt hämmades följande CAC1 ljuddämpning. AGS-celler transfekterades transient med null, NC-siRNA och tre koncentrationer av CAC1
-siRNA för fyra dagar, respektive. Tillväxthastigheter av celler bestämdes genom MTT-analyser.
Cellcykelanalys
Jämfört med kontrollen var andelen celler som behandlats med CAC1
-siRNA ökade med 28% eller så i G1 /G0 fas (45,33 % ± 0,82% jämfört
73,23% ± 3,04%, P Hotel < 0,05), och minskade med cirka 36% i S-fasen (41,07% ± 1,07% jämfört
5,40% ± 5,83%, P Hotel < 0,05), med ingen signifikant förändring i G2 /M fas (13,61% ± 0,46% jämfört
21,37% ± 2,88%, P Hotel > 0,05) (Figur 3). Dessa resultat indikerar att CAC1
kan befrämja cellcykelprogression av AGS-celler via G1 /S övergång. Figur 3 Knockdown av CAC1- inducerad G1 cellcykelstopp i AGS-cellinje. Cellcykelanalys av AGS-celler behandlade med eller utan CAC1
-specifika siRNA med flödescytometri. Andelen celler var markant förhöjda i G1-fasen medan reduceras i S-fasen vid behandling med CAC1
-siRNA (* representerar P
< 0,05 mellan kontrollgruppen och den CAC1
-siRNA grupp).
Knockdown av CAC1
förbättrar cisplatin-inducerad apoptos sälja The AGS-celler delades in i fyra experimentella grupper: kontrollgruppen, den cisplatin-behandlade (10 M) grupp, cisplatin plus NCsiRNA grupp, och cisplatin plus CAC1
-siRNA (60nm) grupp. Jämfört med kontrollgruppen, var proportionerna av tidig /sen apoptos förstärkt med cisplatin behandling, men till en högre grad med cisplatin plus CAC1
-siRNA (2,01% ± 0,78% mot
8,87% ± 3,65% mot
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25% mot
3,89% ± 0,15% mot
10,01% ± 0,09%, P
< 0,05) (figur 4A och 4B), vilket innebar att den knockdown av CAC1
dramatiskt accelererade cisplatin-inducerad apoptos. Figur 4 CAC1 tystande förbättras cisplatin-inducerad apoptos i AGS-cellinjen. (A) Effekterna av cisplatin enbart och i kombination med NC-siRNA /CAC1
-siRNA på tidiga och sena apoptos av AGS-celler (* representerar P Hotel < 0,05 mellan kontrollgruppen och behandlade grupper; #represents P Hotel < 0,05 mellan cisplatin (CDDP) grupp och andra behandlade grupperna). (B) Apoptosis mönster av AGS-celler analyserades genom flödescytometri
. Expressions profiler av apoptosrelaterade gener sälja The mRNA-nivåer av CAC1
, BCL2
, BAX
och P53
undersöktes av QRT-PCR. Inkubation av AGS-celler med 10 | iM cisplatin och /eller 60nm CAC1
-siRNA under 24 h gjorde producera intressanta mRNA-profiler (figur 5A). Enligt cisplatinbehandling, CAC1
mRNA-expression ökat kraftigt, men sjönk till en låg nivå när CAC1
-siRNA sattes samtidigt (1,0000 ± 0,0000 kontra
2,1578 ± 0,2222 kontra
0,3967 ± 0,0078, P
< 0,05). Jämfört med kontrollgruppen, BCL2
mRNA kopior visade en 30% minskning av cisplatin gruppen, men minskade med ca 60% i cisplatin plus CAC1
-siRNA grupp (1,0000 ± 0,0000 mot
0,7090 ± 0,0210 kontra
0,4030 ± 0,0171 P Hotel < 0,05). Omvänt, P53 Mössor och BAX
avskrift nivåer av behandlade grupper avsevärt förbättras. Jämfört med kontrollgruppen, P53
expression erhålls nästan en två-faldig ökning av cisplatin enbart gruppen, i tillägg till en fem-faldig ökning av cisplatin plus CAC1
-siRNA grupp (1,0000 ± 0,0000 kontra
3,0187 ± 0,1738 mot
5,9957 ± 0,3926 P Hotel < 0,05); Bax
mRNA-nivåer hade nästan en två- och fyrfaldig ökning (1,0000 ± 0,0000 mot
3,0237 ± 0,2581 mot
4,9897 ± 0,2923 P Hotel < 0,05), respektive. Figur 5 Uttrycksprofiler av apoptosrelaterade gener som svar på enbart cisplatin eller med CAC1 -siRNA behandlingar. (A) i realtid omvänd transkription (RT) -PCR-analys av CAC1
, P53
, BAX Mössor och BCL2
mRNA-expression i AGS-celler (* representerar P Hotel < 0,05 mellan CAC1
-siRNA grupp och behandlade grupper; #represents P Hotel < 0,05 mellan cisplatin (CDDP) grupp och andra behandlade grupperna). (B) Western blot-analys av CAC1
, P53
, BCL2 Mössor och BAX
uttryck i AGS celler.
Sedan western blot tester genomfördes för att detektera proteinnivåer i dessa gener efter CAC1
knockdown. Parallellt med de ovan nämnda mRNA förändringar BAX och P53
var markant uppregleras medan BCL2
var nedregleras på proteinnivå (figur 5B).
Diskussion
ubiquitin-proteasom systemet spelar en central roll för att upprätthålla balansen mellan normal tillväxt och okontrollerad spridning genom att kontrollera förekomsten av ett stort antal cellulära proteiner [6]. Den Cullin familj av ubiquitin-ligaser, traditionellt sammansatta av CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5
och 7
, representerar den största klassen av RING-typ E3-ligaser (CRLs) [6]. Utan inneboende katalytisk aktivitet, cullins tjäna som byggnadsställningar som underlättar monteringen av multimera E3 ligas komplex och överföra ubikitin från E2-konjugerande enzym till substratet. Cullin-medierad substratnedbrytning dikterar ett stort antal cellulära processer såsom proliferation, differentiering och apoptos. När cellregleringsmekanismer av Cullin möter fel eller störningar, kommer ansamling av onkoproteiner eller överdriven nedbrytning av tumörsuppressorer oundvikligen uppstår, som kan framkalla celler i malign transformation och tumörbildning [6]. I synnerhet cullin1
, den mest karakteriserade medlem av Cullin familjen, visat sig vara nära förknippad med gastric cancer, och dess överuttryck förutspår dålig prognos för patienter med magcancer [6, 7]. Sälja The uttryck profiler till cancerrelaterade gener i del återspeglar deras biologiska funktioner i patogenesen av cancer. Att vara en ny medlem av Cullin familjen, har CAC1
uttrycksmönster studerats i större omfattning i en tidigare studie [5]. Med användning av cDNA-bibliotek analys var CAC1
expression hittades i normalt mage, tunntarm, kolon, lever, lunga, njure, muskel, hjärta, bröstkörtel, livmoder, hjärna, mjälte, lymfkörtel, med höga nivåer i tjocktarmen och bröstkörteln [5]. Western blot-test dessutom detekteras CAC1
protein i en värd av normala och cancercellinjer [5]. När det gäller vår studie, AGS och MGC803 gastric cancercellinjer hade högre CAC1
uttryck än GES-1 gastrointestinala cellinje som tyder på att CAC1
kan spela en aktiv roll i gastric cancer.
geners uttryck av RNA-interferens är en kraftfull metod för att analysera geners funktion [8]. Här har vi framgångsrikt transfekterade NCsiRNA och tre koncentrationer av CAC1
-siRNA i AGS celler. MTT analyser visade att spridningen potential AGS celler kraftigt hämmas av 60nm och 90 nM CAC1
-siRNA i samma utsträckning, men misslyckades med att påverkas av 30 nM CAC1
-siRNA eller NC-siRNA. Det var uppenbart att CAC1
positivt kan påverka cellproliferation i magcancer, som var i överensstämmelse med tidigare studier på HeLa-cellinjen [5]. I MTT undersökningar, HeLa-celler som uttrycker Flag-CAC1
gick högre proliferationsförmåga än de mock-transfekterade kontrollceller, och celler behandlade med CAC1
-siRNA uppvisade signifikant hämmad tillväxt [5]. Vad mer, realtids-RT-PCR och Western blot-analyser bekräftade att uttrycket av CAC1
var efficaciously blockerad av 60nm CAC1
-siRNA. Sammantaget var 60 nm bestämdes att vara den mest lämpliga experimentella doseringen för RNAi i efterföljande undersökningar.
Som en allmän regel, normal celltillväxt beror på välordnat och effektivt cellcykel process som garanterar överlappning och överföring av genetisk information från en cell generation till nästa. Med andra ord, avreglering av cellproliferation ligger alltid i en onormal cellcykeln. Under CAC1
-silencing förhållanden flödescytometri i vår studie visade förhöjd andel av celler i G1 /G0 fas och en nedsättning av celler i S-fasen. I huvudsak CAC1
knockdown inducerad G1 cellcykelstopp i AGS-celler, som var i överensstämmelse med resultaten från HeLa-cellinjen [5]. CAC1
var också förmåga att binda till CDK2
och stimulera dess kinasaktivitet vid G1 /S fasövergång utan att avsevärt ändra uttryck för cyclinA
, cyklin
, cyclinD1
, CDK2
RB
, PTEN
, och så vidare [5]. Det är tänkt att CAC1
depression dämpar aktiviteten av CDK2 Mössor och avbryter G1-S övergång.
Apoptos är en av de grundläggande biologiska fenomen som kännetecknas av en serie av transformationer i cellmorfologin [9]. Vidare apoptos i samförstånd med cellproliferation utgör en avgörande balanseringsmekanism som hanterar ett stort antal fysiologiska förfaranden såsom vävnadshomeostas och normal utveckling [9]. Under patologiska förhållanden, avvikande apoptos bidrar vanligtvis mycket till initiering och progression av cancer [10-12] och även påverka känsligheten hos cancerceller till terapeutiska ingrepp [13].
Entydig aktivitet CAC1
i cellcykeln reglering tog upp möjligheten att det är mer eller mindre involverade i processen för apoptos. I den aktuella studien, andelen tidiga /sena apoptotiska celler ökade med cisplatinbehandling, men ökade ännu mer så när CAC1
uttryck samtidigt hämmas av RNAi. Det vill säga, apoptotiska indexen för cisplatin plus CAC1
-siRNA grupp erhållen en signifikant ökning i jämförelse med de för de tidigare tre grupper med intakt CAC1
. Kumulativa data antyder att CAC1
kan försvaga anti-cancer effekt av cisplatin genom att motverka cisplatin-inducerad apoptos.
Förordning av apoptos, men bygger på ett nätverk av anti- och proapoptotiska molekyler som BCL2
familj [14]. BCL2
(B-cell-CLL /lymfom 2) är en proto-onkogen som ligger i den kromosomala regionen 18q21.3, som kodar för en antiapoptotiska proteinet 26 kDa som innehåller fyra BH-domäner (BH1 ~ BH4)) [15]. Det kan hindra frisättningen av cytokrom c från mitokondrierna, alltså upphäva aktiveringen av kaspaser och slutligen inhibera apoptos [16]. Enligt tidiga studier, överuttryck av BCL2
driver celler mot malign transformation [17] och förutsäger prognosen vid många maligniteter [18-22]. Särskilt i magcancer, ofta uttryck av BCL2
genen alltid förekommit i maligna vävnader [23-25]. Höga uttrycksnivåer av BCL2
genen, men korrelerade med mindre aggression magcancer [26], hade mycket att göra med läkemedelsresistens av cancercellerna [27].
BAX
(BCL2
associerad X protein) genen är belägen i den humana kromosomala regionen 19q13.3-q13.4 [28]. Dess 21-kDa som kodar för protein, i synnerhet, fungerar som en proapoptotisk medlem av BCL2
familjen. BAX
protein består av tre BH-domäner (BH1, BH2, och BH3) och delar en hel del homologi med BCL2
proteinet. Faktum är att BAX
protein fungerar som en suppressor av BCL2
påskynda apoptotisk celldöd, genom att bilda BAX
/BCL2
komplex eller genom att konkurrera med andra BCL2
mål [29]. Överuttryck av BAX
genen hade en negativ effekt på celltillväxt i human gastric cancer, på grund av induktion av apoptos och till att förbättra cell chemosensitivity [30]. Tvärtom undertryckande av BAX
genexpression inducerad tumörbildning i mag epitel [23].
Cisplatin är ett slags kemoterapeutiskt medel används ofta i solida maligniteter inklusive magcancer. Det är allmänt accepterat att dess primära cytotoxiska effekten är DNA-skador och efterföljande induktion av apoptos [31], så variationer av apoptos-associerade gener i cisplatin-behandlade celler genomträngande speglar mekanismerna bakom cisplatin-inducerad apoptos. När det gäller vår studie CAC1
uttryck uppregleras av cisplatinbehandling, men var märkbart nedregleras av siRNA behandling trots tidigare cisplatin. Vidare ligger till grund för ökningen av cisplatin-inducerad apoptos som följer CAC1
ljuddämpning är samtidig genuttryck förändringar inklusive uppregleringen av P53
och BAX
liksom nedreglering av BCL2.
Dessa effekter tyder på att CAC1
stärker cisplatin-inducerad apoptos genom att modulera uttryck av BCL2
, BAX
och P53
.
som tidigare nämnts, BCL2
är till synes beläget på konvergensen av ett par apoptotiska vägar och förhållandet mellan BCL2
till BAX
protein tycks vara den sista avgörande för huruvida en cell kommer in i genomförandefasen [31]. I själva verket är det BCL2
/BAX
förhållande som styr känsligheten hos celler för att apoptotiska stimuli [32, 33]. I processen för cisplatin-inducerad apoptos, CAC1
fick skyddar AGS-celler från apoptos genom att förändra BCL2
/BAX
kvoten, till CAC1
tystande förde ut en uttalad ökning av BAX
och en minskning med BCL2
, som var gynnsam för förekomsten av cellapoptos.
Intressant nog var P53
genen i AGS-celler uppregleras med cisplatinbehandling, särskilt med synkron undertryckande av CAC1
. Det är väl känt att P53
spelar en viktig roll i förvaltningen av cellcykeln och apoptos. DNA-skada som härrör från cisplatin kan stimulera uttryck av P53
protein som resulterar i både expression av nedströms P21
protein och G1-cellcykeluppehåll [34]. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Nyttan av intranasal Ketamin och midazolam att utföra ventrikelsköljvätska hos barn: en dubbelblind, placebokontrollerad, randomiserad studie
• Sammanslutningar av en PTPN11 G /A polymorfism i intron 3 med Helicobactor pyloriseropositivity, gastric atrofi och magcancer i japanska