CDK-geassocieerde Cullin 1 kan celproliferatie bevorderen en remmen cisplatine geïnduceerde apoptose in de AGS maagkanker cel line

CDK-geassocieerde Cullin 1 kan celproliferatie bevorderen en remmen cisplatine geïnduceerde apoptose in de AGS maagkanker cellijn
Abstract
Achtergrond
Maagkanker is een veel voorkomende en zeer dodelijk maligniteit in de wereld, maar de pathogenese blijft ongrijpbaar. In deze studie richten we ons op de biologische functies van CDK-geassocieerde Cullin1 (CAC1
), een nieuw gen van de Cullin familie, bij maagkanker, die kunnen ons helpen om de oorsprong van deze maligniteit verder te begrijpen.
methodes Ondernemingen de AGS en MGC803 maagkanker cellijnen en de GES-1 maagslijmvlies cellijn werden geselecteerd voor de studie. In eerste instantie werden CAC1
uitingen van deze cellijnen onderzocht met behulp van kwantitatieve real-time reverse transcriptie polymerase chain reaction (qRT-PCR) en western blot examens, dan CAC1
kleine interfererende RNA (CAC1
-siRNA) werden ontworpen en getransfecteerd in de AGS-cellijn met een relatief hoog niveau van CAC1
. Zodra CAC1
stil, een reeks biologische kenmerken van AGS cellen zoals celproliferatie, celcyclus, apoptose en uitingen van apoptose-gerelateerde genen (P53
, BCL2 Kopen en BAX
) waren bepaald door MTT, flowcytometrie, qRT-PCR en Western blot, respectievelijk.
Resultaten
CAC1
expressie van AGS of MGC803 was veel hoger dan die van GES-1. Na CAC1
expressie effectief werd gedrukt door RNA interferentie in AGS-cellen, belangrijke celgroei remming voorgedaan. Bovendien is de hoeveelheid cellen behandeld met CAC1
-siRNA toegenomen in de G1 fase en nam in de S-fase, indicatief voor G1 celcyclus. Belangrijker is dat de verhouding van vroege /late apoptose in AGS cellen werden verrijkt met cis-diaminedichloroplatinum (cisplatine, CDDP) behandeling, maar in hogere mate met cisplatine plus CAC1
-siRNA. Interessant, BCL2
mRNA kopieën toonde een afname van 30% in de cisplatine-groep, maar daalde met ongeveer 60% in de plus cisplatine CAC1
-siRNA groep. Omgekeerd, de P53
mRNA expressies verkregen bijna een verdubbeling van de cisplatine-groep, naast een vijfvoudige toename van het cisplatina plus CAC1
-siRNA groep en de BAX
mRNA-niveaus hadden bijna een twee- en viervoudige vergroting, respectievelijk. Ondertussen, P53
, BAX Kopen en BCL2
vertoonde dezelfde verandering patronen in western blot examens.
Conclusies
CAC1
kunnen celproliferatie in de AGS maagkanker cellijn te promoten. Bovendien kan het voorkomen dat AGS cellen uit het ervaren van cisplatine geïnduceerde apoptose via modulatie van uitingen van P53
, BCL2
en BAX
.
Sleutelwoorden
Maagkanker CDK-geassocieerde Cullin1 celproliferatie cyclus Apoptosis Achtergrond
Maagkanker is een van de meest voorkomende kwaadaardige tumoren en de tweede belangrijkste oorzaak van kankersterfte in de wereld, die verantwoordelijk is voor een totaal van 989.600 nieuwe gevallen en 738.000 sterfgevallen per jaar [1]. De afgelopen jaren is er een gestage afname van de incidentie en mortaliteit risico op maagkanker in de meeste landen [2], vanwege de enorme ontwikkeling van diagnostiek en behandelingsmethoden. Echter, maagkanker blijft een grote bedreiging voor mensen, vooral in ontwikkelingslanden [1], en de overleving van alle getroffen patiënten, zelfs na curatieve chirurgische resectie en adjuvante therapie, is minder dan 40% [3].
Epidemiologic onderzoeken vele risicofactoren voor maagkanker blootgelegd en moleculair biologisch onderzoek blijkt verder dat maagkanker heeft talrijke genetische en epigenetische veranderingen, waarbij een cluster van oncogenen, tumorsuppressorgenen, celcyclus regulatoren, celadhesie moleculen en DNA repair genen [4] . Echter, de precieze mechanismen van maagkanker zijn niet goed gedefinieerd.
-CDK geassocieerd Cullin1 is een nieuw gen geïdentificeerd in colorectaal carcinoom. Het omvat een open leeskader omvat die een 37 kDa eiwit van 369 aminozuren [5] codeert. De CAC1
eiwit bevat een cullin domein tussen aminozuren 137 en 250, en wordt daarom geclassificeerd als een lid van de Cullin familie van E3 ubiquitine ligasen [5]. Histologische onderzoeken waren een mogelijke associatie van CAC1
expressie gelegd met pathologische en klinische stadia van colorectaal carcinoom patiënten [5]. Bovendien CAC1
in vitro
, werd uitgedrukt in een celcyclus-afhankelijke wijze met een hoge expressie in de late G1 S-fase [5]. Met name kan CAC1
celcyclus bevorderen en de kinaseactiviteit van CDK2
[5]. Toch is er weinig bekend over de expressie en biologische kenmerken bij maagkanker. Ondernemingen De huidige studie werd uitgevoerd om de expressie van CAC1
te onderzoeken en om de functie te ontdekken dat CAC1
presteert in maagcarcinoom cellijnen. De AGS-cellijn werd geselecteerd als model voor de studie, omdat het relatief hoge niveau van de CAC1
uitgedrukt, dan CAC1
expressie werd het zwijgen opgelegd door RNA interferentie (RNAi), en een reeks van biologische parameters voor celproliferatie relevant, cel cyclus en apoptose werden onderzocht, navenant.
Methods
Celkweek
menselijke maagkanker cellijnen (AGS en MGC803) en maagslijmvlies cellijn (GES-1) werden verstrekt door Centraal Laboratorium van de Medical College, Xi 'an Jiaotong University, China. Cellen werden gekweekt in RPMI 1640 medium (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) aangevuld met 10% pasgeboren kalfsserum (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 kU /L penicilline, 0,1 g /l streptomycine, 0,3 g /L L-glutamine en 0,85 g /l NaHCO 3 bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO 2.
siRNA transfectie
CAC1
-siRNA (sense GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT 3 ', antisense-5 ' UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG3 '), CAC1
negatieve controle siRNA (NC-siRNA, sense-5 'UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT 3 ', antisense-5 'ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3 ') werden chemisch gesynthetiseerd door Shanghai GenePharma Corporation (SGC, Shanghai, China). Alle siRNA werd gemengd in Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) en getransfecteerd volgens de siRNA transfectie protocol. De efficiëntie van CAC1
knockdown werd geëvalueerd met qRT-PCR en Western blot testen.
MTT assay
MTT (3- [4,5- dimethylthiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromide thiazolyl blue indicatorkleurstof) chemosensitivity assay werd op de proliferatiesnelheid van AGS maag cellen te bepalen. Cellen werden gezaaid bij een concentratie van 5 x 10 3 cellen per well in 96-wells platen. Alle experimenten werden uitgevoerd in drievoud. Cellen werden gedurende 24 uur en werden verdeeld in vijf groepen met vijf verschillende behandelingen (null, NC-siRNA (60 nmol /L (nM)), siRNA (30 nM), siRNA (60 nM), siRNA (90 nM)) voor 0, 24, 48, 72 en 96 uur, dienovereenkomstig. Twintig microliter van 5 mg /ml MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) werd per putje toegevoegd en de cellen bleven in de incubator gedurende nog 4 uur bij 37 ° C, gevolgd door de toevoeging van 150 ul DMSO. Absorptie van de gekleurde oplossing werd gemeten met behulp van een volledig geautomatiseerde multi-detectie microplaat reader (Polarstar OPTIMA, BMG Lab Technologies, Offenburg, Duitsland) bij 490 nm.
Flow cytometrische analyse
Cells (1 x 10 5 cellen /putje) werden geoogst in 6-well platen voor 24 uur, en werden behandeld met verschillende middelen (null, NC-siRNA, siRNA (60 nM)) gedurende 48 uur. Daarna werden ze opgevangen met 0,01 mol /L koude (4 ° C) PBS gewassen worden door het draaien bij 800 tpm, 4 ° C gedurende 8 minuten en daarna in 4 ° C, 75% ethanol gedurende een nacht vast. Gefixeerde cellen werden gecentrifugeerd (zoals hierboven) en opnieuw met PBS gewassen. Daarna werden cellen behandeld met 100 ul DNase-vrij, RNaseA (10 mg /ml) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Tenslotte werden cellen gekleurd met 100 ul van 100 ug /ml propidiumjodide (lichtgevoelige) en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Cellen van elk monster werden in Falcon buizen geplaatst en afgelezen op een FAC sorteerinrichting (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). De celcyclus profielen werden geïnterpreteerd B-D FAC Sorteren Cell Quest software.
Apoptose analyse
Cellen (1 x 10 5 cellen /putje) in 6-well platen werden geïncubeerd. Na 24 uur werden zij behandeld met verschillende middelen (null, cisplatine (10 uM), cisplatine (10 pM) + NC-siRNA (60 nM), cisplatine (10 pM) + siRNA (60 nM)) in serumvrij medium gedurende 24 uur, vervolgens verzameld werden de cellen gekleurd met Annexine V /PI behulp Vybrant apoptose testkit No. 2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) en geanalyseerd door flowcytometrie.
Kwantitatieve real-time reverse transcriptie PCR
Expression van CAC1 bij maagkanker cellijnen
Totaal RNA werd geïsoleerd uit verscheidene cellijnen (AGS, MGC803 en GES-1) met de zure guanidinium-fenol-chloroform methode (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, USA) en cDNA gesynthetiseerd met de PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). Primer die worden gebruikt voor de amplificatie werden ontworpen door Takara (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) en staat genoteerd als volgt: forward primer 5'-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; reverse primer 5'-CAT TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3 '. β-actine
voorwaartse primer 5'-TGG CCA CAC GCA CAA TGA A-3 '; reverse primer 5'CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A -3 '. Primers werden regelmatig PCR reacties met cDNA uit cellen teneinde hun juiste ontwerp en de synthese te evalueren. Vervolgens werden de PCR producten gesequenced en hun gelijkenis met de gewenste nucleotidesequenties bevestigd. De relatieve hoeveelheid mRNA werd bepaald volgens de SYBR Green PCR Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, California, USA) met genspecifieke primers voor CAC1 golfreizen of β-actine
. Alle stappen werden uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant uitgevoerd. Real-time PCR reacties werden uitgevoerd op een ABI 7500 thermal cycler uitgevoerd (Applied Biosystems, Foster City, Californië, USA) met de BioRad IQ5 en MyiQTM real-time PCR Detection System (BioRad Laboratories, Hercules, California, USA). Drie onafhankelijke PCR testen werden uit elk monster RT. De expressie van CAC1
mRNA in elk monster werd genormaliseerd tegen β-actine Kopen en het expressieniveau is bepaald met de ΔΔCT (delta delta drempelcyclus) methode.
Expressie van apoptose-gerelateerde genen in AGS cellijn
RNA-isolatie en cDNA-synthese werden uitgevoerd zoals aangegeven. Een reeks van primers werden ontworpen en gesynthetiseerd door Takara waaronder P53
(forward-5 '- CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3 ', reverse-5 '- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 '), BCL2
(forward-5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 ', reverse-5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), BAX
(forward-5 ' - GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 '; reverse-5 ' - AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ') en β-actine
(voorwaarts 5'-TGG CCA CAC GCA CAA TGA A-3 '; achteruit 5 '- CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A -3 ') genen. Zoals hierboven real-time PCR aangegeven werd drie keer uitgevoerd. De PCR-producten werden gedetecteerd door meting van de fluorescentie emitterende aan het einde van elke reactiecyclus. De drempelcyclus overeen met het aantal cycli nodig om een ​​fluorescentiesignaal boven de basislijn detecteren. De β-actine gen
diende als interne controle van de reactie. Ondernemingen De mRNA-expressieniveaus werden berekend met behulp van de 2 -ΔΔCT methode en uitgedrukt in relatieve kwantificatie eenheden. In detail, de drempel cycli van het huishoud-gen β-actine Kopen en de doelgenen
BCL2, BAX Kopen en P53
bepaald in elk monster en elke tijdsperiode. CT-waarden werden genormaliseerd (OCT) door het aftrekken van het expressieniveau van het referentiegen β-actine
van de overeenkomstige expressieniveaus van de BCL2
, BAX Kopen en P53
in elk monster. De genormaliseerde genexpressie in de behandelde AGS cellen werd geanalyseerd in verhouding tot hun bijpassende onbehandelde cellen, die optrad als kalibrator monsters (ΔΔCT).
Western blot examens
Vijftig microgram totale hoeveelheid eiwit uit de AGS cellijn werd gescheiden op een 10% Trisglycine SDS polyacrylamidegel en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan (BioRad, Hercules, California, USA). De blot werd onderzocht met muizen monoklonale antilichamen waaronder anti-CAC1
(GeneTex, Irvine, California, USA, 1: 1500), anti-β-actine
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 5000), anti-P53
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), anti-BCL2
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), en anti-BAX
(Santa Cruz, Californië , USA; 1: 2000). Antilichaambinding werd gedetecteerd met de gel Blot Imaging Systems (Syngene G BOX, Cambridge, UK). Volgens het protocol van de fabrikant
Statistische analyses Leer Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 13.0 software (http: //www -01. ibm. com /software /analytics /SPSS /). Elke bepaling werd ten minste drie keer uitgevoerd. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, en eenzijdige ANOVA-test (tweezijdig) werd uitgevoerd om de significantie van verschillen in meerdere vergelijkingen bepalen. De resultaten werden als statistisch significant beschouwd bij P Restaurant <zijn;. 0.05
Resultaten
differentiële expressie van CAC1
bij maagkanker en mucosale cellijnen
CAC1
mRNA expressie werd geëvalueerd met real-time RT-PCR in drie cellijnen. Uiteraard werd CAC1
uitgedrukt in alle onderzochte cellijnen (Figuur 1A). Echter, AGS en MGC803 cellijnen vertoonden hogere niveaus van CAC1
mRNA dan de GES-1 cellijn (1,0000 ± 0,0000 en 0,9507 ± 0,0176 versus
0,4340 ± 0,0414, P Restaurant < 0,05). Daarnaast CAC1
eiwitexpressie in western blot onderzoek toonde dezelfde veranderende trend als CAC1
mRNA (Figuur 1A). Figuur 1 CAC1 expressie in menselijke maagkanker en mucosale cellijnen. (A) Real-time reverse transcriptie (RT) -PCR en western blot analyse van CAC1
meningsuiting in AGS, MGC803 en GES-1 cellijnen (* staat P Restaurant < 0,05 tussen de GES-1-cellijn en andere cellijnen). (B) CAC1
expressie werd daadwerkelijk gedrukt door 60 nM CAC1
-siRNA in de AGS-cellijn op het mRNA en eiwit niveau (* staat P Restaurant < 0,05 tussen de controlegroep en de CAC1
-siRNA groep).
Endogene expressie van CAC1
werd het zwijgen opgelegd door de RNAi techniek
Kortstondige transfectie van AGS cellen met CAC1
-siRNA oligo's (60 nM) ontworpen tegen CAC1
sequentie effectief remde de uitdrukking van CAC1
. CAC1
mRNA-expressie werd onderzocht door real-time RT-PCR. Zoals verwacht, werd mRNA niveau van CAC1
aanzienlijk gedaald in CAC1
-siRNA groep (1,0000 ± 0,0000 versus
0,3583 ± 0,0244, P Restaurant < 0,05), maar toonde geen significant verschil tussen de controlegroep en NC-siRNA groepen (1,0000 ± 0,0000 versus
0,9597 ± 0,0407, P Restaurant > 0,05) (Figuur 1B). Ondertussen werd CAC1 eiwitexpressie ook depressief na siRNA behandeling in western blot examens (Figuur 1B).
CAC1
silencing remt celproliferatie in AGS cellijn
Met het oog op de rol CAC1
speelt in onderzoeken de regulatie van celproliferatie, AGS cellen door kortstondige transfectie aangesproken CAC1
-siRNA drie verschillende doseringen (30 nM, 60 nM en 90 nM) werden onderworpen aan MTT assay. Binnen vier dagen CAC1
silencing vertoonde een duidelijk remmend effect op celproliferatie volgens verschillende doses CAC1
-siRNA (figuur 2). Optische dichtheid (OD) in de controlegroep, de NC-siRNA groep en 30 nM CAC1
-siRNA groep toonde geen significant verschil met elkaar (P
> 0,05), maar hoger dan die van de 60 nM en 90 nM CAC1
-siRNA groepen (P Restaurant < 0,05). Interessant cellen behandeld met 60 nM en 90 nM CAC1
-siRNA bleek bijna identiek OD van het begin tot het einde (P
> 0,05). Figuur 2 celgroei werd geremd volgende CAC1 silencing. AGS-cellen werden tijdelijk met null, NC-siRNA en drie concentraties van CAC1
-siRNA respectievelijk vier dagen. Groeicijfers van de cellen werden bepaald door MTT assays.
Cell cycle analysis
In vergelijking met de controlegroep, het aandeel van de cellen behandeld met CAC1
-siRNA steeg met 28% of zo in de G1 /G0 fase (45,33 % ± 0,82% versus
73,23% ± 3,04%, P Restaurant < 0,05), en daalde met ongeveer 36% in de S-fase (41.07% ± 1,07% versus
5,40% ± 5,83%, P Restaurant < 0,05), met geen significante verandering in de G2 /M fase (13.61% ± 0,46% versus
21,37% ± 2,88%, P Restaurant > 0,05) (figuur 3). Deze resultaten geven aan dat CAC1
celcyclus progressie van AGS cellen kunnen bevorderen door de G1 /S transitie. Figuur 3 Knockdown van CAC1- geïnduceerde G1 celcyclus in de AGS cellijn. Celcyclus analyse van AGS cellen behandeld met of zonder CAC1
-specifieke siRNA door middel van flowcytometrie. Percentage cellen werd aanzienlijk verhoogd in de G1-fase, terwijl verlaagd de S-fase bij behandeling met CAC1
-siRNA (* staat P
< 0,05 tussen de controlegroep en de CAC1
-siRNA groep).
Knockdown van CAC1
verbetert cisplatine geïnduceerde apoptose
de AGS cellen werden verdeeld in vier experimentele groepen: de controle groep, de-cisplatine behandelde (10 uM) groep, de cisplatine plus NCsiRNA groep, en de cisplatine plus CAC1
-siRNA (60 nM) groep. In vergelijking met de controlegroep, waren de verhoudingen van vroege /late apoptose verbeterd met cisplatine behandeling, maar in hogere mate met cisplatine plus CAC1
-siRNA (2,01% ± 0,78% versus
8,87% ± 3,65% versus
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25% versus
3,89% ± 0,15% versus
10,01% ± 0,09%, P Restaurant < 0,05) (Figuur 4A en 4B), hetgeen betekende dat de knock-down van CAC1
drastisch versneld cisplatine geïnduceerde apoptose. Figuur 4 CAC1 silencing verhoogde cisplatine geïnduceerde apoptose in AGS cellijn. (A) De gevolgen van cisplatine alleen en in combinatie met NC-siRNA /CAC1
-siRNA op de vroege en late apoptose van AGS-cellen (* staat P Restaurant < 0,05 tussen de controlegroep en de behandelde groepen; #represents P Restaurant < 0,05 tussen de cisplatine (CDDP) groep en andere behandelde groepen). (B) Apoptose patronen AGS cellen werden geanalyseerd met stroomcytometrie.
Expressieprofielen van apoptose-gerelateerde genen Ondernemingen De mRNA-niveaus van CAC1
,
BCL2, BAX Kopen en P53
werden onderzocht door qRT-PCR. Incubatie van de AGS cellen met 10 uM cisplatine en /of 60 nM CAC1
-siRNA gedurende 24 uur deed produceren interessante mRNA profielen (figuur 5A). Onder cisplatine behandeling, CAC1
mRNA expressie sterk gestegen, maar gedaald tot een laag niveau wanneer CAC1
-siRNA gelijktijdig werd toegevoegd (1,0000 ± 0,0000 versus
2,1578 ± 0,2222 versus
0,3967 ± 0,0078, P
< 0,05). In vergelijking met de controlegroep, BCL2
mRNA kopieën vertoonde een daling van 30% in de cisplatine-groep, maar daalde met ongeveer 60% in de plus cisplatine CAC1
-siRNA groep (1,0000 ± 0,0000 versus
0,7090 ± 0,0210 versus
0,4030 ± 0,0171, P Restaurant < 0,05). Omgekeerd werden P53 Kopen en BAX
transcript niveaus van de behandelde groepen sterk verbeterd. In vergelijking met de controlegroep, de P53
expressie verkregen bijna een verdubbeling van de groep alleen cisplatin, naast een vijfvoudige toename van het cisplatina plus CAC1
-siRNA groep (1,0000 ± 0,0000 versus
3,0187 ± 0,1738 versus
5,9957 ± 0,3926, P Restaurant < 0,05); de BAX
mRNA had bijna een twee- en viervoudige vergroting (1,0000 ± 0,0000 versus
3,0237 ± 0,2581 versus
4,9897 ± 0,2923, P Restaurant < 0,05), respectievelijk. Figuur 5 expressieprofielen van apoptose-gerelateerde genen in reactie op cisplatine alleen of met CAC1 -siRNA behandelingen. (A) Real-time reverse transcriptie (RT) -PCR analyse van CAC1
, P53
, BAX Kopen en BCL2
mRNA expressie in AGS-cellen (* staat P Restaurant < 0,05 tussen CAC1
-siRNA groep en de behandelde groepen; #represents P Restaurant < 0,05 tussen de cisplatine (CDDP) groep en andere behandelde groepen). (B) Western blotting analyse van CAC1
, P53
, BCL2 Kopen en BAX
expressie in AGS-cellen.
Daarna werden western blot testen uitgevoerd om de eiwit niveaus van die genen na CAC1 detecteren
knockdown. Parallel met de voornoemde mRNA veranderingen werden BAX Kopen en P53
sterk opgereguleerd terwijl BCL2
werd neerwaarts gereguleerd op het eiwit niveau (Figuur 5B).
Discussie
De ubiquitine-proteasoom systeem speelt een sleutelrol voor het evenwicht tussen normale groei en ongecontroleerde proliferatie door regeling van de overvloed van een grote verscheidenheid van cellulaire eiwitten [6]. Cullin de familie van ubiquitine ligasen traditioneel uit CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5 en 7

vertegenwoordigt de grootste klasse van ringtype E3 ligasen (CRL) [6]. Zonder intrinsieke katalytische activiteit, cullins dienen als steigers dat de assemblage van multimere complexen E3 ligase vergemakkelijken en overdracht ubiquitine van het E2-conjugeren enzym aan het substraat. Cullin-gemedieerde afbraak substraat bepaalt een groot aantal cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie en apoptose. Zodra de cel regulerende mechanismen van Cullin ontmoeting storingen of verstoringen, zal accumulatie van oncoproteïnen of overmatige afbraak tumor suppressors onvermijdelijk optreden, die cellen in maligne transformatie en tumorvorming kunnen veroorzaken [6]. In het bijzonder cullin1
, de meest gekarakteriseerde lid van de Cullin familie, werd bewezen dat nauw worden betrokken bij de maag carcinogenese, en zijn overexpressie voorspelt een slechte prognose van patiënten met maagcarcinoom [6, 7]. Ondernemingen De expressie profielen kankergerelateerde genen gedeeltelijk geven hun biologische functies in de pathogenese van kanker. Omdat het een nieuw lid van de Cullin familie, hebben CAC1
expressie patronen uitgebreid onderzocht in een eerdere studie [5]. Gebruik cDNA analyse werd CAC1
expressie in normale maag, dunne darm, colon, lever, long, nier, spier, hart, borstklier, baarmoeder, hersenen, milt, lymfeklier, hoge niveaus in de colon en borstklier [5]. Western blot testen bovendien gedetecteerd CAC1
eiwit in een gastheer van normale en kanker cellijnen [5]. Met betrekking tot onze studie, de AGS en MGC803 maagkanker cellijnen hadden hogere CAC1
expressie dan de GES-1 maagslijmvlies cellijn, die aangeven dat CAC1
een actieve rol in de maag carcinogenese kunnen spelen.
Gene silencing door RNA interferentie is een krachtige methode voor het analyseren van genfunctie [8]. Hier hebben we met succes getransfecteerde NCsiRNA en drie concentraties van CAC1
-siRNA in AGS cellen. MTT analyses bleek dat de proliferatie potentieel krachtig AGS cellen werd geremd door 60 nM en 90 nM CAC1
-siRNA dezelfde mate, maar niet beïnvloed door 30 nM CAC1
-siRNA of NC-siRNA. Het was duidelijk dat CAC1
positief kunnen beïnvloeden celproliferatie bij maagkanker, die in overeenstemming met eerdere studies op de HeLa-cellijn [5]. In MTT onderzoeken, HeLa-cellen die vlag-CAC1
onderging hoger proliferatie vermogen dan de schijn-getransfecteerde controle cellen en cellen behandeld met CAC1
-siRNA toonden beduidend geremde groei [5]. Wat meer is, real-time RT-PCR en western blot analyses bevestigd dat de expressie van CAC1
krachtdadig werd geblokkeerd door 60 nM CAC1
-siRNA. Samengevat, werd 60 nM bepaald de meest geschikte experimentele dosis voor RNAi in volgende onderzoeken zijn.
het algemeen normale celproliferatie afhankelijk ordelijke en efficiënte celcyclus proces dat de duplicatie en overdracht van genetische informatie verzekert van de ene cel generatie naar de volgende. Met andere woorden, deregulering van celproliferatie ligt altijd in een abnormale celcyclus. Onder CAC1
-silencing voorwaarden, flowcytometrie in onze studie bleek verhoogde deel van de cellen in de G1 /G0 fase en een verlaagd tarief van cellen in de S-fase. In wezen CAC1
knockdown geïnduceerde G1 celcyclus arrestatie in de AGS cellen, die in overeenstemming met de resultaten van de HeLa cellijn [5]. CAC1
was ook in staat tot binding aan CDK2 Kopen en stimuleert het kinase activiteit op de G1 /S-fase overgang zonder aanzienlijk veranderen van de uitingen van cyclinA
, cycline
, cyclinD1
, CDK2
, RB
, PTEN
, en ga zo maar door [5]. Er wordt verondersteld dat CAC1
depressie vermindert de activiteit van CDK2 Kopen en onderbreekt de G1-S transitie.
Apoptose is één van de fundamentele biologische fenomenen gekenmerkt door een reeks transformaties celmorfologie [9]. Bovendien apoptose in overleg met celproliferatie vormt een cruciaal compensatiemechanisme dat een groot aantal fysiologische procedures zoals weefsel homeostase en normale ontwikkeling [9] beheert. Onder pathologische omstandigheden, afwijkende apoptose draagt ​​meestal veel aan de initiatie en progressie van kanker [10-12] en zelfs invloed hebben op de gevoeligheid van kankercellen therapeutische interventies [13]. Ondernemingen De eenduidige activiteit van CAC1
in celcyclus verordening gewezen op de mogelijkheid dat het min of meer, betrokken bij het proces van apoptose. In de huidige studie, het percentage vroege /late apoptotische cellen nam toe met cisplatine behandeling, maar nam nog meer wanneer CAC1
expressie gelijktijdig werd geremd door RNAi. Dat wil zeggen, apoptotische indices cisplatine plus CAC1
-siRNA groep verkregen van een aanzienlijke toename in vergelijking met die van de eerste drie groepen met intacte CAC1
. Gecumuleerde gegevens impliceren dat CAC1 of the anti-kanker effect van cisplatine kan verzwakken door het tegengaan van cisplatine geïnduceerde apoptose.
Verordening van apoptose, maar steunt op een netwerk van anti- en pro-apoptotische moleculen zoals BCL2
familie [14]. BCL2
(B-cel CLL /lymfoom 2) een proto-oncogen in het chromosomale gebied 18q21.3, dat codeert voor een antiapoptotic 26-kDa-eiwit met vier domeinen BH (BH1 ~ BH4)) [15]. Het kan de afgifte van cytochroom c verhinderen de mitochondria, daarmee intrekking van de activatie van caspases en uiteindelijk apoptose remmen [16]. Volgens de eerste studies, de overexpressie van BCL2
drijft cellen tegen maligne transformatie [17] en voorspelt de prognose in vele kwaadaardigheden [18-22]. Vooral bij maagkanker, frequente expressie van het BCL2
gen voorgedaan altijd in kwaadaardige weefsels [23-25]. Hoge expressie niveaus van de BCL2
gen, hoewel gecorreleerd met minder agressie van maagkanker [26], had veel te maken met resistentie tegen geneesmiddelen van de kankercellen [27].
BAX
(BCL2
geassocieerde X eiwit) gen in het humane chromosomaal gebied 19q13.3-q13.4 [28]. Het 21-kDa-eiwit codeert, in het bijzonder dient als een pro-apoptotisch lid van de BCL2 familie
. BAX
eiwit bestaat uit drie BH domeinen (BH1, BH2 en BH3) en deelt veel van homologie met de BCL2
eiwit. Inderdaad, BAX
eiwit fungeert als een onderdrukker van BCL2
om apoptotische celdood te versnellen, door het vormen van BAX Twitter /BCL2
complexen of door te concurreren met andere BCL2
doelstellingen [29]. Overexpressie van de BAX
gen een negatief effect op de celgroei in menselijke maagkanker, vanwege de inductie van apoptose en versterking van cel chemosensitivity [30]. Integendeel, onderdrukking van BAX
genexpressie geïnduceerde tumorvorming gastrische epitheel [23].
Cisplatine is een soort chemotherapeuticum schaal gebruikt in vaste tumoren inclusief maagkanker. Algemeen wordt aangenomen dat de primaire cytotoxische effect DNA schade en daaropvolgende inductie van apoptose [31], zodat afwijkingen van apoptose-geassocieerde genen in cisplatine behandelde cellen indringend weerspiegelen de onderliggende mechanismen cisplatine geïnduceerde apoptose. Als voor onze studie, werd CAC1
expressie opgereguleerd door cisplatine behandeling, maar was duidelijk neerwaarts gereguleerd door siRNA behandeling ondanks eerdere cisplatine. Bovendien onderliggende toename van cisplatine geïnduceerde apoptose die volgt CAC1
silencing zijn gelijktijdige genexpressie veranderingen waaronder de opregulatie van P53 Kopen en BAX
alsook de downregulatie van BCL2.
Deze effecten suggereren dat CAC1
versterkt cisplatine geïnduceerde apoptose door het moduleren van de expressie van BCL2
, BAX
en P53
.
Zoals eerder vermeld, BCL2
schijnbaar zich op de convergentie van een paar apoptoseroutes, en de verhouding van BCL2
aan BAX
eiwit blijkt de uiteindelijke determinant of een cel komt in de uitvoeringsfase [31] zijn. In feite is het BCL2
/BAX
verhouding die de gevoeligheid van cellen regelt op stimuli [32, 33] apoptotische. In het proces van cisplatine geïnduceerde apoptose, CAC1
zou beschermen AGS cellen van apoptose door het veranderen van BCL2 Twitter /BAX
ratio, voor CAC1
geluidsdemping bracht een uitgesproken toename van BAX
en een afname van BCL2
, die bevorderlijk zijn voor het optreden van apoptose was.
Interessant is dat de P53
gen in de AGS cellen opgereguleerd met cisplatine behandeling, vooral synchrone onderdrukking van CAC1
. Het is bekend dat p53
speelt een belangrijke rol bij het beheer van de celcyclus en apoptose. DNA schade door cisplatine kan expressie van het eiwit P53
zodanig dat zowel de expressie van downstream P21
eiwit en G1 celcyclus [34] stimuleren. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Nut van intranasale Ketamine en Midazolam aan maag zuigt uit te voeren bij kinderen: een dubbelblinde, placebo-gecontroleerde, gerandomiseerde studie
• Verenigingen van een PTPN11 G /A polymorfisme in intron 3 met Helicobactor pyloriseropositivity, maag-atrofie en maagkanker in het Japans