CDK povezano Cullin 1 lahko spodbujajo proliferacijo celic in zavirajo-cisplatin inducirano apoptozo v AGS želodčni rak celične linije

CDK povezano Cullin 1 lahko spodbujajo proliferacijo celic in zavirajo-cisplatin inducirano apoptozo v AGS želodčni rak celične linije
Abstract
Ozadje
raka želodca je pogost in zelo smrtonosna malignosti na svetu, vendar je njegova patogeneza ostanki nedosegljiva. V tej študiji smo se osredotočili na biološke funkcije CDK-povezano Cullin1 (CAC1
), nov gena cullin družine, raka želodca, ki nam lahko pomaga, da se zavedam, izvor tega malignosti.
metode
AGS in MGC803 želodčnih rakave celične linije in GES-1 želodčne sluznice celična linija so bile za študij izbrali. Sprva so bile CAC1
izrazi teh celičnih linijah pregledal kvantitativno realnem času reverzno transkripcijo verižne reakcije s polimerazo (QRT-PCR) in Western Blot preglede, nato pa CAC1
mala motečih RNA (CAC1
-siRNA) so bili zasnovani in transfektirali v celične linije AGS z relativno visoko stopnjo CAC1
. Ko je bil CAC1
utihnile, so niz bioloških lastnosti AGS celic, kot so celične proliferacije, celični cikel, apoptoza in prijavo v zvezi z apoptoze genov (P53
, BCL 2
in BAX
) s MTT določi citometrija, QRT-PCR in Western blot oz.
Rezultati
CAC1
izražanje AGS ali MGC803 je bila precej višja od GES-1. Potem ko je bil CAC1
izraz dejansko depresivni motnje RNA v AGS celicah, je prišlo do pomembnega zaviranja rasti celic. Poleg tega je delež celic, zdravljenih s CAC1
-siRNA poveča v G1 fazi in zmanjšana v fazi S, kaže prijetje G1 celičnega cikla. Še pomembneje je, so bili deleži zgodaj /pozno apoptoze v AGS celic, izboljšano s cis-diaminedichloroplatinum (cisplatin, CDDP) zdravljenja, vendar v večji meri s cisplatinom plus CAC1
-siRNA. Zanimivo je, BCL 2
mRNA kopije so pokazali približno 30% zmanjšanje v skupini cisplatina, ampak v cisplatinom plus CAC1
-siRNA skupine zmanjšala za približno 60%. Nasprotno, p53
mRNA izrazi dobimo skoraj dvakratno povečanje v skupini cisplatina, poleg petkratno povečanje cisplatinom plus CAC1
-siRNA skupine, in na Bax
ravni mRNA imel skoraj dvo- in štiri-krat Povečanje oz. Medtem, P53
, Bax
and BCL 2
pokazala enake sprememba vzorcev v Western Blot preiskav.
Sklepe
CAC1
lahko spodbudi proliferacijo celic v AGS želodčni rak celične linije. Poleg tega lahko prepreči AGS celice doživlja-cisplatin inducirano apoptozo preko znižano izražanje p53
, BCL 2
in Bax
.
Ključne besede
rak želodca CDK-povezan Cullin1 proliferacije celic apoptoze Ozadje
rak želodca je ena izmed najpogostejših malignih tumorjev, in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka na svetu, ki je odgovorna za skupno 989,600 novih primerov in 738,000 smrti letno [1]. V preteklih letih, je bil upad incidence in umrljivosti tveganje za raka želodca v večini držav [2], zaradi ogromno dogajanja v metodah diagnosticiranja in zdravljenja. Vendar pa je rak želodca ostaja velika grožnja za ljudi, še posebej tiste v državah v razvoju [1], in preživetje vseh prizadetih bolnikov, tudi po kurativno kirurški odstranitvi in ​​adjuvantno terapijo, ki je manjši od 40% [3].
Epidemiološke preiskave so odkrili številne dejavnike tveganja za raka želodca in raziskave molekularna biologija nadalje navaja, da v želodcu nastanek raka obsega številne genetske in epigenetski dogodkov, ki vključuje skupek onkogeni, zaviralnih genov, regulatorji celičnega ciklusa, celičnih adhezijskih molekul in popravljanja DNA genov [4] . Vendar pa natančne mehanizme osnovni raka želodca niso dobro opredeljene.
-CDK povezana Cullin1 je nov gen opredeljena v kolorektalnega raka. Zajema odprt bralni okvir sekvenco, ki kodira 37 kDa protein 369 aminokislin [5] kislin. CAC1
beljakovin vsebuje cullin domeno med aminokislinami 137 in 250, in se zato uvrsti kot član cullin družine E3 ubikvitinske ligaze [5]. Histološke preiskave je vzpostavila možno združenje CAC1
izražanja s patološkimi lastnostmi in kliničnih fazah bolnikov kolorektalnim karcinomom, [5]. Poleg tega CAC1
, vitro
, je bila izražena v celični cikel, odvisen način z visoko ekspresijo v poznem G1 v fazo S [5]. Predvsem bi CAC1
spodbujali napredovanje celičnega cikla in spodbujanje dejavnosti kinazno CDK2
[5]. Kljub temu je malo znanega o svojem izrazu in bioloških značilnosti pri bolnikih z rakom želodca.
Tej študiji je bila izvedena za preiskavo izraz CAC1
in raziskati funkcijo, ki CAC1
opravlja v želodcu karcinom celičnih linijah. Celično linijo AGS je bil izbran kot model za študij, saj je izražena relativno visoko stopnjo CAC1
, nato CAC1
izraz so utihnile s RNA interference (RNAi), in vrsto bioloških parametrov, pomembnih za celično proliferacijo celic so bili pregledani ciklus in apoptozo, ustrezno.
metode
celični kulturi
linije človekovih želodčni rak celic (AGS in MGC803) in želodčne celične linije sluznico (GES-1) so posredovali Centralnem laboratoriju Medical College, Xi 'an Jiaotong University, Kitajska. Celice smo kultivirali v RPMI 1640 medija (Gibco BRL, Grand Island, NY, ZDA), dopolnjenem z 10% novorojenčka telečjim serumom (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 ku /L penicilina, 0,1 g /L streptomicin, 0,3 g /L L-glutamin in 0,85 g /L NaHCO 3 pri 37 ° C v navlaženi atmosferi, ki vsebuje 5% CO 2.
siRNA transfekciji
CAC1
-siRNA (sense- GGA UGG UGC Čau AGA UCA ATT 3 "antisense-5 " UUG AUC UAU GGC AUC ACC CGG3 ), CAC1
negativna kontrola siRNA (NC-siRNA, občutek-5 "UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT 3 " antisense-5 "ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3 ) so kemično sintetizirane Shanghai GenePharma Corporation (SGC, Šanghaj, Kitajska). Vse siRNAs vmešamo v Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, ZDA) in transfektiramo po transfekciji protokola o siRNA. Učinkovitost CAC1
rasklapanje je bila ocenjena s QRT-PCR in zahodnih testov blot.
MTT test
MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolijev bromid tiazolil modra lučka barvilo) chemosensitivity test je bila uporabljena za določitev stopnje proliferacije AGS želodčnih celic. Celice smo zasejali v koncentraciji 5 x 10 3 celic na vdolbino na plošče s 96 vdolbinami. Vse poskuse smo izvedli v treh izvodih. Celice inkubiramo 24 ur in so bile razdeljene v pet skupin s petimi različnimi postopki (nična, NC-siRNA (60 nmol /L (nm)), siRNA (30 nm), siRNA (60 nm), siRNA (90nm)) 0, 24, 48, 72 in 96 ur, ustrezno. dodamo dvajset ul 5 mg /ml MTT (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, ZDA) v fosfatnim pufrom (PBS) na jamico in celice pustili notranjosti inkubatorja še 4 ure pri 37 ° C, čemur sledi dodajanje 150 ul DMSO. Absorbanca obarvane raztopine, merjene s popolnoma avtomatizirano multi-odkrivanje mikroploščnem bralcu (POLARstar OPTIMA, BMG Labtechnologies, Offenburg, Nemčija) pri 490 nm.
Pretoka citometrična analiza
celice (1 x 10 5 celice /jamico) smo zbrali v 6 vdolbinami za 24 ur, smo obdelali z različnimi sredstvi (nična, NC-siRNA, siRNA (60 nm)) za 48 ur. Nato so bili zbrani za speremo z 0,01 mol /L hladnem (4 ° C), PBS, ki ga vrti pri 800 vrtljajih na minuto, 4 ° C 8 minut, in nato fiksna pri 4 ° C, 75% etanola za eno noč. Fiksne celice smo centrifugirali (kot zgoraj) in jo ponovno sprali s PBS. Nato smo celice obdelali s 100 ul v DNaze brez, RNaseA (10 mg /ml) in inkubirali pri 37 ° C za 10 minut. Končno smo celice obarvali z 100 ul od 100 mg /ml propidijevim jodidom (svetlobno občutljiva) in inkubirali pri sobni temperaturi 30 minut. Celice iz vsakega vzorca so bili dani v Falcon cevi in ​​berejo na FAC sorter (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, ZDA). profili celičnega cikla so obrazložene z B-D FAC Razvrsti Cell Quest programske opreme.
apoptoze analizo
celice (1 x 10 5 celic /vdolbinico), inkubiramo v 6 vdolbinami. Po 24 urah so bili obravnavani z različnimi sredstvi (nična, cisplatin (10 um), cisplatin (10 pM) + NC-siRNA (60 nm), cisplatin (10 pM) + siRNA (60 nm)) v mediju za 24 seruma ur, nato zbrane celice obarvamo z aneksinom v /PI uporabo Vybrant apoptoza preizkusnega kompleta No. 2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, ZDA) in analizirali s pretočnim citometrom.
Kvantitativna realnem času reverzno transkripcijo PCR
Expression od CAC1 želodčnega raka celičnih linijah
Celotna RNA smo izolirali iz različnih celičnih linij (AGS, MGC803 in GES-1) po metodi kislina gvanidin-fenol-kloroform (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, ZDA), in so bili sintetizirani cDNA z PrimeScriptTM 1. Sklop cDNA zbirno Kit (Invitrogen, Carlsbad, ZDA). Primer zaporedja, ki se uporabljajo za ojačanje je oblikoval Takara (Takara Bio Inc., Shiga, Japonska) in naštete, kakor sledi: naprej primer 5'-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; reverse primer 5'-CAT TTA CAG SCT AAT GCC TTT ACT-3 ". P-aktina
naprej primer 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA -3 "; reverse primer 5'- CTA AGT CAT AGT CCG SCT AGA AGC -3 ". Primerji so bili uporabljeni v rednih PCR reakcije s cDNA iz celic, tako da ocenijo njihovo pravilno oblikovanje in sintezo. Nato so bili PCR produkti sekvencirali in njihovo podobnost z želenimi nukleotidnih zaporedij potrjena. Relativna višina mRNA je bila določena z SYBR GREEN PCR Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, ZDA) z gensko specifičnimi primerji za CAC1
ali beta-aktina
. Vsi ukrepi so bili izvedeni v skladu s protokolom proizvajalca. V realnem času PCR reakcije so bile izvedene na ABI 7500 toplotno ciklerja (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, ZDA), z BioRad iQ5 in sistem MyiQTM Real-time PCR Detection (BioRad Laboratories, Hercules, California, ZDA). Tri neodvisne teste PCR smo izvedli iz vsakega vzorca RT. Izraz CAC1
mRNA v vsakem vzorcu je normaliziral proti beta-aktin
in nivo izražanja je bila izračunana s pomočjo ΔΔCT (delta prag delta cikel) metoda.
Expression, povezanih z apoptoze genov v celične linije AGS
RNA izolacija in cDNA sintezo smo izvedli, kot je navedeno. Niz primerji so bili oblikovani in sintetizirali Takara vključno P53
(naprej-5 '- CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3 "reverse-5 ' - AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 ), BCL 2
(forward-5 '- CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 "reverse-5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 ), BAX
(forward-5 '- GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 "reverse-5 ' - AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ') in β-aktina
(naprej 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 "reverse 5 ' - CTA AGT CAT AGT CCG SCT AGA AGC -3 ) geni. Kot je navedeno v realnem času PCR izvedena trikrat. PCR produkt smo zaznali z merjenjem oddajajo fluorescence ob koncu vsakega reakcijskega cikla. Prag cikel ustreza številu ciklov, potrebnih za zaznavanje fluorescence signala nad izhodiščem. V P-aktina
gen služil kot notranji nadzor reakcije.
Nivoji mRNA izraz so bili izračunani s pomočjo -ΔΔCT metode 2 in so izraženi relativno kvantifikacijo enotah. Natančneje, so cikli praga za gospodinjstvo genske beta-aktina
in ciljne geni BCL 2
, BAX
in P53
določena v vsak vzorec in za vsako časovno obdobje. Vrednosti CT smo normalizirali (ΔCT) z odštevanjem vrednosti izraz referenčnega gena za β-aktin
iz ustreznih ravneh izraz BCL 2
, BAX
in P53
v vsakem vzorcu. Normalizirana izražanje genov v tretiranih AGS celic smo analizirali glede na njihovo ujemanje neobdelano celic, ki so delovali kot vzorce kalibrator (ΔΔCT).
Western Blot pregledi
petdeset mikrogramov celotnega proteina iz celične linije AGS ločimo na 10% Trisglycine SDS Poliakrilamidni gel in prenesli na nitrocelulozno membrano (BioRad, Hercules, California, ZDA). Lisa je skeniran z mišjimi monoklonskimi protitelesi, vključno z anti-CAC1
(GeneTex, Irvine, Kalifornija, ZDA, 1: 1500), anti-P-aktina
(Santa Cruz, Kalifornija, ZDA, 1: 5000), anti-P53
(santa Cruz, Kalifornija, ZDA, 1: 2000), anti-BCL 2
(santa Cruz, Kalifornija, ZDA, 1: 2000), in anti-BAX
(santa Cruz, CA , ZDA; 1: 2000). Protitelesa vezavo je bila odkrita s pomočjo gela popivnamo Imaging Systems (Syngene G: BOX, Cambridge, Velika Britanija). V skladu s Protokolom proizvajalca
Statistične analize
Vse statistične analize smo opravili z uporabo SPSS 13.0 programske opreme (http: //www -01. ibm. com /software /analytics /SPSS /). Vsak test je bil izveden vsaj trikrat. Podatki so bili izraženi kot povprečne ± standardni odklon, in enosmerna testom ANOVA (obojestransko) je bila izvedena za določitev pomembnosti razlik v več primerjav. Rezultati naj bi bile statistično značilne pri P
. ≪ 0,05
Rezultati
razlika izražanje CAC1
v želodcu raka in sluznice celičnih linij
je CAC1
ekspresijo mRNA ocenjenih z realnem času RT-PCR v treh celičnih linijah. Očitno je, da je bil CAC1
izražen v vsaki od obravnavanih celičnih linij (slika 1A). Vendar AGS in MGC803 celične linije so pokazali višje nivoje CAC1
mRNA kot celične linije GES-1 (1,0000 ± 0,0000 in 0,9507 ± 0,0176 v primerjavi
0,4340 ± 0,0414, P
< 0,05). Poleg tega CAC1
protein izraz v Western Blot preiskav so pokazali enako spreminjajoče trend kot CAC1
mRNA (slika 1A). Slika 1 CAC1 ekspresijo v humanih želodčnih raka in sluznice celičnih linij. (A) v realnem času reverzne transkripcije (RT) -PCR in zahodne analiza prepivek CAC1
izražanja v AGS, MGC803 in ges-1 celičnih linijah (* predstavlja P
&0.05 med celične linije GES-1 in druge celične linije). (B) CAC1
izraz je dejansko znižale s 60 nm CAC1
-siRNA v skladu AGS celic na mRNA in na ravni proteinov (* pomeni P
< 0,05 med kontrolni skupini in CAC1
-siRNA skupina).
endogenih izražanje CAC1
so utihnile s tehniko RNAi
prehodna transfekciji od AGS celic z CAC1
-siRNA oligo (60 nm), namenjen proti CAC1
zaporedja učinkovito ustavili izraz CAC1
. CAC1
mRNA izraz je pregledal v realnem času RT-PCR. Kot je bilo pričakovati, se je raven mRNA CAC1
občutno zmanjšalo v CAC1
skupini -siRNA (1.0000 ± 0,0000 v primerjavi
0,3583 ± 0,0244, P
< 0,05), vendar pa ni pokazala pomembne razlike med nadzorom in NC-siRNA skupine (1,0000 ± 0,0000 v primerjavi
0,9597 ± 0,0407, P
> 0,05) (slika 1B). Medtem pa je CAC1 protein izraz depresivni tudi po zdravljenju siRNA v Western Blot preiskav (slika 1B).
CAC1
utišanje zavira celično proliferacijo v celične linije AGS
Da bi raziskali CAC1 vlogo
igra v ureditev celične proliferacije, so AGS celice, ki jih prehodna transfekciji naslovljena z CAC1
-siRNA treh različnih odmerkih (30 nm, 60 nm in 90nm) izpostavljen MTT testom. V štirih dneh CAC1
utišanje razstavljen izrazito zaviralni učinek na celično proliferacijo po različnih doz CAC1
-siRNA (slika 2). Optične gostote (ODS), v kontrolni skupini, skupina NC-siRNA in v 30 nm CAC1
skupina -siRNA ni pokazala pomembne razlike s seboj (P
> 0,05), vendar pa so bile višje od tistih na 60 nm in 90nm CAC1
-siRNA skupine (P
< 0,05). Zanimivo je, da celice, ki se zdravijo z 60 nm in 90nm CAC1
-siRNA pokazala skoraj enako ODS od začetka do konca (P
> 0,05). Slika 2 Rast celic je bilo zavrto naslednje CAC1 utišanja. AGS celice so bile prehodno transfekciji s null, NC-siRNA in tri koncentracije CAC1
-siRNA za štiri dni, v tem zaporedju. Stopnje rasti celic smo določili z MTT teste.
analiza Celični ciklus
primerjavi s kontrolo, je delež celic, ki so se zdravili z CAC1
-siRNA povečala za 28% ali tako v G1 /G0 fazi (45.33 % ± 0,82% v primerjavi z
73.23% ± 3,04%, P
< 0,05), in v fazi s zmanjšale za približno 36% (41,07% ± 1,07%, v primerjavi
5,40% ± 5,83%, P
< 0,05), brez pomembne spremembe v G2 /M fazi (13,61% ± 0,46%, v primerjavi z
21,37% ± 2,88%, P
> 0,05) (slika 3). Ti rezultati kažejo, da lahko CAC1
spodbuja napredovanje celičnega cikla AGS celic skozi G1 /S prehoda. Slika 3 rasklapanje od CAC1- povzroča G1 ustavitev celičnega cikla v celične linije AGS. Analiza Cell cikel AGS celic, ki so se zdravili z ali brez CAC1
-specifična siRNA ga citometrije toka. Delež celic smo izrazito povišano faze G1, medtem ko zmanjša v fazi S ko obdelamo z CAC1
-siRNA (* predstavlja P
< 0,05 med kontrolni skupini in CAC1
skupine -siRNA).
rasklapanje od CAC1
povečuje-cisplatin inducirano apoptozo
AGS celice so bile razdeljene v štiri poskusnih skupin: kontrolna skupina,-cisplatin obdelan (10 LM) v skupini je cisplatin plus skupine NCsiRNA in cisplatin plus CAC1
-siRNA (60 nm) skupina. V primerjavi s kontrolno skupino, so bili deleži zgodaj /pozno apoptoze okrepljeno s cisplatinom zdravljenja, vendar v večji meri s cisplatinom plus CAC1
-siRNA (2,01% ± 0,78% v primerjavi z
8,87% ± 3,65%, v primerjavi z
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25%, v primerjavi z
3,89% ± 0,15% v primerjavi z
10,01% ± 0,09%, P
< 0,05) (slika 4A in 4B), ki je pomenil, da je rasklapanje za CAC1
dramatično povečala, cisplatin inducirano apoptozo. Slika 4 CAC1 utišanje izboljšani cisplatin inducirano apoptozo v celične linije AGS. (A) Učinki cisplatinom sam in v kombinaciji z NC-siRNA /CAC1
-siRNA na zgodnje in pozne apoptozo AGS celic (* pomeni P
< 0,05 med kontrolno skupino in tretiranih skupinah; #represents P
< 0,05 med cisplatin (CDDP) skupine in druga zdravljenih skupinah). (B) apoptoza vzorce AGS celic smo analizirali s pretočnim citometrom.
Ekspresivnih profilov, povezanih z apoptoze genov
Raven mRNA iz CAC1
, BCL 2
, BAX
in p53
so bile pregledane s QRT-PCR. Inkubacija od AGS celic z 10 mikrometrov cisplatinom in /ali 60 nm CAC1
-siRNA 24 ur naredil izdelavo zanimive profile mRNA (slika 5a). Pri zdravljenju s cisplatinom, CAC1
mRNA izraz močno povečalo, vendar je padla na nizki ravni, ko je CAC1
-siRNA dodane hkrati (1.0000 ± 0,0000 v primerjavi
2,1578 ± 0,2222 v primerjavi
0,3967 ± 0,0078, p
< 0,05). V primerjavi s kontrolno skupino, BCL 2
mRNA izvodov je pokazala 30% zmanjšanje v skupini cisplatina, ampak v cisplatinom plus CAC1
-siRNA skupina (1,0000 ± 0,0000 v primerjavi
0,7090 ± 0,0210 padla za okoli 60% versus
0,4030 ± 0,0171, P
< 0,05). Nasprotno pa so bili P53
in Bax
ravni prepisovali tretiranih skupin močno izboljšan. V primerjavi s kontrolno skupino, P53
izražanja pridobljene skoraj dvakratno povečanje v samo skupino cisplatina, poleg petkratno povečanje cisplatinom plus CAC1
-siRNA skupine (1,0000 ± 0,0000 v primerjavi z
3,0187 ± 0,1738 v primerjavi
5,9957 ± 0,3926, P
< 0,05); na Bax
ravni mRNA imel skoraj dvo- in štiri-krat bogatenja (1,0000 ± 0,0000 v primerjavi
3,0237 ± 0,2581 v primerjavi
4,9897 ± 0,2923, P
< 0,05), oz. Slika 5 Expression profili, povezanih z apoptoze genov v odzivu na cisplatinom samim ali s CAC1 -siRNA zdravljenja. (A) v realnem času reverzno transkripcijo (RT) analizo -PCR za CAC1
, P53
, BAX
in BCL 2
mRNA izraz v AGS celic (* pomeni P
< 0,05 med CAC1
skupina -siRNA in tretiranih skupinah; #represents P
< 0,05 med cisplatinom (CDDP) skupine in drugih tretiranih skupinah). (B) Western blot analizo CAC1
, P53
, BCL 2
in Bax
izražanja v AGS celicah.
Nato so izvedli zahodni testi blot za odkrivanje raven beljakovin teh genov po CAC1
rasklapanje. Vzporedno z omenjenimi spremembami mRNA, so BAX
in P53
izrazito molekul ker BCL 2
je navzdol reguliranih na ravni proteina (slika 5B).
Razprava
ubikvitina-proteasoma sistema igra ključno vlogo pri ohranjanju ravnotežja med normalno rast in nenadzorovanega širjenja, ki jih nadzoruje obilo veliko različnih celičnih proteinov [6]. Cullin družina ubikvitina ligaze, običajno sestavljene iz CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5
in 7
, predstavlja največji razred RING tipa E3 ligaze (CRL) [6]. Brez notranje katalitske aktivnosti, cullins služijo kot odrov, ki omogočajo sestavljanje multimeričnih E3 ligaza kompleksov in prenos ubikvitina iz E2-konjugiranje encima do substrata. Cullin posredovano razgradnja substrata narekuje številne celične procese, kot so proliferacije, diferenciacije in apoptoze. Ko regulatornih mehanizmov celične cullin srečujejo okvar ali motenj, bo neizogibno pride do kopičenja oncoproteins ali prekomerno degradacijo tumorskih razbijal, ki lahko povzročijo celic v maligno transformacijo in tumorigeneze [6]. Še posebej, cullin1
, najbolj značilna član cullin družine, je bilo dokazano, da je treba tesno povezana z želodčno rakotvornosti ter njegovo prekomerno napoveduje slabo prognozo bolnikov z želodčnega raka [6, 7].
Profile izražanja povezanih z rakom genov delno odražajo njihove biološke funkcije v patogenezi raka. Kot nov član družine cullin, CAC1
izraz vzorci so bili temeljito raziskan v prejšnji raziskavi [5]. Uporabi cDNA knjižnica analizo smo CAC1
izraz najdemo v normalnem želodcu, tankega črevesa, debelega črevesa, jeter, pljuč, ledvic, mišic, srca, mlečnih žlezah, maternice, možgani, vranica, bezgavke, z visokimi koncentracijami v debelem črevesu in mlečna žleza [5]. Zahodni testi blot dodatno zazna CAC1
beljakovin v množico normalnih in rakavih celičnih linijah [5]. Glede na naše raziskave, so imeli AGS in MGC803 želodčnih rakave celične linije visokošolskega CAC1
izraz kot GES-1 želodčne sluznice celične linije, ki označuje, da lahko CAC1
igrajo aktivno vlogo v želodcu rakotvornost.
Gene za dušenje zvoka, ki ga RNA interference je učinkovita metoda za analizo funkcije genov [8]. Tukaj smo uspešno transfektirali NCsiRNA in tri koncentracije CAC1
-siRNA v Moodle AGS celic. MTT analize so pokazale, da je potencial širjenje AGS celic močno zavira 60 nm in 90nm CAC1
-siRNA v enakem obsegu, vendar ni vplivala 30 nm CAC1
-siRNA ali NC-siRNA. Bilo je jasno, da bi CAC1
pozitivno vpliva na proliferacijo celic pri raku želodca, ki je bil v soglasju s prejšnjimi študijami na celični liniji HeLa [5]. V MTT pregledih, HeLa celice, ki izražajo Flag-CAC1
doživela večjo sposobnost širjenja jedrskega orožja, kot modelnih transfekcije kontrolnih celic in celice, ki se zdravijo z CAC1
-siRNA pokazala močno inhibirana rast [5]. Še več, v realnem času RT-PCR in western blot analiz so potrdili, da je bil izraz CAC1
učinkovitega blokiral 60 nm CAC1
-siRNA. V celoti gledano, je bila 60 nm ugotovljeno, da je najbolj primeren eksperimentalni odmerek za RNAi v nadaljnjih preiskavah.
Kot splošno pravilo, normalno proliferacijo celic je odvisna od postopka pravilen in učinkovit celičnega cikla, ki zagotavlja podvajanje in prenos genetske informacije iz ene celice generacije v generacijo. Z drugimi besedami, deregulacija proliferacije celic vedno leži v ciklu nenormalne celične. Pod CAC1
-silencing pogoji, citometrija v naši raziskavi pokazala povišan delež celic v G1 /G0 fazi in nižjo stopnjo celic v fazi S. V bistvu, CAC1
rasklapanje povzroča zastoj G1 celični cikel v AGS celic, ki je bil v skladu z rezultati iz celične linije HeLa [5]. CAC1
je bil tudi sposoben vezave na CDK2
in pospešuje njegovo kinaze v G1 /S faznega prehoda, ne da bi bistveno spremenili izraze cyclinA
, cyclinE
, cyclinD1
, CDK2
RB
, PTEN
, in tako naprej [5]. To naj da CAC1
depresija oslabi aktivnost CDK2
in prekinja G1-S prehoda v.
Apoptoza je eden od osnovnega biološkega pojavov označen s serijo transformacij v celično morfologijo [9]. Poleg tega apoptozo v soglasju s proliferacijo celic predstavlja ključno za uravnoteženje mehanizem, ki upravlja številne fiziološke postopkov, kot so tkivni homeostaze in normalnega razvoja [9]. Pod patoloških okoliščinah, zmotna apoptoza ponavadi veliko prispeva k uvedbi in napredovanje raka [10-12] in celo vplivajo na občutljivost rakavih celic terapevtskih posegov [13].
Nedvoumno dejavnost CAC1
v celični cikel uredba omenila možnost, da je bolj ali manj, ki sodeluje v procesu apoptoze. V sedanji raziskavi je delež zgodnjih /poznih apoptotskih celic povečala s cisplatinom zdravljenje, povečal pa še toliko bolj, ko je CAC1
izraz hkrati zavira RNAi. To se pravi, apoptotske indeksi cisplatinom plus CAC1
skupine -siRNA pridobil znatno povečanje v primerjavi s tistimi iz prejšnjih treh skupin z nepoškodovanim CAC1
. Zbirni podatki kažejo, da lahko CAC1
oslabi učinek proti raku cisplatina s preprečevanjem-cisplatin inducirano apoptozo.
Uredba apoptoze, pa se zanaša na mrežo anti- in proapoptotičnih molekul, kot so BCL 2
družine [14]. BCL 2
(B celic KLL /limfom 2) je proto-onkogena nahaja v kromosomskih regiji 18q21.3 je, ki kodira za antiapoptotic 26-kDa proteina, ki vsebuje štiri BH domen (BH1 ~ BH4)) [15]. To lahko ovira sproščanje citokroma c iz mitohondrijev, kar razveljavitvi aktivacije kaspaze in na koncu inhibira apoptozo [16]. Po prvih raziskavah, prevelike količine BCL 2
vozi celice proti maligno transformacijo [17], in napoveduje, da bo napoved v številnih malignih bolezni [18-22]. Še posebej pri raku želodca, pogost izraz v BCL 2
gena vedno se je pojavila pri malignih tkivih [23-25]. Visoke stopnje izraženosti gena BCL 2
, čeprav korelaciji z manj agresivnosti raka na želodcu [26], je imela veliko opraviti z odpornosti na zdravilo rakavih celic [27].
BAX
(BCL 2
povezano X protein) gen se nahaja v človeškem kromosomsko regijo 19q13.3-q13.4 [28]. Njegov 21-kDa kodiranje proteina, predvsem služi kot proapoptotičnih člana družine BCL 2
. BAX
protein je sestavljen iz treh BH domen (BH1, BH2 in BH3) in delnice veliko homologije z BCL 2
protein. Dejansko Bax
beljakovinski deluje kot supresorski od BCL 2
za pospešitev apoptotske celične smrti, ki jo tvorijo Bax
/BCL 2
kompleksov ali tekmujejo z drugimi cilji BCL 2
[29]. Čezmerno na Bax
gena, je negativno vplivala na rast celic pri raku človeškega želodca, zaradi indukcije apoptoze in izboljšanje celične chemosensitivity [30]. Nasprotno, zatiranje Bax
genske ekspresije inducirane tumorigeneze v želodcu epitela [23].
Cisplatin je neke vrste kemoterapevtika pogosto uporablja v solidne tumorje, vključno z rakom želodca. Na splošno velja, da je njen glavni citotoksični učinek poškodbe DNK in posledično indukcija apoptoze [31], tako variance-apoptoze, povezanih genov v cisplatina zdraviti celicah penetratingly ogledalo mehanizme, ki podpirajo-cisplatin inducirano apoptozo. Kot je za našo raziskavo, je bila CAC1
izražanje molekul s cisplatinom zdravljenje, kljub predhodnim cisplatinom je izrazito navzdol reguliranih z obdelavo siRNA. Poleg tega temelji povečanje-cisplatinom inducirane apoptoze, ki sledi CAC1
utišanje so sočasno uporabo genske izraz spremembe, vključno z uravnavanjem p53
in BAX
kot tudi downregulation od BCL 2.
Ti učinki kažejo, da CAC1
krepi-cisplatin inducirano apoptozo s spreminjanjem izražanje BCL 2
, Bax
in p53
.
Kot je bilo že omenjeno, BCL 2
se navidezno nahaja na konvergenco nekaj apoptotske poti, in razmerje BCL 2
za Bax
beljakovin zdi, da je končno odločilno, ali celica preide v fazo izvedbe [31]. Dejstvo je, da je BCL 2
/BAX
razmerje, ki ureja občutljivost celic za apoptotskih dražljaje [32, 33]. V procesu, cisplatinom inducirane apoptoze, CAC1
bi zaščitili AGS celice pred apoptozo s spreminjanjem BCL 2
/BAX
razmerje, za CAC1
utišanje iznese izrazito povečanje BAX
in zmanjšanje BCL 2
, kar je ugodno za pojav celične apoptoze.
Zanimivo je, da je P53
gen v AGS celic, molekul z zdravljenjem s cisplatinom, še posebej s sinhronim zatiranje CAC1
. Znano je, da P53
igra pomembno vlogo pri upravljanju celičnega cikla in apoptoze. poškodbe DNA, ki izhajajo iz cisplatinom lahko spodbujajo izražanje p53
protein, ki povzroči tako izražanje nadaljnjega P21
beljakovin in G1 ustavitev celičnega cikla [34]. Če se soočajo z nepopravljivo škodo DNK je P53
beljakovin sproži celično smrt programirano [31]. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Uporabnost intranazalno ketamin in Midazolam opravljati želodčne posrka pri otrocih: dvojno slepa, s placebom kontrolirana, randomizirana study
• Združenja za PTPN11 G /A polimorfizma na introna 3 z Helicobactor pyloriseropositivity, želodčne atrofije in raka želodca v Japanese