CDK-asszociált Cullin 1 elősegítheti a sejtek szaporodását és gátolják a cisplatin indukálta apoptózis, a AGS gyomorrák sejt line

CDK-asszociált Cullin 1 elősegítheti a sejtek szaporodását és gátolják a cisplatin indukálta apoptózis, a AGS gyomorrák sejtvonal
Abstract
Háttér katalógusa gyomorrák gyakori és rendkívül halálos malignitás a világon, de a patogenezis megfoghatatlan marad. Ebben a tanulmányban arra összpontosítunk, hogy a biológiai funkcióit CDK-asszociált Cullin1 (CAC1 katalógusa), egy új gén a cullin család, a gyomorrák, amely segíthet bennünket, hogy jobban megértsük az eredete ennek a rosszindulatú. Katalógusa módszerek
a AGS és MGC803 gyomorrák sejtvonalakon és a GES-1 gyomornyálkahártya sejtvonalat választottunk ki a tanulmány. Eleinte CAC1
kifejezéseket az említett sejtvonalakat vizsgáltuk kvantitatív, valós idejű reverz transzkripciós polimeráz-láncreakció (QRT-PCR) és Western-blot-vizsgálatokat, majd CAC1
kis interferáló RNS (CAC1
-siRNA) tervezték, és transzfektáltuk a AGS sejtvonal viszonylag magas szintű CAC1 katalógusa. Miután CAC1 katalógusa elcsendesült, egy sor biológiai jellemzői AGS sejtek, így a sejtburjánzást, a sejtciklus, az apoptózis, és megnyilvánulásai apoptózis kapcsolatos gének (P53 katalógusa, BCL2 katalógusa és a Bax katalógusa) voltak határozza MTT, áramlási citometriával qRT-PCR és western blot, ill. katalógusa Eredmények katalógusa CAC1 katalógusa kifejezése AGS vagy MGC803 sokkal nagyobb volt, mint a GES-1. Miután CAC1 katalógusa kifejezés ténylegesen depressziós RNS interferencia AGS sejtek jelentős sejt növekedés gátlás történt. Továbbá, az aránya a kezelt sejtek CAC1
-siRNA növelte a G1 fázisban és csökkent az S fázisban, jelzi, G1 sejtciklus. Ennél is fontosabb, az arányok korai /késői apoptózis AGS sejteket fokozott cisz-diaminedichloroplatinum (ciszplatin, CDDP) kezelés, de nagyobb mértékben ciszplatinnal plusz CAC1 katalógusa -siRNA. Érdekes, hogy a BCL2 katalógusa mRNS másolatok megmutatta mintegy 30% -kal csökkent a cisplatin csoportban, de csökkent mintegy 60% -kal, a cisplatin + CAC1 katalógusa -siRNA csoport. Fordítva, a P53
mRNS kapott majdnem kétszeres növekedés a ciszplatin csoport, amellett, hogy egy ötszörös növekedés a ciszplatin plusz CAC1
-siRNA-csoport, és a BAX
mRNS-szintje majdnem két- és négyszeres mellnagyobbítás, ill. Közben P53 katalógusa, BAX katalógusa és BCL2 katalógusa megmutatta ugyanaz változás minták Western blot vizsgálatok. Katalógusa Következtetések katalógusa CAC1 katalógusa elősegítheti a sejtek burjánzását a AGS gyomorrák sejtvonalon. Sőt, lehet megakadályozni AGS sejtek tapasztal cisplatin indukálta apoptózis útján moduláló kifejezések P53 katalógusa, BCL2
és a BAX
.
Kulcsszavak
Gyomorrák CDK-asszociált Cullin1 Proliferation Sejtciklus Apoptózis Háttér
gyomorrák egyik leggyakoribb rosszindulatú tumorok és a második vezető daganatos halálok a világon, felelős összesen 989.600 új esetet és 738.000 haláleset évente [1]. Az elmúlt években, volt egy folyamatosan csökkent a megbetegedési és elhalálozási kockázatát gyomorrák a legtöbb országban [2], mivel a hatalmas fejlesztések diagnózis és kezelési módszerek. Azonban gyomorrák továbbra is nagy veszélyt jelent az emberek, különösen a fejlődő országokban [1], és a túlélés minden érintett betegek, még azután is, kuratív sebészi eltávolítását és az adjuváns terápia, kevesebb, mint 40% [3]. Katalógusa Epidemiológiai vizsgálatok felfedték sok kockázati tényező a gyomorrák és a molekuláris biológiai kutatások azt is jelzi, hogy a gyomorsav a rákkeltő képességet magában foglalja számos genetikai és epigenetikai események, beleértve a klaszter onkogének, tumor szupresszor gének sejtciklus szabályozó, sejt adhéziós molekulák és a DNS javító gének [4] . Azonban a pontos mechanizmusok mögöttes gyomorrák nem jól meghatározott.
CDK-asszociált Cullin1 egy új gén azonosított kolorektális karcinóma. Magában foglalja egy nyitott leolvasási keret szekvenciáját kódoló 37 kDa-os fehérje 369 aminosavból [5]. A CAC1
fehérje tartalmaz egy Cullin domén aminosavak között, 137 és 250, és ezért besorolni tagja a Cullin család E3 ubikvitin ligázok [5]. Szövettani vizsgálatok létrehozott egy lehetséges csatlakozását CAC1 katalógusa kifejezés patológiai jellemzői és klinikai fázisában kolorektális karcinóma betegeknél [5]. Sőt, CAC1 katalógusa, az in vitro
-ben kifejezve, sejtciklus-függő módon nagy expressziós a késő G1-S fázis [5]. Nevezetesen, CAC1 katalógusa elősegítheti a sejtciklus előrehaladását, és serkentik a kináz aktivitását CDK2 katalógusa [5]. Mindazonáltal keveset tudunk annak expresszióját és biológiai jellemzői gyomorrákban.
A jelenlegi vizsgálat során vizsgálja a kifejezés CAC1 katalógusa, és fedezze fel a funkciót, amely CAC1 katalógusa fellépőként gyomorkarcinóma sejtvonalon. Az AGS sejtvonalat választottuk, mint a modell tanulmány mert kifejezve viszonylag magas CAC1 katalógusa, majd CAC1 katalógusa kifejezés elcsendesült RNS interferencia (RNSi), és egy sor biológiai paraméterek vonatkozó sejtburjánzást, sejt ciklus és az apoptózis vizsgáltuk, ennek megfelelően.
Methods
Sejttenyésztés
humán gyomorrák sejtvonalak (AGS és MGC803), és gyomornyálkahártya sejtvonal (GES-1) által biztosított Központi Laboratóriuma Medical College, Xi "egy Jiaotong Egyetem, Kína. A sejteket RPMI 1640 tápközegben (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), kiegészítve 10% újszülött borjúszérummal (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 kU /l penicillint, 0,1 g /l sztreptomicint, 0,3 g /l L-glutaminnal és 0,85 g /l NaHCO 3 37 ° C hőmérsékleten nedvesített atmoszférában, amely 5% CO 2.
siRNS transzfekció
CAC1
-siRNA (érzéki GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT 3 ', antiszensz-5 ' UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG3 '), CAC1 katalógusa negatív kontroll siRNS (NC-siRNS, érzék-5 'UUC UCC GAA alegységei GUC ACG UTT 3 ', antiszensz-5 'ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3 '), amelyek kémiailag szintetizált Shanghai GenePharma Corporation (SGC, Shanghai, Kína). Minden siRNS keverünk bele Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, Amerikai Egyesült Államok), és transzfektáltuk szerint az siRNS Transzfekció jegyzőkönyvet. A hatékonyság CAC1 katalógusa knockdown értékeltük QRT-PCR és Western blot vizsgálatok.
MTT assay
Az MTT (3- [4,5-dimetil-tiazol-2-il] -2,5-difenil-bromid tiazolil kék indikátor festék) kemoszenzitivitás assay alkalmaztak, hogy meghatározzák a proliferációs ráta AGS gyomor sejteket. A sejteket beoltottuk koncentrációban 5 × 10 3 sejt per lyuk 96 lyukú lemezeken. Minden kísérletet három párhuzamos méréssel végezzük. A sejteket 24 órán keresztül inkubáltuk, és osztottunk öt csoportba öt különböző kezelések (null, NC-siRNS (60 nmol /l (nM)), siRNS (30 nM), siRNS (60nm), siRNS (90 nM)) 0, 24, 48, 72 és 96 órán át, ennek megfelelően. Húsz mikroliter 5 mg /ml MTT-t (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) adunk hozzá lyukanként, majd a sejteket belsejében hagyott az inkubátorba további 4 órán át 37 ° C hőmérsékleten, majd hozzáadásával 150 ul DMSO-ban. Abszorbanciáját színű oldatot mértük egy teljesen automatizált, több észlelési mikrotiterlemez-leolvasó (Polarstar Optima, BMG Labtechnologies, Offenburg, Németország), 490 nm-en.
Áramlási citometriás analízis
sejteket (1 × 10 5 sejt /cella) kinyertük, 6 lyukú lemezeken 24 órán át, és kezeltük különböző szerekkel (null, NC-siRNS, siRNS (60nm)) 48 órán keresztül. Aztán gyűjtötték kell mossuk 0,01 mol /l hideg (4 ° C), PBS-fonás 800 rpm, 4 ° C-on 8 percig, majd rögzített 4 ° C-on, 75% -os etanollal egy éjszakára. Rögzített sejteket centrifugáltuk (mint fent), és ismét mossuk PBS-sel. Ezután sejteket kezeltünk 100 ul DN-áz-mentes, RNáz (10 mg /ml) és inkubáljuk 37 ° C-on 10 percig. Végül, a sejteket megfestettük 100 ul 100 ug /ml propidium-jodid (fényérzékeny), és szobahőmérsékleten inkubáltuk 30 percig. A sejteket minden mintából helyeztük Falcon-csövekbe és olvasható egy FAC sorter (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). A sejtciklus profilokat értelmezni B-D FAC rendezése Cell Quest szoftver.
Apoptózis analízis
sejteket (1 × 10 5 sejt /lyuk) inkubáltunk 6 lyukú lemezeken. 24 óra múlva azokat kezelni különböző szerekkel (null, ciszplatin (10 nM), ciszplatinnal (10 nM) + NC-siRNS (60nm), ciszplatin (10 nM) + siRNS (60nm)) szérummentes tápközegben, 24 órán át, majd összegyűjtöttük a sejteket megfestettük Annexin V /PI használatával Vybrant apoptózis assay kit No. 2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), és áramlási citometriával elemezzük.
kvantitatív valós idejű reverz transzkripciós PCR
Expression a CAC1 a gyomorrák sejtvonalakon
az összes RNS-t izoláltunk különböző sejtvonalakban (AGS, MGC803 és GES-1) a savas guanidium-fenol-kloroform módszerrel (Trizol, Invitrogen, Carisbad, USA), és a cDNS-eket szintetizáljuk felhasználásával PrimeScriptTM 1. Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carisbad, USA). A primer szekvenciák amplifikálására alkalmazunk az volt a célja a Takara (Takara Bio Inc., Shiga, Japán) és az alábbi felsorolásban szereplő: menetirányú primer 5'-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; reverz primer 5'-CAT TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3 '. β-aktin katalógusa forward primer 5'TGG CAC CCA GCA CAA TGA A 3 '; reverz primer 5'CTA AGT AGT CAT CCG CCT AGA AGC A 3 '. Primereket használtuk rendszeres PCR-reakciók származó cDNS-sejtekben oly módon, hogy értékelje a megfelelő tervezése és szintézise. Ezt követően, a PCR-termékeket szekvenáltuk és azok hasonlóságát a kívánt nukleotid-szekvenciákat kell erősíteni. A relatív mennyisége mRNS alkalmazásával határoztuk meg SYBR Green PCR Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) gén-specifikus primerek CAC1 katalógusa vagy β-aktin katalógusa. Minden lépést szerint végeztük, a gyártó protokollja szerint. Real-time PCR-reakciókat végeztünk ABI 7500 thermal cycler (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA), a BioRad iQ5 és MyiQTM Real-time PCR Detection System (BioRad Laboratories, Hercules, Kalifornia, USA). Három független PCR-vizsgálatot végeztünk minden RT mintából. A kifejezés a CAC1 katalógusa mRNS minden egyes mintában normalizáltuk ellen β-aktin
és expressziós szintjének alkalmazásával számítottuk ki ΔΔCT (delta delta küszöb ciklus) módszerrel.
Expressziója apoptózissal kapcsolatos gének AGS sejtvonalban
RNS-izolálás és cDNS-szintézis szerint végeztük jegyezni. Egy sorozat primereket terveztünk és szintetizáltunk Takara beleértve P53 katalógusa (előre-5 '- CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3 ', fordított-5 '- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 '), BCL2 katalógusa (előre-5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 ', fordított 5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), BAX katalógusa (előre-5 ' - GAC ACC TGA GTC GAC CTT GG-3 '; reverz-5 ' - AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ) és a β-aktin katalógusa (forward 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA-3 '; fordított 5 ' - CTA AGT AGT CAT CCG CCT AGA AGC A -3 ) gének. Mint fentebb említettük, valós idejű PCR-t három alkalommal. A PCR-termékeket detektáljuk mérésével emittáló fluoreszcens végén minden egyes reakció ciklusban. A küszöb ciklus megfelel a szükséges ciklusok száma felismerni a fluoreszcens jel az alapvonal fölé. A β-aktin
gén szolgált a belső kontroll a reakció.
A mRNS expressziós szinteket kiszámított 2 -ΔΔCT módszer és kifejezett relatív mennyiségi egység. Részletezve, a küszöb ciklus a háztartási gén β-aktin
és a célgének BCL2
, BAX
és a p53
meghatároztuk az egyes mintákban, és minden egyes időszakban. Ct értékeket normalizáltuk (ΔCT) kivonva az expressziós szintek a referencia gén β-aktin
a megfelelő expressziós szintjét a BCL2 katalógusa, BAX
és P53
minden egyes mintában. A normalizált génexpressziós a kezelt AGS sejteket analizáltuk viszonyítva a megfelelő kezeletlen sejtek, amelyek működött kalibrátor minta (ΔΔCT).
Western blot vizsgálatokat
Ötven mikrogramm teljes fehérjét a AGS sejtvonalat választottunk el 10% Trisglycine SDS poliakrilamid gél, és átvisszük egy nitro-cellulóz-membránra (BioRad, Hercules, Kalifornia, USA). A blotot próbaként egér monoklonális antitestek, ideértve az anti-CAC1 katalógusa (GeneTex, Irvine, Kalifornia, USA, 1: 1500), anti-β-aktin katalógusa (Santa Cruz, CA, USA; 1: 5000), anti-p53-katalógusa (santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), anti-BCL2 katalógusa (santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), és az anti-BAX katalógusa (santa Cruz, CA , USA; 1: 2000). Ellenanyag-kötődést a gél blot Imaging Systems (Syngene G: BOX, Cambridge, UK), a gyártó utasításai szerint. Katalógusa Statisztikai elemzések Tanuld az összes statisztikai elemzéseket végeztünk SPSS 13.0 szoftver (http: //www -01. ibm. com /software /analytics /SPSS /). Minden assay-t legalább három alkalommal. Az adatokat átlag ± standard eltérés, és az egyirányú ANOVA teszt (kétoldalas) végeztünk, hogy meghatározzák a jelentőségét különbségek többszörös összehasonlításokat. Az eredményeket tekintettük statisztikailag szignifikáns P katalógusa < 0,05. Katalógusa Eredmények
eltérő expressziója CAC1 katalógusa gyomorrákban és nyálkahártya sejtvonalak katalógusa CAC1 katalógusa mRNS expressziós értékeltük real-time RT-PCR három sejtvonalakban. Nyilvánvaló, CAC1
fejeztük az egyes vizsgált sejtvonalakban (1a ábra). Azonban, AGS és MGC803 sejtvonalak szintén magasabb szintű CAC1
mRNS, mint a GES-1 sejtvonal (1,0000 ± 0,0000 és 0,9507 ± 0,0176 versus
0,4340 ± 0,0414, p
< 0,05). Emellett CAC1 katalógusa fehérje expresszió Western blot vizsgálatok azt mutatták, az azonos változó tendenciát, mint CAC1 katalógusa mRNS (1A). 1. ábra CAC1 expresszió humán gyomorrák és nyálkahártya sejtvonalakban. (A) A valós idejű reverz transzkripció (RT) -PCR és Western blot analízise CAC1 katalógusa expresszió AGS, MGC803 és GES-1 sejtvonalak (* jelentése p
< 0,05 közötti GES-1 sejtvonal és más sejtvonalak). (B) CAC1
expresszióját hatékonyan depressziós 60nm CAC1
-siRNA az AGS sejtvonal az mRNS és fehérje szinten (* jelentése p
< 0,05 között a kontroll csoport és a CAC1 katalógusa -siRNA csoport).
endogén expresszióját CAC1 katalógusa elcsendesült a RNSi technikával katalógusa tranziens transzfekciója AGS sejtek CAC1 katalógusa -siRNA oligo (60nm) ellen tervezett CAC1 katalógusa szekvencia hatékonyan gátolta kifejezése CAC1 katalógusa. CAC1
mRNS expresszióját vizsgáltuk real-time RT-PCR-rel. Ahogy az várható volt, az mRNS szintjén CAC1 katalógusa jelentősen csökkent CAC1 katalógusa -siRNA csoport (1,0000 ± 0,0000 versus katalógusa 0,3583 ± 0,0244, P katalógusa < 0,05), de nem mutatott szignifikáns különbséget a kontroll és az NC-siRNS csoportok (1,0000 ± 0,0000 versus katalógusa 0,9597 ± 0,0407, P katalógusa > 0,05) (1B). Eközben CAC1 fehérje expresszióját is depressziós után siRNS kezelés Western-blot vizsgálatok (1B ábra).
CAC1
hangtompító gátolja a sejtproliferációt AGS sejtvonalban
Annak érdekében, hogy vizsgálja meg a szerepet CAC1
játszik a szabályozás a sejt-proliferáció, AGS-sejtek által megcélzott tranziens transzfekció CAC1
-siRNA három különböző dózisban (30 nM, 60nm és 90 nM) vetettük alá MTT assay. Négy napon belül, CAC1
hangtompító mutatott megkülönböztethető gátló hatást sejtburjánzást szerint különböző dózisú CAC1 katalógusa -siRNA (2. ábra). Az optikai sűrűséget (OD) a kontroll csoport, az NC-siRNS-csoport és a 30 nM CAC1
-siRNA csoport nem mutatott szignifikáns különbséget egymással (p
&0,05), de magasabb volt, mint a 60nm és 90 nM CAC1
-siRNA csoportban (p
< 0,05). Érdekes, kezelt sejtek 60nm és 90 nM CAC1
-siRNA mutatta, szinte azonos OD az elejétől a végéig (p
> 0,05). 2. ábra A sejtnövekedést gátolta következő CAC1 hangtompító. AGS sejteket átmenetileg transzfektált null, NC-siRNS és három koncentrációban CAC1 katalógusa -siRNA négy napig, ill. Növekedési ráta sejteket határoztuk meg MTT assay.
Sejtciklus elemzés
a kontrollhoz képest, az aránya a kezelt sejtek CAC1
-siRNA 28% -kal nőtt, vagy úgy a G1 /G0 fázis (45.33 % ± 0,82% versus
73,23% ± 3,04%, p
< 0,05), és csökkent körülbelül 36% az S fázisban (41,07% ± 1,07% versus
5,40% ± 5,83%, P
< 0,05), és nincs jelentős változás a G2 /M fázisban (13,61% ± 0,46% vs. katalógusa 21,37% ± 2,88%, P katalógusa > 0,05) (3. ábra). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy CAC1
elősegítheti a sejtciklus progresszióját AGS sejtek révén a G1 /S átmenetet. 3. ábra kiütése CAC1- indukált G1 sejtciklus az AGS sejtvonalban. Sejtciklus elemzés AGS kezelt sejtek vagy anélkül CAC1
-specifikus siRNS áramlási citometriával. Aránya sejtek jelentősen emelkedett a G1 fázisban, míg a csökkentett az S fázisban, amikor kezeljük CAC1
-siRNA (* jelentése p
< 0,05 között a kontroll csoport és a CAC1
-siRNA csoport).
kiütése CAC1 katalógusa fokozza a cisplatin indukálta apoptózis
AGS sejteket négy kísérleti csoport: a kontroll csoportban, a ciszplatin-kezelt (10 uM) csoport, a ciszplatin plusz NCsiRNA-csoport, és a ciszplatin plusz CAC1 katalógusa -siRNA (60nm) csoport. Összehasonlítva a kontroll csoportban az arányok korai /késői apoptózis megerősödött az cisplatin kezelés, de nagyobb mértékben ciszplatinnal plusz CAC1 katalógusa -siRNA (2,01% ± 0,78% vs. 8,87% katalógusa ± 3,65% vs.
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25% vs. 3,89% katalógusa ± 0,15% vs. 10,01% katalógusa ± 0,09%, P katalógusa < 0,05) (4A és 4B), amely azt jelentette, hogy a kiütése CAC1
drámaian felgyorsult cisplatin indukálta apoptózis. 4. ábra CAC1 silencing fokozott ciszplatin-indukált apoptózist AGS sejtvonalban. (A) A hatások a ciszplatin önmagában és kombinációban NC-siRNS /CAC1
-siRNA a korai és késői apoptózis AGS sejtek (* jelentése p
< 0,05 között kontrollcsoport és a kezelt csoportok; #represents P
< 0,05 közötti cisplatin (CDDP) csoport és más kezelt csoportokban). (B) Az apoptózis minták AGS sejteket áramlási citometriával analizáltuk.
Expressziós profilok az apoptózis kapcsolatos gének
A mRNS-szintje a CAC1 katalógusa, BCL2
, BAX
és P53
vizsgáltuk qRT-PCR-rel. Inkubációs az AGS sejteket 10 nM ciszplatinnal és /vagy 60nm CAC1 katalógusa -siRNA 24 órán tette termelni érdekes mRNS-profilok (5A ábra). Under cisplatin kezelés CAC1 katalógusa mRNS expressziója jelentősen megnövekedett, de csökkent az alacsony szintet, amikor CAC1 katalógusa -siRNA adunk egyszerre (1,0000 ± 0,0000 versus katalógusa 2,1578 ± 0,2222 versus katalógusa 0,3967 ± 0,0078, p
< 0,05). Összehasonlítva a kontroll csoportban, BCL2 katalógusa mRNS másolatok is 30% -kal csökkent a cisplatin csoportban, de csökkent mintegy 60% -kal, a cisplatin + CAC1 katalógusa -siRNA csoport (1,0000 ± 0,0000 versus katalógusa 0,7090 ± 0,0210 versus
0,4030 ± 0,0171, p
< 0,05). Ezzel szemben, a p53
és a BAX
transzkript szintjének kezelt csoportot mérhetetlenül megerősített. Összehasonlítva a kontroll csoport, a P53
expressziós kapott majdnem kétszeres növekedés a ciszplatin egyedül csoport, amellett, hogy egy ötszörös növekedés a ciszplatin plusz CAC1
-siRNA csoport (1,0000 ± 0,0000 versus
3,0187 ± 0,1738 versus katalógusa 5,9957 ± 0,3926, P katalógusa < 0,05); A BAX katalógusa mRNS szintek majdnem két- és négyszeres mellnagyobbítás (1,0000 ± 0,0000 versus katalógusa 3,0237 ± 0,2581 versus katalógusa 4,9897 ± 0,2923, P katalógusa < 0,05), ill. 5. ábra expressziós profilját az apoptózis kapcsolatos gének válaszul cisplatin egyedül vagy CAC1 -siRNA kezelések. (A) Valós idejű reverz transzkripció (RT) PCR-analízise CAC1 katalógusa, P53 katalógusa, BAX katalógusa és BCL2 katalógusa mRNS expresszió AGS sejtek (a * P katalógusa < 0,05 között CAC1 katalógusa -siRNA csoport és a kezelt csoportban; #represents P katalógusa < 0,05 közötti cisplatin (CDDP) csoport és más kezelt csoportokban). (B) Western-blot elemzését CAC1 katalógusa, P53
, BCL2
és a BAX
expresszió AGS sejtekben.
Ezután Western blot vizsgálatokat végeztünk, hogy észleli a fehérje szint ezen gének után CAC1
leütés. Ezzel párhuzamosan a fent említett mRNS változások, BAX
és a P53
arra láthatóan megnövekedett mivel BCL2
volt downregulált a fehérje szinten (5B ábra).
Megbeszélés
Az ubiquitin-proteaszóma rendszer játszik sarkalatos szerepet közötti egyensúly fenntartása normális növekedés és ellenőrizetlen elterjedése szabályozásával a rengeteg sokféle celluláris fehérjék [6]. A Cullin család az ubiquitin ligáz, hagyományosan tagjai CUL1, 2, 3, 4a, 4b, 5
és 7
, jelenti a legnagyobb osztályát gyűrű típusú E3 ligáz (CRL) [6]. Anélkül tényleges katalitikus aktivitást, Cullins szolgál állványok, amelyek megkönnyítik a szerelvény multimer E3 ligáz komplexek át ubiquitin a E2-konjugáló enzim a szubsztrát. Cullin-mediált szubsztrát degradációs diktálja széles körű celluláris folyamatokat, mint a proliferáció, differenciálódás és apoptózis. Amint a sejt szabályozó mechanizmusok Cullin találkozás meghibásodások vagy zavarok, felhalmozódása onkoproteinek vagy túlzott lebomlását tumorszuppresszorok elkerülhetetlenül bekövetkezik, amely provokálhat sejtek malignus transzformáció és tumorigenezis [6]. Különösen cullin1
, a legtöbb jellemzett tagja az Cullin család, bebizonyosodott, hogy szorosan kapcsolódik a gyomor carcinogenesis, és annak overexpressziója jósolja rossz prognózisú betegek gyomor karcinóma [6, 7].
A expressziós profilok a rákkal kapcsolatos gének részben tükrözi a biológiai funkciók a rák patogenezisében. Mivel egy új tagja a Cullin család, CAC1
expressziós mintázatok kiterjedten vizsgálták egy korábbi vizsgálatban [5]. A cDNS-könyvtár elemzés, CAC1
expressziót találtunk normál gyomor, vékonybél, vastagbél, máj, tüdő, vese, izom, szív, emlőmirigy, a méh, agy, lép, nyirokcsomók, a magas szintje a vastagbél és a emlőmirigy [5]. Western blot vizsgálatokat Továbbá kimutatható CAC1
fehérje számos normális és rákos sejtvonalakban [5]. Ami a mi tanulmány az AGS és MGC803 gyomorrák sejtvonalakon magasabb volt CAC1 katalógusa kifejezés, mint a GES-1 gyomornyálkahártya-sejtvonal, amely azt jelzi, hogy CAC1 katalógusa is aktív szerepet játszanak a gyomorrák kialakulásában. Katalógusa géncsendesítéssel RNS interferencia egy hatékony módszer elemzése gén funkciója [8]. Itt sikeresen transzfektált NCsiRNA és három koncentrációban CAC1 katalógusa -siRNA be AGS sejteket. MTT elemzések azt mutatták, hogy a tömegpusztító potenciálját AGS sejtek hatékonyan gátolható 60nm és 90 nM CAC1 katalógusa -siRNA ugyanolyan mértékben, de nem sikerült befolyásolni 30 nM CAC1 katalógusa -siRNA vagy NC-siRNS. Nyilvánvaló volt, hogy CAC1
kedvezően hathatnak a sejtproliferációt a gyomorrák, amely összhangban volt a korábbi tanulmányok a HeLa sejtvonal [5]. MTT vizsgálatok, expresszáló HeLa-sejteket Flag-CAC1
ment magasabb proliferációs képessége van, mint a mock transzfektált kontroll sejtek, és a sejteket kezeltük CAC1
-siRNA szignifikánsan gátolta növekedési ráta [5]. Mi több, a valós idejű RT-PCR és Western blot vizsgálatok megerősítették, hogy a kifejezés a CAC1 katalógusa volt leghatékonyabban blokkolta 60nm CAC1 katalógusa -siRNA. Mindent összevetve, 60nm-ben határoztuk meg, hogy a legmegfelelőbb kísérleti dózisa RNSi későbbi vizsgálatok.
Általános szabályként, a normális sejtek szaporodását függ rendezett és hatékony sejtciklus folyamat, amely biztosítja a párhuzamos és továbbítása a genetikai információ az egyik cellából generációról a másikra. Más szavakkal, a dereguláció sejtproliferáció mindig abban rejlik, egy rendellenes sejtciklus. Under CAC1
-silencing feltételek, áramlási citometria Vizsgálatainkban megemelt aránya sejtek a G1 /G0 fázis és csökkentett sejtek az S fázisban. Lényegében CAC1
knockdown indukált G1 sejtciklus az AGS sejtek, amelyek összhangban volt az eredményeket a HeLa sejtvonal [5]. CAC1 katalógusa is képes kötődni a CDK2 katalógusa és stimuláló kináz aktivitást a G1 /S fázis átmenet nélkül jelentősen változik a megnyilvánulásai cyclinA katalógusa, ciklin katalógusa, cyclinD1 katalógusa, CDK2
, RB
, PTEN
, és így tovább [5]. Feltételezhető, hogy CAC1 katalógusa depresszió gyengíti a tevékenység CDK2 katalógusa és megszakítja a G1-S átmenet.
Apoptózis egyik alapvető biológiai jelenségek jellemzi átalakítások sora a sejtek morfológiai [9]. Ezenkívül apoptózis összehangoltan sejtproliferáció képez döntő kiegyenlítő mechanizmus, amely kezeli a nagyszámú fiziológiai eljárások, mint például szöveti homeosztázis és a normális fejlődés [9]. Under patológiás körülmények, az aberráns apoptózist általában hozzájárul sokat az iniciációs és progressziója rák [10-12], és még befolyásolják a daganatos sejtek érzékenysége a terápiás beavatkozások [13].
Egyértelmű aktivitását CAC1 katalógusa sejtciklus szabályozás felvetette annak lehetőségét, hogy ez több, vagy kevesebb, a folyamatban részt vevő az apoptózis. A jelenlegi vizsgálat során ez az arány a korai /késői apoptotikus sejtek fokozott ciszplatinnal kezelés, de ennél is nagyobb, így amikor CAC1 katalógusa kifejezést egyidejűleg gátolja RNSi. Azaz, apoptotikus indexek a ciszplatin plusz CAC1
-siRNA csoport kapjuk jelentős növekedése összehasonlítva azokkal a korábbi három csoport ép CAC1 katalógusa. Összesített adatok arra utalnak, hogy CAC1
gyengítheti a rákellenes hatás a ciszplatin, ellensúlyozva cisplatin indukálta apoptózis.
Apoptózis szabályozása azonban támaszkodik a hálózat anti- és proapoptotikus molekulák, például BCL2
család [14]. BCL2
(B-sejt CLL /lymphoma 2) egy proto-onkogén található a kromoszomális régióban 18q21.3, amely kódol egy antiapoptotikus 26 kDa-os fehérje tartalmú négy domént (BH1 ~ BH4)) [15]. Ez akadályozza a kibocsátás a citokróm C A mitokondrium, így megszüntető a kaszpázok aktiválása, és végül apoptózisának gátlásán [16]. Szerint a korai vizsgálatokban a túltermelése BCL2 katalógusa hajtja sejtek felé malignus transzformáció [17], és azt jósolja, a prognózis sok rosszindulatú [18-22]. Különösen a gyomorrák, gyakori kifejezés a BCL2 katalógusa gén mindig történt malignus szövetekben [23-25]. Magas expressziós szintje a BCL2 katalógusa gén, bár korrelált kevesebb agresszió gyomorrákban [26], volt sok köze a gyógyszer-rezisztencia a rákos sejtek [27]. Katalógusa BAX katalógusa (BCL2
társult X fehérje) gén található, a humán kromoszomális régióban 19q13.3-q13.4 [28]. A 21 kDa-os fehérjét kódoló, különösen, szolgál, mint egy proapoptotikus tagja a BCL2 katalógusa család. BAX
fehérje három BH domént (BH1, BH2 és BH3), és osztja sok homológiát mutat a BCL2
fehérje. Sőt, BAX katalógusa fehérje működik szupresszor BCL2 katalógusa hogy gyorsítsa apoptotikus sejthalál, az alkotó BAX katalógusa /BCL2 katalógusa komplexek vagy versenyeznek más BCL2 katalógusa célok [29]. Overexpressziója a BAX katalógusa gén volt negatív hatással a sejtnövekedésre humán gyomorrák miatt az apoptózis indukcióját, valamint a javítása sejt kemoszenzitivitás [30]. Éppen ellenkezőleg, a elnyomása BAX katalógusa génexpresszió tumorképzéshez gyomor hámban [23].
Cisplatin egyfajta kemoterápiás szer széles körben használják a szilárd daganatok, beleértve a gyomorrákot. Általánosan elfogadott, hogy az elsődleges citotoxikus hatása a DNS-károsodás és az azt követő apoptózis indukciója [31], így varianciák az apoptózis-asszociált gének ciszplatinnal kezelt sejtek metszően tükör a mechanizmusok mögöttes cisplatin indukálta apoptózis. Ami a tanulmány CAC1 katalógusa kifejezést túlszabályozott ciszplatin kezelés, de jelentősen csökkent expressziót siRNS kezelés ellenére előző ciszplatin. Továbbá, az alapul szolgáló a növekedés a cisplatin indukálta apoptózis, hogy a következő CAC1
hangtompító vannak egyidejű génexpressziós változások, beleértve az fokozza a P53
és a BAX
valamint a downregulációját BCL2.
Ezek a hatások azt sugallják, hogy CAC1 katalógusa erősíti cisplatin indukálta apoptózis expresszióját moduláló BCL2 katalógusa, BAX katalógusa és P53 katalógusa.
Mint korábban említettük, a BCL2 katalógusa látszólag található a konvergencia egy pár apoptotikus utak, és az arány a BCL2
Bax
fehérje úgy tűnik, hogy a végső meghatározója, hogy egy sejt belép a végrehajtási fázis [31]. Tény, hogy ez a BCL2
/BAX
arány, amely szabályozza az érzékenységet a sejtek apoptotikus hatásokkal [32, 33]. A folyamat során a cisplatin indukálta apoptózis, CAC1
megvédheti AGS sejteket az apoptózistól megváltoztatásával BCL2
/BAX
arányban, CAC1
hangtompító kihozott egy kifejezett növekedése BAX katalógusa és egy csökkenése BCL2 katalógusa, amely elősegíti, hogy az esemény a sejt apoptózis.
Érdekes, hogy a P53 katalógusa gén AGS sejtek túlszabályozott a ciszplatin kezelés, különösen szinkron elnyomása CAC1 katalógusa. Köztudott, hogy a p53
fontos szerepet játszik a menedzsment a sejtciklus és apoptózis. DNS-károsodásból eredő ciszplatin stimulálhatja expressziója a p53 katalógusa fehérje, ami mindkét expressziós downstream P21 katalógusa fehérje és a G1 sejtciklus [34]. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• Utility Az intranazális ketamin és Midazolam elvégzésére gyomor Leszívott gyermekek: egy kettős-vak, placebo-kontrollált, randomizált vizsgálatot
• Egyesületek a PTPN11 G /A polimorfizmus intron 3 Helicobacter pyloriseropositivity, gyomor atrófia és a gyomorrák japán