CDK susijęs Cullin 1 gali skatinti ląstelių proliferaciją ir slopinti gydant cisplatinos sukelta apoptozę AGS skrandžio vėžio ląstelių linijos

CDK susijęs Cullin 1 gali skatinti ląstelių proliferaciją ir slopinti gydant cisplatinos sukelta apoptozę AGS skrandžio vėžio ląstelių linijos
Anotacija
faktai
Skrandžio vėžys yra dažna ir labai mirtina piktybinis navikas pasaulyje, tačiau jos patogenezę palaikai silpnas. Šiame tyrime mes orientuojamės į biologinių funkcijų CDK-susijusia Cullin1 (CAC1 pervežimas), naują geno Cullin šeimoje, skrandžio vėžio, kuris gali padėti mums toliau suprasti šio piktybinių navikų kilmę.
metodai Viesbutis The AGS ir MGC803 skrandžio vėžio ląstelių linijos ir GES-1 skrandžio gleivinės ląstelių linija buvo atrinkti tyrimo. Pradžioje CAC1
išraiškos tų ląstelių linijų išnagrinėjo kiekybinio realiu laiku atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (KRL PGR) ir Vakarų dėmė egzaminų, tada CAC1
sirnr (CAC1
-siRNA) buvo sukurta ir perkeltų į AGS ląstelių linijos su santykinai aukšto lygio CAC1
. Kai CAC1
nutilo, iš biologinių savybių AGS ląstelių, tokių kaip ląstelių proliferaciją, ląstelės ciklo, apoptozės ir išraiškos apoptozės susijusių genų (P53
, BCL2
ir BAX
) serijos buvo lemia MTT, tėkmės citometrijos, KRL-PGR ir Vakarų dėmė, atitinkamai.
rezultatai
CAC1
išraiška AGS ar MGC803 buvo daug didesnis nei GES-1. Po CAC1
išraiška buvo efektyviai slegia RNR kišimosi į AGS ląsteles, svarbus ląstelių augimo slopinimas įvyko. Be to, iš ląstelių gydomiems CAC1 pervežimas -siRNA dalis padidėjo G1 fazės ir sumažėjo S fazėje, rodo G1 ląstelės ciklo arešto. Dar svarbiau, kad ankstyvosios /vėlu apoptozės proporcijos AGS ląstelių buvo sustiprintas su CIS-diaminedichloroplatinum (cisplatina, CDDP) gydymui, bet į aukštesnį kiek su cisplatina plius CAC1
-siRNA. Įdomu tai, kad BCL2
iRNR kopijos parodė apie 30% sumažėja cisplatinos grupės, bet sumažėjo maždaug 60% į cisplatina plius CAC1
-siRNA grupės. Priešingai, p53
iRNR išraiškos gaunama beveik du kartus padidinti cisplatinos grupės, be to penkis kartus padidinti cisplatina plius CAC1
-siRNA grupė ir BAX
iRNR lygiui turėjo beveik dviejų ir keturių kartų padidėjimas, atitinkamai. Tuo tarpu P53
, Bax parsisiųsti ir BCL2
parodė tuos pačius pakeitimo modelių Vakarų dėmė egzaminus.
Išvadas
CAC1
gali skatinti ląstelių proliferaciją į AGS skrandžio vėžio ląstelių linija. Be to, ji gali padėti išvengti AGS ląsteles nuo išgyvena cisplatiną sukeltos apoptozės per tolygiam išraiškos P53
, BCL2
ir BAX
.
Raktiniai žodžiai
Skrandžio vėžys CDK susijusių Cullin1 neplatinimo ląstelės ciklo apoptozę Background
Skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų ir antroji pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirties pasaulyje, atsakingos už daugelį 989,600 naujų atvejų ir 738,000 mirčių viso kasmet [1]. Per pastaruosius metus, ten buvo pastovus mažėjimas Sergamumas ir mirtingumas rizika skrandžio vėžio daugelyje šalių [2], dėl didžiulių pokyčių diagnostikos ir gydymo metodus. Tačiau, skrandžio vėžys išlieka didelis pavojus žmonių, ypač besivystančiose šalyse [1], ir visų nukentėjusių pacientų, net po radikalių chirurginės rezekcijos ir palaikomąja terapija išlikimo, yra mažesnis nei 40% [3].
Epidemiologiniai tyrimai atskleidė daug rizikos veiksnių skrandžio vėžio ir molekulinės biologijos tyrimų dar rodo, kad skrandžio Kancerogeninis apima daug genetinių ir epigenetinius renginius, kuriuose dalyvavo onkogenų, naviko slopintuvas genų, ląstelių ciklo reguliavimo, ląstelių adhezijos molekulių bei DNR pažaidų atstatymo genų klasterius [4] , Tačiau tikslios mechanizmus, sukeliančius skrandžio vėžys nėra gerai apibrėžtas.
CDK susijęs Cullin1 yra naujas genas nustatyta storosios žarnos karcinoma. Ji apima atvirą skaitymo rėmelis seką, kuri koduoja 37 kDa baltymo, sudaryto iš 369 amino rūgščių [5]. CAC1
baltymų yra Cullin domeną tarp amino rūgščių 137 ir 250, ir todėl klasifikuojamas kaip Cullin šeimos E3 Ubikvitino ligases [5] narį. Histologiniai tyrimai buvo įkurta galimą asociacija CAC1
išraiškos su patologinių funkcijų ir klinikinių stadijų storosios žarnos karcinomai gydyti [5]. Be to, CAC1
in vitro
, buvo išreikšta ląstelės ciklo priklausomu būdu su aukštos raiškos pabaigoje G1 į S fazę [5]. Pažymėtina, CAC1
galėtų skatinti ląstelių ciklą ir skatinti kinazės aktyvumą CDK2
[5]. Nepaisant to, mažai žinoma apie jo saviraiškos ir biologinių savybių skrandžio vėžio.
Dabartinis tyrimas buvo atliktas siekiant ištirti CAC1
išraišką ir ištirti funkciją, kuri CAC1
koncertuoja skrandžio karcinoma ląstelių linijų. AGS ląstelių linija buvo pasirinktas kaip už studijų modelį, nes jis išreiškė gana aukšto lygio CAC1
, tada CAC1
išraiška buvo nutildyti RNR trukdžių (RNAi) ir biologinių parametrų serijos aktualios ląstelių proliferaciją, ląstelių buvo išnagrinėti ciklas ir apoptozė, atitinkamai.
metodai
ląstelių kultūros
žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas (AGS ir MGC803) ir skrandžio gleivinės ląstelių linijos (GES-1) buvo numatyta Centrinės laboratorijos medicinos koledžo, XI "Pagal Jiaotong universitetas, Kinija. Ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 vidutinės (Gibco BRL, Grand Island, NY, JAV), papildytoje su 10% naujagimio serumas iš veršiuko (Gibco BRL, Grand Island, NY, JAV), 100 KU /L penicilino, 0,1 g /l streptomicino, 0,3 g /l L-glutamino ir 0,85 g /l NaHCO 3 37 ° C drėgnoje atmosferoje, kuriame 5% CO 2.
siRNA transfekcijq
CAC1
-siRNA (sense- GGA UGG UGC CAU AGA Uca PGS 3 ', Priešprasminis-5 ' UUG AUC Aminorūgštis koduojančios sekos GGC ACC AUC CGG3 '), CAC1
neigiamos kontrolės siRNR (NC-siRNR, jausmas-5 'UUC UCC GAA PGV GUC ACG UTT 3 ', Priešprasminis-5 'ACG UGA ŠMC GUU CGG AGA PGS 3 ') buvo chemiškai susintetinti Šanchajus GenePharma Corporation (SGC, Šanchajus, Kinija). Visi siRNAs buvo sumaišyti į Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, JAV) ir perkeltų pagal siRNA transfekcijq protokolą. Iš CAC1
triuškinantis efektyvumas buvo įvertintas KRL-PGR ir Vakarų dėmė bandymus.
MTT
MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-diphenyltetrazolium bromidas tiazolilas mėlyna indikatoriaus dažų) chemosensitivity analizė buvo taikoma siekiant nustatyti platinimo norma AGS skrandžio ląstelėse. Ląstelės buvo pasėjamos esant 5 × 10 koncentracija 3 ląstelės per gerai 96-duobučių lėkštelėse. Visi eksperimentai buvo atliekami tris kartus. Ląstelės buvo inkubuojamos 24 valandas ir buvo suskirstyti į penkias grupes su penkių skirtingų gydymo (nulis, NC-siRNR (60 nmol /L (NM)), siRNR (30 nm), siRNR (60nM), siRNR (90 nm)) už 0, 24, 48, 72 ir 96 valandos, atitinkamai. Dvidešimt mikrolitrų 5 mg /ml MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, JAV), esantys fosfatinio buferio druskų tirpalo (PBS) buvo pridėta į šulinėlį ir ląstelės liko viduje dar 4 h inkubatoriuje 37 ° C temperatūroje, o po to iš 150 iL DMSO papildymas. Optinių iš spalvos tirpalas buvo matuojamas taikant visiškai automatizuotą kelių aptikimo mikroplokštelės skaitytojui (Polarstar OPTIMA BMG Labtechnologies, Offenburg, Vokietija) esant 490 nm bangos ilgiui.
Tėkmės citometrijos analizė
ląstelių (1 × 10 5 ląstelės /duobutėje) buvo nuimta 6-duobučių lėkštelėse už 24 valandų, ir buvo gydomi įvairių veiksnių (nulis, NC-siRNR, siRNR (60nM)) 48 valandas. Tada jie buvo surinkti, reikia išplauti su 0,01 mol /l šalto (4 ° C) PBS verpimo esant 800 apsisukimų per minutę, 4 ° C temperatūroje 8-ąją minutę, ir tada nustatyta 4 ° C temperatūroje, 75% etanolio dėl naktį. Fiksuoto ląstelės buvo centrifuguojamas (kaip nurodyta aukščiau) ir vėl plaunamas PBS. Tada ląstelės buvo gydomi 100 pL DNaze be, RNaseA (10 mg /ml) ir inkubuojama 37 ° C temperatūroje 10 minučių. Pagaliau, ląstelės buvo tamsintas su 100 pL 100 mikrogramų /ml propidiumo jodidas (šviesai jautrios) ir inkubuojama kambario temperatūroje 30 minučių. Ląstelės iš kiekvieno mėginio buvo dedamas Falcon vamzdžių ir skaityti ant FAC rūšiavimo (Becton Dickinson, Franklinas ežerų, NJ, JAV). Ląstelės ciklo profiliai interpretuoti B D FAC Rūšiuoti Mobilusis Quest Software.
Apoptozę analizę
ląstelių (1 × 10 5 ląstelių /gerai) buvo inkubuojamos 6-duobučių lėkštelėse. Po 24 valandų, jie buvo skirtas įvairių preparatų (nulis, cisplatina (10 mkm), cisplatina (10 mkm) + NC-siRNR (60nM), cisplatina (10 mkm) + siRNR (60nM)) skirtą terpę, 24 serumo neturinčioje valandos, tada surinkti ląstelės buvo tamsintas su aneksinu /PI naudojant Vybrant apoptozė Bandymo komplektas Nr.2 (molekulinė zondai, Eugenijus, Oregonas, JAV) ir analizuojami tėkmės citometrijos.
Kiekybinis realaus laiko atvirkštinės transkripcijos PGR
išraiška iš CAC1 skrandžio vėžio ląstelių linijų
RNR buvo išskirta iš įvairių ląstelių linijas (AGS, MGC803 ir GES-1), naudojant rūgščių guanidinio-fenolio-chloroformo metodą (Trizol, Invitrogen, Karlovi Varai, JAV) ir kDNR buvo susintetinti naudojant PrimeScriptTM 1. kryptis sintezei komplektas (Invitrogen, Karlovi Varai, JAV). Gruntas sekas naudojamos sustiprinimui buvo sukurta TAKARA (Takara Bio Inc. Shiga, Japonija) ir nurodomos taip: į priekį gruntas 5'-GCA GCA TAT TBS GAA AGT TBS GA-3 "; Grįžtamieji gruntas 5'-CAT TTA PVG BMT AAT Persijos TTT ACT-3 ". beta-aktino
priekį gruntas 5'-TGG ŠMC CCA GCA CAA TGA -3 "; Grįžtamieji gruntas 5'-CTA AGT AGT CAT CCG BMT "AGA" AGC -3 ". Praimeriai kuris įprastai naudojamas PGR reakcijų kDNR iš ląstelių taip, kad būtų įvertinti jų tinkamai suprojektuoti ir sintezę. Vėliau, PGR produktai buvo sekos ir jų panašumas į norimą nukleotidų sekų patvirtino. Santykinis dydis mRNR buvo nustatomas naudojant SYBR GREEN PCR Master Mix (AB, Taikomosios BIOSYSTEMS Foster City, Kalifornija, JAV) su genų būdingų pradmenis CAC1
arba beta-Actin
. Visi veiksmai buvo atlikti pagal gamintojo protokolą. Realaus laiko PGR reakcijos buvo atlikti ABI 7500 termocikleriu (Applied Biosystems Foster City, Kalifornija, JAV) su BioRed iQ5 ir MyiQTM Realaus laiko PGR aptikimo sistema (BIORAD Laboratorijos, Heraklis, Kalifornija, JAV). Trys nepriklausomi PGR testai buvo atliekami iš kiekvienos RT mėginyje. Iš CAC1
mRNR ekspresijos kiekvieno mėginio normalizavosi prieš beta-aktino parsisiųsti ir pasakymas lygis apskaičiuotas naudojant ΔΔCT (Delta Delta riba ciklo) Expression apoptozės susijusių genų AGS ląstelių linijos metodas.

RNR išskyrimas ir kDNR sintezė buvo atliktas kaip nurodyta. A pradmenų serija buvo suprojektuota ir sintetinamas TAKARA įskaitant 53 psl
(pirmyn-5 '- CCA CCA TCC AKTAS PPK AKTAS PPK, T-3 ', atvirkštinės-5 '- AGG PPK GGC PPK AAC ACG-3 '), BCL2
(pirmyn-5 ' - CAA ATG KTG GAA TGA AAA PGS GTA 3 ', atvirkštinės-5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), Bax
(pirmyn-5 ' - GAA ACC TGA GCT GAA CTT VS-3 '; atvirkštinio 5 ' - AGG ARG TCC AGT GTC APG, C-3 ') ir β-Actin
(pirmyn 5'-TGG ŠMC CCA GCA CAA TGA A-3 '; atvirkštinės 5 '- CTA AGT AGT CAT CCG BMT "AGA" AGC -3 ') genai. Kaip nurodyta aukščiau realiu laiku PGR buvo atliekamas tris kartus. PGR produktai buvo aptikta matuojant spinduliuojantys fluorescenciją kiekvieno reakcijos ciklo pabaigoje. Slenkstinis ciklas atitinka ciklų, reikalingų aptikti fluorescencijos signalas yra didesnis negu bazinės linijos skaičius. ß-aktino
genas tarnavo kaip vidaus kontrolės reakcijos.
IRNR raiška koncentracija apskaičiuojama pagal 2 -ΔΔCT metodą ir išreikštas santykiniais kiekybinio vienetų. Išsamiai, riba ciklai į namų ruošos genų beta-aktino parsisiųsti ir tikslinių genų BCL2
, BAX parsisiųsti ir P53
buvo nustatytas kiekvieno mėginio ir kiekvienam laikotarpį. Ct reikšmės buvo normalizuotas (ΔCT) atimant raiškos lygius nuoroda genų β-aktino
iš atitinkamų raiškos lygių BCL2
, BAX parsisiųsti ir P53
kiekviename mėginyje. Normalizuotas genų ekspresija gydytų AGS ląstelių buvo analizuojami lyginant su savo atitikimo neapdorotas ląstelių, kurios veikė kaip Kalibravimo medžiagos mėginių (ΔΔCT).
Vakarų dėmė egzaminai
Penkiasdešimt mikrogramų bendrųjų baltymų iš AGS ląstelių linijos buvo atskirtos 10% Trisglycine SDS poliakrilamido gelio ir perkelti į nitroceliuliozės membranos (BioRad, Hercules, California, JAV). Dėmė buvo tyrinėjo su pele monokloninių antikūnų, įskaitant kovos su CAC1
(GeneTex, Irvine, Kalifornija, Jungtinės Amerikos Valstijos, 1: 1500), anti-beta-aktino
(Santa Krusas, Kalifornija, JAV; 1: 5000), prieš 53 psl
(Santa Krusas, Kalifornija, JAV; 1: 2000), anti-BCL2
(Santa Krusas, Kalifornija, JAV; 1: 2000), ir anti-BAX
(Santa Krusas, Kalifornija , JAV; 1: 2000). Antikūnų privalomas buvo aptiktas naudojant gelio dėmė vizualizavimo sistemoms (Syngene G: BOX, Kembridžas, Jungtinė Karalystė). Pasak gamintojo protokole
statistines analizes
Visi statistinės analizės buvo atlikta naudojant SPSS 13.0 programinę įrangą ( "http: //www -01. IBM. com /programinė įranga /Analytics /SPSS /). Kiekvienas tyrimas buvo atliekamas bent tris kartus. Duomenys buvo išreikštas vidurkis ± standartinis nuokrypis, o vienas ANOVA testas (dvipusis) buvo atliktas siekiant nustatyti skirtumus daugeliui lyginimų reikšmę. Rezultatai buvo laikomi statistiškai reikšmingi, kai p
. ≪ rezultatai 0,05
Nemokama diferencinė ekspresija CAC1
skrandžio vėžio ir gleivinės ląstelių linijų
CAC1
iRNR išraiškos buvo įvertintas realaus laiko AT-PGR trimis ląstelių linijų. Akivaizdu, CAC1
buvo išreikštas kiekvieno iš tirtų ląstelių linijas (1a pav.) Tačiau AGS ir MGC803 ląstelių linijas parodė didesnį CAC1
mRNR nei GES-1 ląstelių linijos (1,0000 ± 0,0000 ir 0,9507 ± 0,0176, palyginti su
0,4340 ± 0,0414, p pervežimas < 0,05). Be to, CAC1
baltymų ekspresija Vakarų dėmė egzaminų parodė tą patį persirengimo tendenciją CAC1
iRNR (1a pav.) 1 pav CAC1 išraiška žmogaus skrandžio vėžio ir gleivinės ląstelių linijų. (A), Realaus laiko atvirkštinę transkripciją (RT), -PCR ir Vakarų dėmė analizė CAC1
raiškos AGS, MGC803 ir GES-1 ląstelių linijas (* reiškia p
< 0,05 tarp GES-1 ląstelių linijos ir kiti ląstelių linijos). (B), CAC1
išraiška buvo efektyviai slegia 60nM CAC1
-siRNA į AGS ląstelių linijos ant mRNR ir baltymų lygio (* reiškia p
< 0,05 tarp kontrolinės grupės ir CAC1
-siRNA grupė).
endogeninio išraišką CAC1
nutilo iki RNAi technika
Praeinantis transfekciją AGS ląstelių su CAC1 pervežimas -siRNA oligos (60nM) sukurta prieš CAC1
seka efektyviai slopino išraiška CAC1
. CAC1
iRNR raiška buvo nagrinėjama realaus laiko RT-PGR. Kaip ir tikėtasi, iRNR lygis CAC1
buvo žymiai sumažėjo CAC1
-siRNA grupės (1,0000 ± 0,0000 lyginant
0,3583 ± 0,0244, p pervežimas < 0,05), tačiau neparodė reikšmingo skirtumo tarp kontrolės NC-siRNA grupės (1,0000 ± 0.0000 palyginti
0,9597 ± 0,0407, p pervežimas > 0,05) (1b pav.) Tuo tarpu, CAC1 baltymo ekspresija taip pat buvo depresija po siRNA gydymo Vakarų dėmė egzaminų (1b pav.)
CAC1
triukšmo slopinimo slopina ląstelių proliferaciją in AGS ląstelių linijos
Siekiant ištirti vaidmenį CAC1
vaidina iš ląstelių proliferaciją reguliavimas, AGS ląstelės skirta laikinu transfekciją su CAC1
-siRNA trijų skirtingų dozių (30 nm, 60nM ir 90nm) buvo atliktas MTT. Per keturias dienas, CAC1
triukšmo slopinimo eksponuojami atskirą slopina ląstelių proliferaciją pagal skirtingų dozių CAC1
-siRNA (2 paveikslas). Optinis tankis (OAM) Kontrolinės grupės, NC-siRNR grupės ir 30 nm CAC1
-siRNA grupė neparodė reikšmingo skirtumo tarpusavyje (p
> 0,05), tačiau buvo didesnis nei iš 60nM ir 90nm CAC1
-siRNA grupės (p
< 0,05). Įdomu tai, kad ląstelės, gydomiems 60nM ir 90nm CAC1
-siRNA parodė beveik vienodus OAM nuo pradžios iki galo (P
> 0,05). 2 pav Ląstelių augimas buvo slopinamas šių CAC1 nutildymo. AGS ląstelės buvo laikinai perkeltų su null NC-siRNR ir trys koncentracijos CAC1
-siRNA keturias dienas, atitinkamai. Augimo tempai ląstelių lėmė MTT tyrimus.
Mobilusis ciklo analizė
lyginant su kontroline, ląstelių gydomiems CAC1
-siRNA dalis padidėjo 28%, arba tiek į G1 /G0 fazės (45,33 % ± 0,82% ir
73.23% ± 3.04%, p pervežimas < 0,05), o sumažėjo maždaug 36% į S fazę (41.07% ± 1,07%, lyginant su
5.40% ± 5.83%, P
< 0,05), be reikšmingų pokyčių G2 /M etapas (13.61% ± 0,46%, palyginti su
21.37% ± 2,88%, p pervežimas > 0,05) (3 pav.) Šie rezultatai rodo, kad CAC1
gali skatinti ląstelių ciklo progresavimą AGS ląstelių per G1 /S perėjimą. 3 pav triuškinantis iš CAC1- sukeltas G1 ląstelės ciklo arešto AGS ląstelių linija. Ląstelės ciklo analizė AGS ląstelių gydomi arba be CAC1
specifinę siRNA tėkmės citometrijos. Dalis ląstelių buvo ženkliai padidėjusi G1 fazės, o sumažintas S fazėje, kai gydomi CAC1
-siRNA (* reiškia p
< 0,05 tarp kontrolinės grupės ir CAC1 pervežimas -siRNA grupės).
triuškinantis iš CAC1
pagerina cisplatiną sukeltos apoptozės
AGS ląstelių buvo suskirstyti į keturias eksperimentinių grupių: kontrolinės grupės, cisplatinos apdoroti (10 mkm) grupės, cisplatinos plius NCsiRNA grupė ir cisplatinos plius CAC1
-siRNA (60nM) grupė. Palyginti su kontroline grupe, ankstyvosios /vėlu apoptozės proporcijos buvo sustiprintas su cisplatina gydymo, bet į aukštesnį kiek su cisplatina plius CAC1
-siRNA (2,01% ± 0,78% ir
8.87% ± 3,65%, palyginti su
16.69% ± 3,15% /0,57% ± 0,25%, palyginti su
3.89% ± 0,15%, palyginti su
10.01% ± 0,09%, p pervežimas < 0,05) (4a paveiksle 4B), kuris reiškė, kad iš CAC1 nokdaunas
labai paspartėjo cisplatiną sukeltos apoptozės. 4 pav CAC1 triukšmo slopinimo sustiprintas cisplatiną sukeltos apoptozę AGS ląstelių linija. (A) cisplatinos poveikis atskirai ir kartu su NC-siRNA /CAC1
-siRNA ankstyvojo ir vėlyvojo apoptozės AGS ląstelių (* reiškia p
< 0,05 tarp kontrolinės grupės ir grupių, kurios veikiamos; #represents P
< 0,05 tarp cisplatinos (CDDP) grupės ir kitų grupių, kurios veikiamos). (B), apoptozę modeliai AGS ląstelių buvo analizuojami tėkmės citometrijos metodą.
Expression profilių apoptozės susijusių genų Viesbutis The iRNR lygiai CAC1
, BCL2
, BAX parsisiųsti ir P53
išnagrinėjo KRL-PGR. Inkubacija AGS ląstelių su 10 mkm cisplatina ir /ar 60nM CAC1
-siRNA 24 val padariau gaminti įdomių iRNR profilius (5a pav.) Pagal cisplatina gydymo CAC1
iRNR raiška žymiai padidėjo, bet sumažėjo iki žemo lygio, kai CAC1
-siRNA buvo įtraukta vienu metu (1,0000 ± 0.0000 palyginti
2,1578 ± 0,2222, palyginti su
0,3967 ± 0,0078, p
< 0,05). Palyginti su kontroline grupe, BCL2
iRNR kopijos parodė 30% sumažėjo cisplatinos grupės, bet sumažėjo maždaug 60% į cisplatina plius CAC1
-siRNA grupė (1,0000 ± 0,0000 lyginant
0,7090 ± 0,0210 prieš
0,4030 ± 0,0171, p pervežimas < 0,05). Priešingai, 53 psl parsisiųsti ir BAX
stenograma lygiai gydytų grupių buvo labai sustiprintas. Palyginti su kontroline grupe, p53 pervežimas išraiška gauta beveik du kartus padidinti vien tik cisplatina grupės, be to penkis kartus padidinti cisplatina plius CAC1
-siRNA grupė (1,0000 ± 0,0000, palyginti su
3,0187 ± 0,1738, palyginti su
5,9957 ± 0,3926, p
< 0,05); į BAX
iRNR lygiui turėjo beveik dviejų ir keturių kartų padidėjimas (1,0000 ± 0.0000 palyginti
3,0237 ± 0,2581, palyginti su
4,9897 ± 0,2923, p pervežimas < 0,05), atitinkamai. 5 paveikslas Expression profiliai apoptozės susijusių genų reaguojant į vien cisplatina arba su CAC1 -siRNA procedūros. (A), Realaus laiko atvirkštinės transkripcijos (RT), -PCR analizę CAC1
, P53
, BAX parsisiųsti ir BCL2
iRNR raiška AGS ląstelių (* reiškia p
< 0,05 tarp CAC1
-siRNA grupė ir apdorojimo grupes; #represents P
< 0,05 tarp cisplatina (CDDP) grupės ir kitose paveiktose grupėse). (B), imunoblotingu analizė CAC1
, P53
, BCL2
ir BAX
raiškos AGS ląstelių.
Tada Vakarų dėmė bandymai buvo atlikti, siekiant nustatyti baltymų lygius tų genų po CAC1
triuškinantis. Kartu su minėtų mRNR pokyčių, BAX parsisiųsti ir P53
buvo ženkliai aktyvinama o BCL2
buvo downregulated ant proteino lygį (5b pav.)
Diskusijos
Ubikvitino-proteosomos sistemos vaidina lemiamas vaidmuo išlaikant tarp normaliam augimui ir nekontroliuojamai pusiausvyrą kontroliuojant įvairiausių ląstelių baltymų [6] gausa. Cullin šeimos Ubikvitino ligases, tradiciškai sudarytas iš CUL1, 2, 3, 4a, 4b, 5
ir 7
, sudaro didžiausią klasės žiedinių tipo E3 ligases (BEL) [6]. Be vidinės katalizinio aktyvumo, Cullins tarnauti kaip pastolių, kad palengvina multimerinis E3 Ligase kompleksų surinkimas ir perdavimas Ubikvitino nuo E2-jungiantys fermento substrato. Cullin tarpininkaujant substratas degradacija diktuoja platų mobiliojo ryšio procesų, pavyzdžiui, platinimo, diferenciacijos ir apoptozės. Kai ląstelių reguliavimo mechanizmų Cullin susidurti gedimus ar pasipiktinimas, neišvengiamai atsiranda kaupimas oncoproteins ar pernelyg degradacijos naviko slopintuvai, kuris gali išprovokuoti ląstelių į piktybinę transformaciją ir Tumorigenesis [6]. Visų pirma, cullin1
, labiausiai išsiskiriantis narys Cullin šeimoje, buvo įrodyta, kad būti glaudžiai susijęs su skrandžio kancerogenezėje, o jo raiška prognozuoja prastą prognozę pacientams su skrandžio karcinoma [6, 7].
Išraiška profiliai vėžio susijusių genų dalis atspindi jų biologines savybes vėžio patogenezėje. Būdamas romanas narys Cullin šeima, CAC1
ekspresijos modeliai buvo plačiai tirtas ankstesniame tyrime [5]. Naudojant kDNR biblioteka analizės, CAC1
išraiška buvo rastas normalus skrandžio, plonosios žarnos, storosios žarnos, kepenų, plaučių, inkstų, raumenų, širdies, pieno liaukos, gimdos, smegenų, blužnyje, limfmazgiuose, su didelės koncentracijos gaubtinės ir pieno liaukos [5]. Vakarų dėmė testai papildomai aptikta CAC1
baltymo normalių ir vėžinių ląstelių linijų [5] šeimininko. Kalbant apie mūsų tyrime, AGS ir MGC803 skrandžio vėžio ląstelių linijos turėjo aukštąjį CAC1
išraišką nei GES-1 skrandžio gleivinės ląstelių linijos, kurios rodo, kad CAC1
gali vaidinti aktyvų vaidmenį skrandžio kancerogenezėje.
genai yra nuslopinami pagal RNR trukdžių yra galingas metodas analizuojant genų funkcijai [8]. Čia mes sėkmingai perkeltų NCsiRNA ir tris koncentracijas CAC1
-siRNA į AGS ląsteles. MTT analizė parodė, kad proliferacija potencialas AGS ląstelių buvo stipriai slopina 60nM ir 90nm CAC1
-siRNA į tą patį laipsnį, bet nepavyko turėti įtakos 30nm CAC1
-siRNA ar NC-siRNA. Tai buvo akivaizdu, kad CAC1
gali teigiamai įtakoti ląstelių proliferaciją skrandžio vėžio, kuris buvo sutarimu su ankstesnių tyrimų dėl HeLa ląstelių linijos [5]. MTT egzaminų HeLa ląstelės išreiškiantys vėliavos CAC1
patyrė didesnį platinimo galimybę, nei juoktis perkeltų kontrolinių ląstelių ir ląstelių, gydomiems CAC1 pervežimas -siRNA parodė žymiai slopinamas augimo tempus [5]. Kas daugiau, realaus laiko PGR ir Vakarų dėmė analizė patvirtino, kad CAC1
išraiška buvo veiksmingiau užblokuotas 60nM CAC1
-siRNA. Kartu paėmus, 60nM buvo nustatyta, kad labiausiai tinka eksperimentinis dozė RNAi vėlesniais egzaminus.
Paprastai, normalus ląstelių proliferacija priklauso nuo tvarkingai ir efektyvus ląstelių ciklo procesą, kuris užtikrina dubliavimo ir perdavimo genetinės informacijos iš vienos ląstelės kartos į kitą. Kitaip tariant, dereguliavimas ląstelių proliferacijos visada yra nenormalus ląstelių ciklo. Pagal CAC1
-silencing sąlygomis, tėkmės citometrijos mūsų tyrimas parodė padidėjusią dalį ląstelių G1 /G0 fazėje ir sumažintą ląstelių lygis S fazėje. Iš esmės, CAC1
nokdaunas sukeltas G1 ląstelės ciklo sustojimas AGS ląstelių, kurios buvo suderintos su rezultatais iš HeLa ląstelių linijos [5]. CAC1
taip pat buvo galima prisirišti prie CDK2 parsisiųsti ir skatinant jos kinazės aktyvumą tuo G1 /S fazinio virsmo be labai keičiant cyclinA
, cyclinE
, cyclinD1
išraiškas, CDK2
RB
, PTEN
ir tt [5]. Manoma, kad CAC1
depresija slopina iš CDK2
veiklą ir pertraukia G1-S perėjimą.
Apoptozę yra vienas iš pagrindinių biologinių reiškinių būdingas transformacijų serijos ląstelių morfologija [9]. Be to, apoptozė kartu su ląstelių proliferaciją sudaro lemiamą balansavimo mechanizmą, kuris valdo daug fiziologinių procedūrų, tokių kaip audinių homeostazę ir normaliam vystymuisi [9]. Pagal patologinius aplinkybėmis netipinė apoptozė paprastai prisideda kiek inicijavimo ir progresavimo vėžio [10-12] ir net paveikti vėžio ląstelių terapinių intervencijų [13] jautrumą.
Nedviprasmišką aktyvumą CAC1
ląstelės ciklo reguliavimas taip pat nurodė galimybę, kad ji yra, daugiau ar mažiau, susijusį su apoptozės procesą. Atsižvelgiant į dabartinę tyrimo duomenimis, anksti /vėlai apoptozinių ląstelių padaugėjo su cisplatina gydymo, tačiau padidėjo dar labiau, kai CAC1
išraiška buvo kartu slopinamas RNAi. Tai yra, Apoptozinės indeksai cisplatina plius CAC1 pervežimas -siRNA grupės gavo gerokai padidėjo, palyginti su tais, iš buvusių trijų grupių, kuriose yra nesugadinta CAC1
. Suvestiniai duomenys leidžia manyti, kad CAC1
gali susilpninti priešvėžinių poveikį cisplatina iki kovos su cisplatina sukeltos apoptozės.
Reglamentas apoptozės, tačiau remiasi anti- ir proapoptotic molekulių tinklą, pvz BCL2
šeimos [14]. BCL2
(B ląstelių LLL /limfoma 2) yra Proto-onkogeno įsikūręs chromosomų regionas 18q21.3, kuris kodai už antiapoptotic 26-kDa baltymą, turintį keturis įranga BH domenų (BH1 ~ BH4)) [15]. Tai gali trukdyti citochromo c išsiskyrimą iš mitochondrijų, todėl panaikinantis kaspazių aktyvavimo ir pagaliau slopina apoptozę [16]. Pasak pradžioje tyrimų metu BCL2 raiškos
diskai ląsteles į piktybinę transformaciją [17] ir prognozuoja daugelyje piktybinių navikų [18-22] prognozę. Ypač skrandžio vėžiu, dažnai išraiška iš BCL2
geno visada įvyko piktybinių audinių [23-25]. Aukštos raiškos lygiai BCL2 pervežimas geno, nors koreliuoti su mažiau agresijos skrandžio vėžio [26], turėjo daug padaryti su atsparumo vaistams nuo vėžio ląsteles [27].
BAX
(BCL2
susijęs X baltymas) genas yra žmogaus chromosomų regionas 19q13.3-q13.4 [28]. Jo 21-kDa kodavimas baltymų, visų pirma, tarnauja kaip proapoptotic nario BCL2
šeimos. BAX
baltymas susideda iš trijų BH srityse (BH1, BH2 ir BH3) ir dalijasi Homologijos daug su BCL2 pervežimas baltymų. Iš tiesų, Bax
baltymų veikia kaip BCL2
slopintuvas paspartinti Apoptozė ląstelių mirtį, formuojant BAX
/BCL2
kompleksus ar konkuruoti su kitais BCL2
tikslų [29]. Padidėjusi iš BAX
geno turėjo neigiamą poveikį ląstelių augimą žmogaus skrandžio vėžio, dėl to, kad apoptozės indukcija ir ląstelių chemosensitivity [30] priedo. Priešingai, slopinimas BAX
genų ekspresijos sukeltas tumorigenezei skrandžio epitelyje [23].
Cisplatinos yra chemoterapinio agento rūšies plačiai naudojamas kietų piktybinių navikų, įskaitant skrandžio vėžio. Visuotinai pripažįstama, kad pagrindinis jo citotoksinis poveikis yra DNR pažeidimai ir po indukcijos apoptozės [31], todėl dispersijos apoptozės susijusių genų cisplatinos paveiktų ląstelių penetratingly veidrodis mechanizmus, sukeliančius cisplatiną sukeltos apoptozės. Kaip mūsų tyrime CAC1
išraiška buvo aktyvinama cisplatinos gydymo, bet buvo labai downregulated iki siRNA gydymo, nepaisant ankstesnių cisplatina. Be to, grindžiama cisplatinos sukelta apoptozės padidinti, kad taip CAC1
triukšmo slopinimo sutapimą genų ekspresijos pokyčiai, įskaitant p53
ir BAX
ląstelę, taip pat į BCL2 downregulation.
Šie reiškiniai rodo, kad CAC1
stiprina cisplatiną sukeltos apoptozės moduliuoja BCL2
, BAX
ir P53
išraišką.
Kaip minėta anksčiau, BCL2
yra iš pažiūros įsikūręs vienu iš poros konvergencijos Apoptozinės keliai, o BCL2
santykis BAX
baltymų atrodo galutinis veiksnys, ar ląstelių patenka į vykdymo etapą [31]. Tiesą sakant, ji yra BCL2
/BAX
santykis, kuris reguliuoja ląstelių jautrumą apoptozės dirgiklius [32, 33]. Jeigu cisplatinos sukelta apoptozės procesą, CAC1
gali apsaugoti AGS ląsteles nuo apoptozės keičiant BCL2
/BAX
santykio CAC1
triukšmo slopinimo išvedė ryškus padidėjimas Bax
ir sumažėjimas BCL2
, kuri buvo palanki ląstelių apoptozės atsiradimo.
Įdomu tai, kad 53 psl
geno AGS ląstelių buvo aktyvinama su cisplatina gydymo, ypač su sinchroniniais slopinimo CAC1
. Ji yra gerai žinoma, kad P53
vaidina svarbų vaidmenį ląstelių ciklo ir apoptozės valdymo. DNR žalą, atsiradusią cisplatina gali paskatinti išraiška P53 pervežimas baltymas, tiek pasroviui P21 pervežimas baltymų ir G1 ląstelės ciklo areštas [34] išraiška. Jei susiduria su nepataisomą žalą DNR, p53
baltymų sukelia programuota ląstelių mirtis [31]. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Naudingumas nosį Ketaminas vartojant midazolamo atlikti skrandžio aspiratai vaikams: dvigubo aklo, placebu kontroliuojamų, randomizuotų studijų
• Asocijavosi su PTPN11 G /A polimorfizmo ne intronas 3 su Helicobactor pyloriseropositivity, skrandžio atrofija ir skrandžio vėžio Japanese