CDK-ассоциированной Каллин 1 может способствовать пролиферации клеток и ингибировать цисплатин-индуцированного апоптоза в АГС клетку рака желудка line

CDK-ассоциированной Cullin 1 может способствовать пролиферации клеток и ингибировать цисплатин-индуцированного апоптоза в желудочном линии клеток рака AGS
абстрактную <бр> фон
рак желудка является распространенным и весьма смертельны злокачественности в мире, но ее патогенез остается неуловимым. В данном исследовании мы обратили внимание на биологические функции CDK-ассоциированного Cullin1 (CAC1
), нового гена Cullin семьи, при раке желудка, которые могут помочь нам глубже понять происхождение этой злокачественной опухоли.
Методы
АГС и MGC803 желудка клеточных линий рака и желудка линии клеток слизистой оболочки ГЭС-1, были отобраны для исследования. Во-первых, CAC1
выражения этих клеточных линий были изучены с помощью количественной реальном времени с обратной транскрипцией полимеразной цепной реакции (QRT-PCR) и Вестерн-блот-обследования, а затем CAC1
малых интерферирующих РНК (CAC1
-siRNA) были разработаны и трансфицировали в клеточную линию AGS с относительно высоким уровнем CAC1
. После того, как CAC1
был подавлен, ряд биологических характеристик AGS клеток, таких как пролиферацию клеток, клеточный цикл, апоптоз и экспрессии генов связанных с апоптозом (Р53
, BCL2
и Вах
) были определяется МТТ, проточной цитометрии, QRT-PCR и вестерн-блот, соответственно.
Результаты
CAC1
выражение АГС или MGC803 была намного выше, чем у ГЭС-1. После того, как CAC1
выражение эффективно подавлен РНК-интерференции в клетках AGS, произошло значительное торможение роста клеток. Кроме того, доля клеток, обработанных CAC1
-siRNA увеличилось в фазе G1 и уменьшается в фазе S, что указывает на арест G1 клеточного цикла. Что еще более важно, пропорции раннего /позднего апоптоза в клетках AGS усиливались с цис-diaminedichloroplatinum лечения (цисплатин, ЦДДП), но в большей степени, с цисплатином плюс CAC1
-siRNA. Интересно, что BCL2
копии мРНК показали о снижении в группе цисплатин 30%, но снизился на 60% в цисплатин плюс CAC1
-siRNA группы. С другой стороны, P53
выражения мРНК получают почти двукратное увеличение в группе цисплатин, в дополнение к пятикратному увеличению цисплатин плюс CAC1
-siRNA группу, а Вах
уровни мРНК были почти двух- и четырехкратное увеличение, соответственно. В то же время, P53
, Вах
и BCL2
показали те же закономерности изменения в вестерн-блот экзаменов.
Выводы
CAC1
может способствовать пролиферации клеток в желудке линии раковых клеток AGS. Кроме того, он может предотвратить клетки AGS испытывать цисплатин-индуцированного апоптоза с помощью модулирования выражения Р53
, BCL2
и Вах
.
Ключевые слова
рак желудка CDK-ассоциированного Cullin1 клеточной пролиферации цикла Апоптоз фона
рак желудка является одним из наиболее распространенных злокачественных опухолей и второй ведущей причиной смерти от рака в мире, отвечает за общую сумму 989,600 новых случаев и 738,000 смертей в год [1]. За последние годы наблюдается устойчивое снижение заболеваемости и смертности риск развития рака желудка в большинстве стран [2], из-за огромных разработок в области диагностики и лечения. Тем не менее, рак желудка остается большой угрозой для людей, особенно в развивающихся странах [1], и выживание всех пострадавших пациентов, даже после лечебной хирургической резекции и адъювантной терапии, составляет менее 40% [3].
Эпидемиологические исследования были выявлены многочисленные факторы риска развития рака желудка, и молекулярно-биологических исследований, дополнительно указывает на то, что желудочный канцерогенез содержит многочисленные генетические и эпигенетические события, включая скопление онкогенов, генов-супрессоров опухолей, регуляторы клеточного цикла, молекул клеточной адгезии и генов репарации ДНК [4] , Тем не менее, точные механизмы, лежащий в основе рака желудка не определены.
CDK-ассоциированный Cullin1 представляет собой новый ген, идентифицированный в колоректального рака. Она включает в себя открытую рамку считывания, последовательность, которая кодирует 37 кДа белок из 369 аминокислотных [5] кислот. CAC1
белок содержит Cullin домен между аминокислотами 137 и 250, и поэтому классифицируется как член Cullin семейства E3 убиквитинлигаза [5]. Гистологические исследования было установлено возможное объединение CAC1
выражения с патологическими особенностями и клинических стадий колоректального рака пациентов [5]. Кроме того, CAC1
, в пробирке
, была выражена в клеточного цикла-зависимым образом с высоким уровнем экспрессии в конце G1 к фазе S [5]. Следует отметить, что CAC1
может способствовать прохождение клеточного цикла и стимулировать активность киназы CDK2
[5]. Тем не менее, мало известно о его экспрессии и биологические характеристики при раке желудка.
Настоящее исследование было проведено с целью изучения экспрессии CAC1
и исследовать функцию, которая CAC1
выполняет в желудочном карцинома клеточных линиях. Клеточная линия AGS была выбрана в качестве модели для исследования, так как она выражена относительно высокий уровень CAC1
, затем CAC1
выражение подавляются РНК-интерференции (RNAi), а также ряда биологических параметров, имеющих отношение к пролиферации клеток, клеток цикла и апоптоза были рассмотрены, соответственно.
Методы клеточной культуре

желудка человека линии раковых клеток (AGS и MGC803) и желудка линии клеток слизистой оболочки (GES-1) были предоставлены Центральной лаборатории медицинского колледжа, Xi сверхсовременные университет Цзяотун, Китай. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, Нью-Йорк, США) с добавлением 10% сыворотки новорожденного теленка (Gibco BRL, Grand Island, Нью-Йорк, США), 100 KU /л пенициллина, 0,1 г /л стрептомицина, 0,3 г /л L-глутамина и 0,85 г /л гидрокарбоната натрия <суб> 3 при 37 ° с в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO <суб> 2.
миРНК трансфекцию
CAC1
-siRNA (несовершенновзрослые GGA UGG UGC КАУ AGA УСА ATT 3 ', антисмысловая-5 ' УУГ АУК UAU GGC ACC АУК CGG3 '), CAC1
отрицательный контроль миРНК (NC-миРНК, чувство-5 'UUC UCC GAA ГЕ GUC ACG УТТ 3 ', антисмысловая-5 'ACG УЗА CAC ГУУ CGG AGA ATT 3 ') были химически синтезированы Шанхай GenePharma Corporation (SGC, Шанхай, Китай). Все миРНК были смешаны в Lipofectamine2000 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и трансфицировали в соответствии с трансфекцией протоколом миРНК. Эффективность CAC1
нокдауна оценивали с QRT-PCR и западные тесты блоттинга.
МТТ
МТТ (3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолийбромид тиазолил синий индикаторный краситель) анализ химиочувствительность был применен для определения скорость пролиферации AGS клетки желудка. Клетки высевают при концентрации 5 × 10 3 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. Все эксперименты проводились в трех экземплярах. Клетки инкубировали в течение 24 часов, и были разделены на пять групп с пятью различными процедурами (нуль, NC-миРНК (60 нмоль /л (нМ)), миРНК (30 нМ), миРНК (60 нм), миРНК (90нм)) в течение 0, 24, 48, 72 и 96 часов, соответственно. Двадцать микролитров 5 мг /мл МТТ (Sigma Chemical Co, Сент-Луис, штат Миссури, США) в фосфатном буферном растворе (PBS) добавляли в каждую лунку, и клетки были оставлены в инкубаторе в течение еще 4 ч при 37 ° С, с последующим добавление 150 мкл ДМСО. Абсорбция окрашенного раствора измеряли с помощью полностью автоматизированной мульти обнаружения микропланшетов читателя (Polarstar OPTIMA, BMG Labtechnologies, Оффенбург, Германия) при 490 нм.
Цитометрический анализ
клетки (1 × 10 5 клеток /лунку) были собраны в 6-луночных планшетах в течение 24 часов, и обрабатывали различными агентами (нуль, NC-миРНК, миРНК (60 нм)) в течение 48 часов. Затем они были собраны, чтобы быть промыты 0,01 моль /л холодной (4 ° С) PBS путем центрифугирования при 800 оборотов в минуту, 4 ° С в течение 8 минут, а затем фиксировали в 4 ° С, 75% этаноле в течение ночи. Фиксированные клетки центрифугировали (как указано выше) и снова промывают PBS. Затем клетки обрабатывали 100 мкл ДНКазы, свободной, РНКазы А (10 мг /мл) и инкубировали при 37 ° С в течение 10 минут. Наконец, клетки окрашивали 100 мкл 100 мкг /мл пропидий йодид (светло-чувствительный) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Клетки от каждого образца были помещены в пробирки Фалкон и считывали на FAC сортировщика (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Профили клеточного цикла были интерпретированы с B-D FAC Сортировка Cell Quest программного обеспечения.
Анализ Апоптоз
клетки (1 × 10 5 клеток /лунку) инкубировали в 6-луночные планшеты. Через 24 часа они были адресованы с различными агентами (нуль, цисплатин (10 мкМ), цисплатин (10 мкМ) + NC-миРНК (60 нм), цисплатин (10 мкМ) + миРНК (60 нм)) в бессывороточной среде в течение 24 ч, затем собирали клетки окрашивали аннексина V /PI с использованием набора для анализа Vybrant апоптозом № 2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, США) и анализировали с помощью проточной цитометрии.
Количественные в режиме реального времени с обратной транскрипцией PCR-
Expression из CAC1 в желудочном линии раковых клеток
Общую РНК выделяли из различных клеточных линий (AGS, MGC803 и ГЭС-1) с помощью метода кислотно-гуанидин-фенол-хлороформ (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, США), и были синтезированы кДНК с использованием набора PrimeScriptTM 1-й цепи синтеза кДНК (Invitrogen, Carlsbad, США). Последовательности праймеров, используемых для амплификации были разработаны Такара (Takara Bio Inc., Шига, Япония) и перечислены ниже: прямой праймер 5'-GCA GCA ТАТ ТСА GAA АГТ ТСА GA-3 '; обратный праймер 5'-CAT TTA CAG ССТ AAT НКУ ТТТ ACT-3 '. -актина
прямой праймер 5'- TGG CAC CCA GCA CAA TGA -3 '; обратный праймер 5'- CTA AGT AGT CAT CCG ССТ AGA AGC -3 '. Праймеры использовали в обычных ПЦР-реакций с кДНК из клеток с тем, чтобы оценить их правильного проектирования и синтеза. Впоследствии ПЦР-продукты секвенировали и их сходство с желаемыми нуклеотидных последовательностей подтвердили. Относительное количество мРНК определяли с использованием SYBR Green PCR Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, США) с геном-специфических праймеров для CAC1
или бета-актина
. Все этапы были выполнены в соответствии с протоколом производителя. ПЦР в реальном времени проводили реакции на термоциклеру ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, США) с iQ5 BioRad и время в режиме реального Система MyiQTM PCR Detection (BioRad Laboratories, Hercules, Калифорния, США). Три независимые тесты ПЦР проводили для каждого образца RT. Экспрессия мРНК CAC1
в каждом образце нормализовали против бета-актина
и уровень экспрессии рассчитывали, используя ΔΔCT (дельта порог дельта цикл)
метод. Экспрессии генов, связанных с апоптозом в клеточной линии AGS
Выделение РНК и синтез кДНК осуществляли, как отмечено. Серия праймеров были разработаны и синтезированы Такара включая P53
(вперед-5 '- CCA CCA TCC ACA ACT ACT ACA T-3 ', обратный 5 '- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 '), BCL2
(вперед-5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 ', обратный 5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), Вах
(вперед-5 ' - GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 '; реверс-5 ' - AGG ААС TCC AGT GTC CAG C-3 ') и β-актина
(вперед 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 '; обратный 5 '- CTA AGT AGT CAT CCG ССТ AGA AGC -3 ') генов. Как было указано выше, в режиме реального времени ПЦР проводили трижды. Продукты ПЦР были обнаружены путем измерения излучающий флуоресценцию в конце каждого цикла реакции. Пороговый цикл соответствует количеству циклов, требуемых для обнаружения сигнала флуоресценции над базовой линией. &Beta-актин
ген служил в качестве внутреннего контроля реакции.
Уровни экспрессии мРНК были рассчитаны с использованием -ΔΔCT метод 2 и выражается в относительных единицах количественной оценки. Более подробно, пороговые циклы гена домашнего хозяйства бета-актина
и гены-мишени BCL2
, БАКСА
и Р53
определяли в каждом образце и в течение каждого периода времени. Значения CT были нормализованы (Δ CТ) путем вычитания уровней экспрессии контрольного гена β-актина
из соответствующих уровней экспрессии BCL2
, БАКСА
и P53
в каждом образце. Нормированная экспрессии генов в обработанных клетках AGS анализируют по сравнению с их согласующих необработанных клеток, которые действовали в качестве образцов калибратор (ΔΔCT).
Вестерн-блот-экзамены
Пятьдесят микрограмм общего белка из клеточной линии AGS отделили на 10% Trisglycine SDS полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad, Hercules, Калифорния, США). Блот зондируют мышиных моноклональных антител, включая анти-CAC1
(GeneTex, Ирвин, штат Калифорния, США, 1: 1500), анти-бета-актина
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 5000), анти-P53
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), анти-BCL2
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), и анти-Вах
(Santa Cruz, CA , США; 1: 2000). Связывание антител определяли с помощью геля BLOT Imaging Systems (Syngene G: BOX, Кембридж, Великобритания). В соответствии с протоколом производителя
Статистический анализ
Все статистические анализы были проведены с использованием SPSS 13,0 программного обеспечения (HTTP: //WWW -01. КУГ. COM /программное обеспечение /аналитика /SPSS /). Каждый анализ проводили по меньшей мере три раза. Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение, и Одностороннее ANOVA тест (двухсторонняя) было проведено с целью определения значимости различий в множественных сравнений. Результаты считались статистически значимыми при P &
ЛТ; 0,05.

Результаты Дифференциальная экспрессия CAC1
в рака желудка и слизистых оболочек клеточных линий
CAC1
экспрессии мРНК оценивали в режиме реального времени ОТ-ПЦР в трех клеточных линиях. Очевидно, что выражалось CAC1
в каждой из исследованных линий клеток (Фигура 1А). Однако клеточные линии AGS и MGC803 показали более высокие уровни CAC1
мРНК, чем клеточная линия GES-1 (1,0000 ± 0,0000 и 0,9507 ± 0,0176 по сравнению с 0,4340
± 0,0414, P &
ЛТ; 0,05). Кроме того, CAC1
экспрессии белка в Вестерн-блот исследования показали ту же тенденцию, как изменяющуюся CAC1
мРНК (рис 1А). Рисунок 1 Выражение CAC1 в рака желудка и слизистых оболочек клеточных линий человека. (A) в режиме реального времени обратной транскрипции (RT) -PCR и западный анализ CAC1
выражения в AGS, MGC803 и ГЭС-1 клеточных линий (блот * представляет P &
0,05 лт между клеточной линии GES-1 и другие клеточные линии). (Б) CAC1
выражение эффективно подавлен 60NM CAC1
-siRNA в клеточной линии AGS на мРНК, так и на уровне белка (* представляет собой P
≪ 0,05 между контрольной группой и CAC1
-siRNA группа).
эндогенная экспрессия CAC1
был подавлен с помощью техники RNAi
Переходные трансфекции клеток AGS с CAC1
-siRNA олигонуклеотидами (60nm) разработан против CAC1
последовательности эффективно ингибировали выражение CAC1
. CAC1
экспрессия мРНК была рассмотрена в реальном времени RT-PCR. Как и ожидалось, уровень мРНК CAC1
существенно снизился в CAC1
группе -siRNA (1,0000 ± 0,0000 против 0,3583
± 0,0244, P &
ЛТ; 0,05), но не показал существенной разницы между контролем и NC-миРНК группы (1,0000 ± 0,0000 по сравнению с 0,9597
± 0,0407, P
> 0,05) (рис. 1В) В то же время, экспрессия белка CAC1 также депрессии после лечения миРНК в Вестерн-блот экзаменов (рисунок 1В).
CAC1
глушителей ингибирует пролиферацию клеток в клеточной линии AGS
Для того чтобы исследовать роль CAC1
играет в регулирование пролиферации клеток, клетки AGS, решаемые временной трансфекции с CAC1
-siRNA трех различных дозировках (30 нМ, 60nm и 90nm) подвергали МТТ. В течение четырех дней, CAC1
глушителей выставлены ярко выраженный ингибирующий эффект на пролиферацию клеток в соответствии с различными дозами CAC1
-siRNA (рисунок 2). Оптические плотности (СОД) контрольной группы, группа NC-миРНК, а 30нм CAC1
группа -siRNA не показали никаких существенных различий друг с другом (P &
GТ; 0,05), но были выше, чем у 60nm и 90нм CAC1
-siRNA группы (P &
л; 0,05). Интересно, что клетки, обработанные 60nm и 90nm CAC1
-siRNA показали практически идентичные ODS от начала до конца (P
> 0,05). Рисунок 2 Рост клеток тормозится следующий CAC1 молчанию. клетки AGS были трансфицированы с нулем, NC-миРНК и три концентрации CAC1
-siRNA в течение четырех дней, соответственно. Темпы роста клеток определяли с помощью МТТ-анализа.
Анализ клеточного цикла
По сравнению с контролем, доля клеток, обработанных CAC1
-siRNA увеличился на 28% или около того в фазе G0 /G1 (45,33 % ± 0,82% по сравнению с 73.23%
± 3,04%, P &
ЛТ; 0,05), и снизилась примерно на 36% в фазе S (41,07% ± 1,07% по сравнению с 5,40%
± 5,83%, P
&л; 0,05), без каких-либо существенных изменений в G2 /M фазы (13,61% ± 0,46% по сравнению с 21,37%
± 2,88%, P
≫ 0,05) (рисунок 3). Эти результаты указывают на то, что CAC1
может способствовать прогрессию клеточного цикла клеток AGS через /перехода G1 S. Рисунок 3 Нокдаун CAC1- индуцированной G1 остановки клеточного цикла в клеточной линии AGS. Анализ клеточного цикла клеток AGS, обработанных или без CAC1
-специфические миРНК с помощью проточной цитометрии. Доля клеток заметно повышен в фазе G1 в то время как снижается в фазе S, при обработке CAC1
-siRNA (* представляет собой P
≪ 0,05 между контрольной группой и группой CAC1
-siRNA).
Нокдаун CAC1
усиливает цисплатин-индуцированного апоптоза
АГС клетки были разделены на четыре экспериментальные группы: контрольная группа, цисплатин лечение (10 мкМ) группы, цисплатин плюс группы NCsiRNA и цисплатин плюс CAC1
-siRNA (60nm) группы. По сравнению с контрольной группой, пропорции раннего /позднего апоптоза были увеличены с цисплатином лечения, но в большей степени, с цисплатином плюс CAC1
-siRNA (2,01% ± 0,78% по сравнению с 8,87%
± 3,65% по сравнению с
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25% по сравнению с 3,89%
± 0,15% по сравнению с
10,01% ± 0,09%, P &
ЛТ; 0,05) (рис 4А и 4Б), что означает, что нокдаун из CAC1
резко ускоряются цисплатин-индуцированной апоптоз. Рисунок 4 CAC1 глушение усиливается цисплатин-индуцированной апоптоз в клеточной линии AGS. (A) Эффекты цисплатин отдельно и в сочетании с NC-миРНК /CAC1
-siRNA на ранней и поздней апоптоз клеток AGS (* представляет P &
0,05 лт между контрольной группой и обработанными группами; #represents P
≪ 0,05 между цисплатин (CDDP) группы и других обработанных группах). (Б) Апоптоз образцы клеток AGS были проанализированы с помощью проточной цитометрии.
Профили экспрессии генов связанных с апоптозом
Уровни мРНК CAC1
, BCL2
, БАКСА
и Р53
были исследованы QRT-PCR. Инкубация клеток AGS с 10 мкМ цисплатина и /или 60nm CAC1
-siRNA в течение 24 ч действительно производила интересные профили мРНК (рис 5А). Под обработкой цисплатин, CAC1
экспрессия мРНК значительно увеличилось, но снизилась до низкого уровня, когда CAC1
-siRNA добавляют одновременно (1.0000 ± 0,0000 по сравнению с 2,1578
± 0,2222 по сравнению с 0,3967
± 0,0078, P
&л; 0,05). По сравнению с контрольной группой, BCL2
копий мРНК показал уменьшение в группе цисплатин 30%, но снизились на 60% в группе цисплатин плюс CAC1
-siRNA группа (1,0000 ± 0,0000 в сравнении
0,7090 ± 0,0210 по сравнению с
0,4030 ± 0,0171, P &
ЛТ; 0,05). С другой стороны, Р53 и Вах

уровни транскриптов обработанных групп были значительно улучшены. По сравнению с контрольной группой, выражение P53
полученного почти двукратное увеличение цисплатин только группы, в дополнение к пятикратному увеличению цисплатин плюс CAC1
-siRNA группы (1,0000 ± 0,0000 по сравнению с
3,0187 ± 0,1738 по сравнению с 5,9957
± 0,3926, P
&л; 0,05); Вах в
уровни мРНК были почти двух- и четырехкратное увеличение (1,0000 ± 0,0000 по сравнению с 3,0237
± 0,2581 по сравнению с 4,9897
± 0,2923, P &
ЛТ; 0,05), соответственно. Рисунок 5 профилей экспрессии генов связанных с апоптозом в ответ только цисплатином или с лечением CAC1 -siRNA. (A) в режиме реального времени обратной транскрипции (RT) -PCR анализ CAC1
, Р53
, БАКСА
и BCL2
экспрессии мРНК в клетках AGS (* представляет P &
лт; 0,05 между CAC1
-siRNA группу и обработанные группы; #represents P
&л; 0,05 между цисплатин (CDDP) группы и других обработанных группах). (В) Вестерн-блоттинг анализ CAC1
, Р53
, BCL2
и Вах
экспрессии в клетках AGS.
Тогда западные тесты блоттинга были проведены, чтобы обнаружить уровни белка этих генов после CAC1
нокдаун. Параллельно с вышеупомянутыми изменениями мРНК, БАКСА
и P53
были заметно усиливает свою активность, тогда как BCL2
была подавлена ​​на уровне белка (рис 5B).
Обсуждение
убиквитин-Протеасома система играет ключевую роль в поддержании баланса между нормальным ростом и неконтролируемой пролиферации путем регулировании количества самых разнообразных клеточных белков [6]. Cullin семейство убиквитинлигаза, традиционно состоящие из Cul1, 2, 3, 4А, 4В, 5
и 7
, представляет собой самый крупный класс RING типа E3 лигазы (CRL) [6]. Без внутренней каталитической активности, Cullins служат в качестве подмостей, которые облегчают сборку многомерным лигазы комплексов E3 и способов переноса убиквитина из Е2-сопрягающего фермента к субстрату. Каллин-опосредованной деградации субстрата диктует широкий спектр клеточных процессов, таких как пролиферации, дифференцировки и апоптоза. После того, как регуляторных механизмов клеточных Cullin сталкиваются неисправностей или возмущений, накопление онкобелках или чрезмерной деградации опухолевых супрессоров неизбежно произойдет, что может спровоцировать клетки в злокачественные трансформации и онкогенеза [6]. В частности, cullin1
, наиболее отличающийся член семьи Cullin, было доказано, что тесно связано с желудочным канцерогенеза, а его избыточная экспрессия предсказывает плохой прогноз у больных с желудочной карциномы [6, 7].
Профили экспрессии от связанных с раком генов частично отражают их биологические особенности в патогенезе рака. Будучи новым членом семьи Cullin, CAC1
паттерны экспрессии были широко исследованы в предыдущем исследовании [5]. Использование библиотеки кДНК анализа, CAC1
выражение было найдено в нормальном желудке, тонком кишечнике, толстой кишки, печени, легких, почек, мышц, сердца, молочной железы, матки, мозга, селезенки, лимфатических узлов, с высокими уровнями в толстой кишке и молочная железа [5]. Западные тесты блот дополнительно обнаружены CAC1
белка в хозяине нормальных и раковых клеточных линий [5]. Что касается нашего исследования, АГС и MGC803 желудка клеточные линии рака имели более высокие CAC1
выражение, чем в желудочном линии клеток слизистых оболочек GES-1, которые указывают, что CAC1
может играть активную роль в желудочном канцерогенезе.
молчанием генов с помощью РНК-интерференции является мощным методом для анализа функции гена [8]. Здесь мы успешно трансфицированы NCsiRNA и три концентрации CAC1
-siRNA в текущем AGS клетки. МТТ анализ показал, что потенциал пролиферации клеток AGS был сильнодействующий тормозится 60nm и 90nm CAC1
-siRNA в той же степени, но не под влиянием 30нм CAC1
-siRNA или NC-миРНК. Было очевидно, что CAC1
может положительно повлиять на пролиферацию клеток при раке желудка, который был в согласии с предыдущими исследованиями, на клеточной линии HeLa [5]. В МТТ экзаменов, HeLa клетки, экспрессирующие Флаг-CAC1
прошли более высокую способность пролиферации, чем фиктивных трансфицируют контрольных клеток, и клетки, обработанные CAC1
-siRNA показали значительно ингибировали скорость роста [5]. Более того, в режиме реального времени RT-PCR и Вестерн-блот-анализ подтвердил, что экспрессия CAC1
был действенно заблокирован 60nm CAC1
-siRNA. Взятые вместе, 60NM было определено, что наиболее подходящим экспериментальным дозировка для RNAi в последующих экзаменов.
Как правило, нормальная пролиферация клеток зависит от процесса цикла упорядоченного и эффективного клеточного, что обеспечивает дублирование и передачи генетической информации от одной клетки поколения к следующему. Другими словами, дерегулирование пролиферации клеток всегда лежит в ненормальном клеточного цикла. Под CAC1
-silencing условиях, проточной цитометрии в наше исследование показало повышенный процент клеток в фазе G0 /G1 и снижение скорости клеток в фазе S. В сущности, CAC1
нокдаун индуцированное G1 клеточного цикла в клетках AGS, что согласуется с результатами клеточной линии HeLa [5]. CAC1
был также способен связываться с CDK2
и стимулируя его активность киназы при фазовом переходе /G1 S без существенного изменения выражения cyclinA
, циклин
, cyclinD1
, CDK2 <бр> RB
, PTEN
, и так далее [5]. Предполагается, что CAC1
депрессия ослабляет активность CDK2
и прерывает переход G1-S.
Апоптоз является одним из основных биологических явлений характеризуется ряд преобразований в морфологии клеток [9]. Кроме того, апоптоз совместно с пролиферацией клеток формирует решающую механизм балансировки, который управляет большим количеством физиологических процедур, таких как тканевого гомеостаза и нормального развития [9]. При патологических условиях, как правило, аберрантное апоптозу вносит большой вклад инициации и прогрессирования рака [10-12] и даже повлиять на чувствительность раковых клеток к терапевтических вмешательств [13].
Однозначному активность CAC1
в клеточном цикле регулирование поднял возможность того, что она есть, более или менее, участвующих в процессе апоптоза. В текущем исследовании, доля ранних /позднего апоптотических клеток увеличивалось с цисплатин лечения, но возросло еще более, когда CAC1
выражение одновременно тормозится RNAi. То есть, апоптотических индексы цисплатин плюс CAC1
группы -siRNA получили значительное увеличение по сравнению с таковыми из первых трех групп с исправным CAC1
. Совокупные данные указывают на то, что CAC1
может ослабить противораковое действие цисплатина, противодействуя цисплатин-индуцированной апоптозу.
Регуляции апоптоза, однако, опирается на сеть анти- и проапоптических молекул, таких как BCL2
семьи [14]. BCL2
(В-клеточный ХЛЛ /лимфома 2) является прото-онкогенов, расположенный в хромосомной области 18q21.3, который кодирует для антиапоптического белка 26-кДа, содержащий четыре BH доменов (BH1 ~ BH4)) [15]. Это может препятствовать высвобождение цитохрома с из митохондрий, тем самым отменяя активацию каспаз и, наконец, ингибирования апоптоза [16]. Согласно ранним исследованиям, избыточная экспрессия BCL2
гонит клеток к злокачественной трансформации [17] и предсказывает прогноз у многих злокачественных опухолей [18-22]. В частности, при раке желудка, частое экспрессию гена BCL2
всегда имели место в злокачественных тканях [23-25]. Высокие уровни экспрессии гена BCL2
, хотя коррелировали с меньшей агрессивности рака желудка [26], было много общего с лекарственной устойчивостью раковых клеток [27].
Вах
(BCL2 <бр> ассоциированный белок) ген Х находится в человеческом хромосомной области 19q13.3-q13.4 [28]. Его 21-кДа белок, кодирующий, в частности, служит в качестве проапоптического члена BCL2
семьи. Вах
белок состоит из трех доменов BH (BH1, Bh2 и BH3) и разделяет много гомологии с BCL2
белка. Действительно, Вах
белок действует как подавитель BCL2
ускорить апоптоз клеток, путем формирования Вах
/BCL2
комплексы, или конкурировать с другими целями BCL2
[29]. Сверхэкспрессия Bax
гена оказало негативное влияние на рост клеток рака желудка человека, вследствие индукции апоптоза и повышению клеточного химиочувствительность [30]. Напротив, подавление Вах
экспрессии генов индуцированного онкогенеза в желудочном эпителии [23].
Цисплатин является своего рода химиотерапевтического агента широко используется в твердых злокачественных опухолей, включая рак желудка. Принято считать, что его первичный эффект цитотоксическое повреждение ДНК и последующее индуцирование апоптоза [31], так что дисперсии с апоптозом ассоциированных генов в клетках, обработанных цисплатином проницательно отражают механизмы, лежащие цисплатин-индуцированной апоптозу. Что же касается нашего исследования, CAC1
выражение активируемых цисплатин лечения, но заметно подавлена ​​обработкой миРНК, несмотря на ранее цисплатин. Кроме того, лежащая в основе увеличение цисплатин-индуцированного апоптоза, который следует CAC1
глушителей сопутствуют изменения экспрессии генов, включая повышающей регуляции Р53
и БАКСА
а также понижающей регуляции BCL2.
Эти эффекты предполагают, что CAC1
усиливает цисплатин-индуцированного апоптоза путем модуляции экспрессии BCL2
, BAX
и Р53
.
Как уже упоминалось ранее, BCL2
, казалось бы, расположенной на стыке нескольких пути апоптоза, а также отношение к BCL2
Вах
белка по-видимому, конечный определитель входит ли ячейка фазы выполнения [31]. На самом деле, это BCL2
/Bax
коэффициент, который регулирует чувствительность клеток к апоптотических стимулов [32, 33]. В процессе цисплатин-индуцированного апоптоза, CAC1
может защитить клетки AGS от апоптоза путем изменения /
Вах
соотношение BCL2, для CAC1
Глушащий вынула выраженное увеличение БАКСА
и снижение BCL2
, что способствовало возникновению клеточного апоптоза.
Интересно, что ген Р53
в клетках AGS был повышающей регуляции при лечении цисплатином, особенно с синхронным подавлением CAC1
. Хорошо известно, что Р53
играет важную роль в управлении клеточного цикла и апоптоза. Повреждение ДНК в результате цисплатином может стимулировать экспрессию Р53
белка, что приводит к экспрессии как вниз по течению белка Р21
и G1 клеточного цикла [34]. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Утилита интраназального кетамина и мидазолама для выполнения желудочного содержимого у детей: двойное слепо…
• Ассоциации с PTPN11 G /полиморфизм интрона 3 с Helicobactor pyloriseropositivity, атрофии желудка и рака желудка на японском языке