CDK povezana Cullin 1 može pospješuju proliferaciju stanica i inhibiraju cisplatin-inducirana apoptoza u AGS rak želuca stanične linije

CDK povezane Cullin 1 može potaknuti proliferaciju stanica i spriječiti uzrokovana cisplatinom apoptozu u AGS želučanog raka stanične linije pregled apstraktne pregled Pozadina pregled, rak želuca je čest i vrlo smrtonosan maligna bolest u svijetu, ali patogeneze ostaci nedostižan. U ovom istraživanju, mi se fokusirati na biološke funkcije CDK-povezane Cullin1 (CAC1
), novi gen iz Cullin obitelji, kod raka želuca, što može nam pomoći da dalje razumjeti podrijetlo ove maligne bolesti. Pregled metode
AGS i MGC803 želučanih staničnih linija raka i GES-1 želučanoj sluznici stanična linija je odabrano za proučavanje. Isprva CAC1 pregled izrazi tih staničnih linija su ispitani kvantitativnom realnom vremenu reverzne transkripcije lančanom reakcijom polimeraze (PCR) QRT-i Western blot ispitivanja, a zatim CAC1
male interferirajuće RNA (CAC1 pregled -siRNA) su dizajnirani i transfektirana u staničnu liniju AGS s relativno visokom razinom CAC1 Netlogu. Nakon CAC1 pregled su utihnuli, niz bioloških svojstava AGS stanica kao što staničnu proliferaciju, staničnog ciklusa, apoptoze i izrazima gena apoptoze povezanih (p53 Netlogu, BCL2 Netlogu i Bax Netlogu) bili su određena MTT, protočna citometrija, QRT-PCR i Western blot, respektivno. pregled Rezultati
CAC1 pregled izražavanja AGS ili MGC803 bila mnogo veća od one GES-1. Nakon CAC1 pregled, ekspresija je učinkovito deprimiran RNK interferencije u AGS stanica, dogodila značajna inhibicija rasta stanica. Nadalje, omjer stanica koje su tretirane s CAC1
-siRNA povećala u G1 fazi i smanjena je u S fazi, indikativan za G1 staničnog ciklusa. Što je još važnije, proporcije rane /kasne apoptoze u AGS stanica pojačan s cis-diamindikloroplatinu (cisplatin, CDDP) liječenja, ali u većoj mjeri s cisplatinom plus CAC1 pregled -siRNA. Zanimljivo, BCL2 pregled mRNA kopija pokazala je o smanjenju od 30% u cisplatinom grupi, ali pao za oko 60% u cisplatinom plus CAC1 pregled -siRNA grupe. S druge strane, p53 pregled mRNA izrazi dobiti gotovo dvostruko povećanje u cisplatinom skupini, pored pet puta povećanje u cisplatine plus CAC1 pregled -siRNA grupe, a Bax pregled razine mRNA imala gotovo dvo- i četiri puta povećanje, respektivno. U međuvremenu, P53 pregled, Bax pregled and BCL2 pregled je pokazao iste alteracija obrasce u Western blot preglede. Pregled zaključaka
CAC1 pregled može potaknuti proliferaciju stanica u AGS želučanog raka stanične linije. Osim toga, to može spriječiti AGS stanice iz pojavljuje uzrokovana cisplatinom apoptozu putem moduliranja izraze P53 Netlogu, BCL2 Netlogu i Bax Netlogu. Pregled Ključne riječi pregled Rak želuca CDK-povezan Cullin1 proliferaciju stanica ciklus apoptoze Pozadina rak pregled želuca je jedan od najčešćih zloćudnih tumora i drugi vodeći uzrok smrti od raka u svijetu, odgovorno za ukupno 989,600 novih slučajeva i 738,000 smrtnih slučajeva godišnje [1]. Tijekom proteklih godina, došlo je stalan pad učestalosti i smrtnosti rizik od karcinoma želuca u većini zemalja [2], s obzirom na ogromne zbivanja u dijagnozi i liječenju metodama. Međutim, rak želuca i dalje velika prijetnja za ljude, posebno one u zemljama u razvoju [1], a opstanak svih oboljelih pacijenata, čak i nakon ljekovitom kirurške resekcije i adjuvantna terapija, je manje od 40% [3] pregled. Epidemiološka istraživanja su otkrila brojne faktore rizika za rak želuca, a istraživanja molekularne biologije i dalje pokazuje da je želučana karcinogeneze sadrži brojne genetske i Epigenetske događaje, uključujući skupinu onkogena, tumor supresorski geni, regulatora staničnog ciklusa, stanične adhezijske molekule i popravka DNA gena [4] , Međutim, točni mehanizmi temeljni raka želuca nisu jasno definirani. Pregled CDK povezana Cullin1 je novi gen identificiran u karcinomu debelog crijeva. On obuhvaća otvoren okvir čitanja koji kodira slijed 37 kDa protein od 369 aminokiselina [5]. CAC1 pregled proteina sadrži Cullin domenu između aminokiselina 137 i 250, te je stoga klasificirana kao član Cullin obitelji E3 ubikvitinske [5] ligases. Histološki istrage utvrdio mogući povezanost CAC1 pregled izražavanja s patološkim značajkama i kliničkim fazama bolesnika s kolorektalnim karcinomom [5]. Štoviše, CAC1 pregled, in vitro pregled, izražena u stanični ciklus ovisan način sa visokom ekspresijom u kasnom G1 u S fazu [5]. Osobito, CAC1 pregled može potaknuti napredovanje staničnog ciklusa i stimulira aktivnost kinaze CDK2 pregled [5]. Ipak, malo se zna o svom izričaju i bioloških svojstava u rak želuca.
Ova studija je provedena kako bi se istražiti izražaj CAC1 Netlogu i istražiti funkciju koja CAC1 pregled nastupa u želučanom stanične linije karcinoma. Stanična linija AGS izabrana je kao model za proučavanje, jer to izraženo relativno visoku razinu CAC1 Netlogu onda CAC1 pregled, ekspresija je ušutkao RNA interferencije (RNAi), te nizom bioloških parametara koji se odnose na staničnu proliferaciju, staničnu ciklus i apoptozu, ispitana na odgovarajući način.
Metode
stanična kultura pregled ljudskih staničnih linija raka želučani (AGS i MGC803) i želučane sluznice stanične linije (GES-1) osigurana su Središnjeg laboratorija Medicinskog fakulteta, Xi 'an Sveučilište Jiaotong, Kina. Stanice su uzgojene u RPMI 1640 mediju (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), uz dodatak 10% novorođenčadi goveđeg fetusa (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 kU /L penicilin, 0,1 g /L streptomicina, 0.3 g /L L-glutamina i 0.85 g /L NaHCO 3 na 37 ° C u vlažnoj atmosferi s 5% CO 2.
siRNA transfekciju pregled CAC1 pregled -siRNA (sense- GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT 3 ', negativna-5 ' UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG3 '), CAC1 pregled negativna kontrola siRNA (NC-siRNA, osjećaj-5 'UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT 3 ', negativna-5 'ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3 ') kemijski sintetizirani su Shanghai GenePharma Corporation (SGC, Šangaj, Kina). Svi siRNA su pomiješani u Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, SAD) i transfektirani u skladu s siRNA protokol transfekcije. Učinkovitost CAC1 pregled obaranje je bila procijenjena s QRT-PCR i Western blot testovi. Pregled MTT test pregled MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolijevog bromida tiazolil plavo svjetlo plavo) kemosenzitivnost ispitivanje da bi se odredila brzina proliferacije AGS stanica želuca. Stanice su nasađene u koncentraciji od 5 × 10 3 stanica po jažici u pločicama s 96 jažica. Svi pokusi su provedeni u triplikatu. Stanice su inkubirane tijekom 24 sata, a podijeljeni su u pet skupina s pet različitih tretmana (null, NC-siRNA (60 nmol /L (nM)), siRNA (30nM) siRNA (60 nM), siRNA (90nm)) 0, 24, 48, 72 i 96 sati, na odgovarajući način. Dvadeset mikrolitara 5 mg /ml MTT (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA) u fosfatno puferiranoj slanoj otopini (PBS) se doda u svaku jamicu i stanice su ostavljene u inkubator još 4 sata na 37 ° C, nakon čega slijedi dodavanje 150 ul DMSO. Apsorbancija obojane otopine mjerena je potpuno automatiziran više detekciju čitačem mikroploče (POLARstar OPTIMA, BMG Lab, Offenburg, Germany) na 490 nm. Pregled: Analiza protočnom citometrijom
stanica (1 × 10 5 stanice /jažici) su sakupljene u ploče sa 6 jažica 24 sata, te se tretira sa različitim sredstvima (null, NC-siRNA, siRNA (60 nM)) tijekom 48 sati. Onda se skupe da se ispere s 0,01 mol /L hladnog (4 ° C) PBS okretanjem pri 800 okretaja u minuti, 4 ° C tijekom 8 minuta, a zatim su fiksirane u 4 ° C, 75% etanola tijekom noći. Fiksirane stanice su centrifugirane (kao gore) i ponovno se ispere s PBS-om. Zatim su stanice tretirane sa 100 ul DNase bez, RNaseA (10 mg /ml) i inkubira na 37 ° C tijekom 10 minuta. Konačno, stanice su obojene sa 100 ul 100 ug /ml propidij jodida (svjetlo slova) i inkubiraju na sobnoj temperaturi tijekom 30 minuta. Stanice iz svakog uzorka je smješteno u Falcon tube i očitana na FAC sortiranje (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Profili staničnog ciklusa se interpretirati sa B-D FAC sortirati Cell Quest programom.
Apoptoze analiza
stanice (1 × 10 5 stanica /bunariću) su inkubirane u ploče sa 6 jažica. Nakon 24 sata, bile su upućene sa različitim sredstvima (null, cisplatin (10 uM), cisplatin (10 uM) + NC-siRNA (60 nM), cisplatin (10 uM) + siRNA (60 nM)) u mediju bez seruma za 24 sati, a zatim sakupljeni su stanice bojane s Annexin V /PI koristeći Vybrant Test apoptoze kit Br.2 ​​(Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) i analizirane protočnom citometrijom. pregled Kvantitativna realnom vremenu reverzne transkripcije PCR pregled izraza od CAC1 u želučanom staničnim linijama raka
Ukupna RNA izdvojena je iz različitih staničnih linija (AGS, MGC803 i GES-1), postupkom kiselina gvanidinijevog-fenol-kloroform (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, USA), a cDNA su sintetizirani pomoću PrimeScriptTM 1. Strand cDNA Synthesis Kit-a (Invitrogen, Carlsbad, USA). Sekvencijama koriste za pojačanje su dizajnirani od strane Takara (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) i navedeni su kako slijedi: Forward primer 5'-OKS OKS TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; Obrnuti primer 5'-MAČKA TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3 '. p-aktin pregled Forward primer 5'TGG CAC CCA OKS CAA TGA -3 '; Obrnuti primer 5'-HAT AGT MAČKA AGT CCG CCT AGA AGC -3 '. Primeri su se u redovitim PCR reakcijama s cDNA iz stanica kako bi se procijenila njihova pravilan dizajn i sinteza. Nakon toga, PCR produkti su sekvencirani i njihovu sličnost u željene nukleotidnih sekvenci potvrdila. Relativna količina mRNA je određena korištenjem SYBR Green PCR Master Mix (AB, tnom City, Kalifornija, SAD) s genski specifične početnice za CAC1 Netlogu ili p-aktin Netlogu. Svi koraci su izvedeni u skladu s protokolom proizvođača. Real-time PCR reakcije su provedena na ABI 7500 termalni ciklički uređaj (tnom City, California, SAD) s BioRad iQ5 i Real vremenski sustav MyiQTM PCR za detekciju (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornija, SAD). Tri neovisna PCR testovi provedeni su od svakog uzorka, RT. Ekspresija CAC1 pregled mRNA u svakom uzorku se normalizira na p-aktin
a razina ekspresije bila je izračunata pomoću ΔΔCT (delta delta prag ciklusa) metodom. Pregled ekspresiju gena apoptoze povezanih u AGS stanične linije pregled izolacija RNA i cDNA sinteza je provedena kao što je navedeno. Niz primera su dizajnirani i sintetizirani Takara uključujući P53
(naprijed-5 '- Agencija Agencija TCC ACT ACA ACT ACA T-3 ' reverse-5 '- AGG ACA GGC ACA AAC ACG 3 '), BCL2 pregled (naprijed-5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA 3 ', reverse-5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG OKS TGA TCT-3 '), Bax pregled (naprijed-5 "- GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 '; reverse-5 '- AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ') i β-aktin pregled (naprijed 5'-TGG CAC CCA OKS CAA TGA a-3 '; reverse 5 '- CTA AGT MAČKA AGT CCG CCT AGA AGC -3 ') geni. Kao što je gore navedeno, u realnom vremenu PCR je provedena tri puta. PCR produkti su detektirani mjerenjem fluorescencije koja emitira na kraju svakog reakcijskog ciklusa. Prag ciklusa odgovara broju ciklusa potrebnih za otkrivanje fluorescencijskog signala iznad osnovne linije. P-aktin pregled gena služio kao unutarnje kontrole reakcije.
Razina ekspresije mRNA izračunate su pomoću 2 -ΔΔCT metode i izražena u relativne kvantifikacije jedinica. U detalje, prag ciklusa u ponudi gena p-aktin Netlogu a ciljni geni BCL2
, BAX
i P53
su određene u svakom uzorku, a za svako vremensko razdoblje. CT vrijednosti su normalizirani (ΔCT) oduzimanjem razine ekspresije referentnog gena β-aktin
iz odgovarajućih razina ekspresije BCL2
, BAX pregled i pregled P53 u svakom uzorku. Normalizirana ekspresija gena u tretiranim AGS stanicama analiziran u odnosu na netretirani podudarnim stanice, koje su mogle uzoraka kalibratora (ΔΔCT).
Western blot ispitivanja
pedeset mikrograma ukupnih proteina iz stanične linije AGS izdvoji se na 10% SDS poliakrilamid gel Trisglycine i prebačen na nitroceluloznu membranu (BioRad, Hercules, California, USA). Upijanje je ispitana s mišjim monoklonskim antitijelima, uključujući anti-CAC1 Netlogu (GeneTex, Irvine, Kalifornija, SAD, 1: 1500), anti-p-aktin pregled (Santa Cruz, Kalifornija, SAD, 1: 5000), anti-P53 pregled (Santa Cruz, Kalifornija, SAD, 1: 2000), anti-BCL2 pregled (Santa Cruz, Kalifornija, SAD, 1: 2000), i anti-BAX pregled (Santa Cruz, CA , SAD, 1: 2000). Vezanje antitijela je otkriven pomoću gela blot Imaging Systems (singeniÀnih G: kutija, Cambridge, UK). Prema uputama proizvođača pregled Statistički analizira
Sve statističke analize provedene su pomoću SPSS 13.0 softver (http: //www -01. IBM-a. com /software /analytics /SPSS /). Svaki test je izveden najmanje tri puta. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija i jednosmjerna ANOVA testom (dvostrani) da bi se odredila značajnost razlika u višestruke usporedbe. Rezultati su smatrali da su statistički značajne na P Netlogu. ≪ 0,05 pregled Rezultati
diferencijal izraz CAC1 Netlogu u rak želuca i mukoznih stanica linije pregled CAC1 pregled ekspresije mRNA se ocjenjuju s u realnom vremenu RT-PCR u tri stanične linije. Očito, CAC1 pregled je izražen u svaki od ispitanih staničnih linija (Slika 1A). Međutim, AGS i MGC803 stanične linije pokazuju višu razinu CAC1 pregled mRNA od stanične linije GES-1 (1,0000 ± 0,0000 i 0,9507 ± 0,0176 u odnosu na pregled 0,4340 ± 0,0414, P
0,05). Osim toga, CAC1 pregled proteina izraz u Western blot ispitima pokazali istu mijenja trend kao CAC1 pregled mRNA (Slika 1A). Slika izraz 1 CAC1 u ljudskim raka i mukoznih stanica linije želuca. (A) u realnom vremenu reverzna transkripcija (RT) -PCR i Western blot analiza CAC1 pregled izražavanja u AGS, MGC803 i GES-1 stanične linije (* označava P izvoznici < 0,05 između stanične linije GES-1 i druge stanične linije). (B) CAC1 pregled ekspresija je učinkovito pritisnuti 60 nM CAC1 pregled -siRNA u staničnoj liniji AGS na mRNA i proteina (* predstavlja P
0,05 između kontrolne skupine i CAC1
-siRNA skupina).
endogenih izraz CAC1 Netlogu su utihnuli strane RNAi tehnikom pregled prijelazne transfekcije AGS stanica s CAC1
-siRNA oligonukleotidima (60 nM) konstruirana protiv CAC1 pregled slijeda učinkovito inhibirali izraz CAC1 Netlogu. CAC1 pregled mRNA ekspresija je ispitana u realnom vremenu RT-PCR. Kao što se očekivalo, mRNA razina CAC1 Netlogu znatno je smanjen u CAC1 pregled -siRNA grupe (1.0000 ± 0,0000 u odnosu na Netlogu 0,3583 ± 0,0244, P izvoznici < 0,05), ali nije pokazala značajnu razliku između kontrole i NC-siRNA skupine (1,0000 ± 0,0000 u odnosu na Netlogu 0,9597 ± 0,0407, P izvoznici > 0,05) (Slika 1b). U međuvremenu, CAC1 ekspresija proteina također bio depresivan nakon siRNA tretmana u Western blot ispita (Slika 1b). Pregled CAC1 pregled utišavanje inhibira proliferacija stanica u AGS staničnoj liniji
Kako bi se istražilo ulogu CAC1 pregled ima u regulacija stanične proliferacije, AGS stanice obratili prijelazne transfekcije s CAC1 pregled -siRNA od tri različite doze (30nM, 60 nM i 90nm) su podvrgnuti MTT testom. Unutar četiri dana, CAC1 pregled utišavanje izložena različita inhibicijski učinak na proliferaciju stanica u skladu s različitim dozama CAC1 pregled -siRNA (slika 2). Optička gustoća (ODS) od kontrolne skupine, NC-siRNA Grupa i 30nm CAC1 pregled -siRNA grupa nije pokazala značajne razlike jedni s drugima (P Netlogu > 0,05), ali su bili viši od onih u 60 nM i 90nm CAC1 pregled -siRNA skupine (P izvoznici < 0,05). Zanimljivo, stanice obrađene 60 nM i 90nm CAC1 pregled -siRNA pokazala gotovo identične ODS od početka do kraja (P izvoznici > 0,05). Slika 2 Rast stanica inhibirana sljedeće CAC1 utišavanje. AGS stanice prolazno su transfecirane nula, NC-siRNA i tri koncentracije CAC1 pregled -siRNA za četiri dana, respektivno. stope rasta stanica su određena MTT testom. pregled, analizu staničnog ciklusa pregled usporedbi s kontrolom, udio stanica tretiranih sa CAC1 pregled -siRNA povećan za 28% ili tako u G1 /G0 (45.33 % ± 0,82% u odnosu na Netlogu 73.23% ± 3,04%, P izvoznici < 0,05), a smanjio se za oko 36% u s fazi (41,07% ± 1,07% u odnosu na Netlogu 5,40% ± 5,83%, P izvoznici < 0,05), bez značajne promjene u G2 /M fazi (13,61% ± 0,46% u odnosu na Netlogu 21,37% ± 2,88%, P izvoznici &0.05) (Slika 3). Ovi rezultati pokazuju da CAC1 pregled može poticati staničnog ciklusa napredovanje AGS stanica u G1 /S prijelaza. Slika 3 obaranje CAC1- inducirane G1 staničnog ciklusa u staničnoj liniji AGS. Analiza staničnog ciklusa AGS stanica tretiranih sa ili bez CAC1 pregled specifičnih siRNA protočnom citometrijom. Udio stanica značajno povišen u fazi G1, a smanjuje se u S fazi kada se tretiraju sa CAC1 pregled -siRNA (* predstavlja P
0,05 između kontrolne skupine i CAC1
-siRNA skupini). pregled obaranje CAC1 pregled poboljšava cisplatinom inducirana apoptoza
AGS stanice su podijeljene u četiri eksperimentalne skupine: kontrolna skupina je cisplatin tretirane (10 uM) Group, cisplatin plus NCsiRNA grupe, a cisplatin plus CAC1 pregled -siRNA (60 nM) skupina. U usporedbi s kontrolnom skupinom, proporcije rane /kasne apoptoze su pojačana sa cisplatinom liječenja, ali u većoj mjeri s cisplatinom plus CAC1 pregled -siRNA (2,01% ± 0,78% u odnosu na Netlogu 8,87% ± 3,65% u odnosu na
16.69% ± 3,15% /0,57% ± 0,25% u odnosu na Netlogu 3,89% ± 0,15% u odnosu na Netlogu 10.01% ± 0,09%, P izvoznici < 0,05) (Slika 4A i 4B), što je značilo da je obaranje CAC1
dramatično ubrzan uzrokovana cisplatinom apoptozu. Slika 4 CAC1 utišavanje poboljšane cisplatin-inducirane apoptoze u AGS staničnoj liniji. (A) Efekti cisplatina i kombinacije s NC-siRNA /CAC1 pregled -siRNA na rane i kasne apoptoze AGS stanica (* predstavlja P izvoznici < 0,05 između kontrolne skupine i liječene skupine; #represents P pregled i 0,05 između cisplatin (CDDP) skupinu i druge tretirane skupine). (B) Apoptoza obrasci AGS stanica su analizirani protočnom citometrijom. Pregled profile ekspresije gena apoptoze vezane
razine mRNA CAC1 Netlogu, BCL2 Netlogu, BAX pregled i P53 Netlogu ispitana su QRT-PCR. Inkubacija je od AGS stanica sa 10 uM cisplatinom i /ili 60 nM CAC1 pregled -siRNA 24 sata nije proizvesti zanimljive profile mRNA (Slika 5a). Pod cisplatinom liječenja, CAC1 pregled mRNA uvelike povećao, ali je pao na niske razine kada CAC1 pregled -siRNA je dodan istovremeno (1.0000 ± 0,0000 u odnosu na pregled 2,1578 ± 0,2222 u odnosu na pregled 0,3967 ± 0,0078, P
0,05). U usporedbi s kontrolnom skupinom, BCL2 pregled mRNA kopija pokazala je pad od 30% u cisplatinom grupi, ali pao za oko 60% u cisplatinom plus CAC1 pregled -siRNA skupina (1,0000 ± 0,0000 u odnosu na pregled 0,7090 ± 0,0210 u odnosu na Netlogu 0,4030 ± 0,0171, P izvoznici < 0,05). S druge strane, P53 pregled i Bax pregled razine transkript tretiranim skupinama znatno su poboljšane. U usporedbi s kontrolnom skupinom, na P53
izrazu koji se gotovo dvostruko povećanje u cisplatin sama grupa, uz pet puta povećanje u cisplatine plus CAC1 pregled -siRNA grupe (1,0000 ± 0,0000 u odnosu na
3,0187 ± 0,1738 u odnosu na pregled 5,9957 ± 0,3926, P izvoznici < 0,05); u Bax pregled razine mRNA imala gotovo dva i četiri puta pojačanje (1,0000 ± 0,0000 u odnosu na pregled 3,0237 ± 0,2581 u odnosu na Netlogu 4,9897 ± 0,2923, P izvoznici < 0,05), respektivno. Slika 5 profile ekspresije gena apoptoze vezane odgovor na samo cisplatinom ili s CAC1 -siRNA tretmana. (A) u realnom vremenu reverzne transkripcije (RT) -PCR analizu CAC1 Netlogu, p53 Netlogu, BAX pregled i BCL2 pregled mRNA u AGS stanicama (* predstavlja P izvoznici < 0,05 između CAC1 pregled -siRNA skupina i tretirane skupine, #represents P pregled 0,05 između cisplatin (CDDP) skupinu i druge tretirane skupine). (B) Western blot analiza CAC1 Netlogu, p53 Netlogu, BCL2 Netlogu i Bax pregled izražavanja u AGS stanicama.
Onda 'Western blot testovi su provedeni za otkrivanje razine proteina tih gena nakon CAC1 pregled obaranje. Usporedno s navedenim promjenama mRNA, BAX pregled i P53 pregled izrazito su regulira prema gore dok BCL2 pregled je regulirani na razini proteina (slika 5B). Pregled Rasprava pregled ubikvitina-proteasomalni sustav igra središnju ulogu u održavanju ravnoteže između normalnog rasta i nekontroliranu proliferaciju kontroliranjem obilje velik broj različitih staničnih proteina [6]. Cullin obitelj ubikvitinske ligases, tradicionalno sastavljen od CUL1, 2, 3, 4a, 4b, 5 Netlogu i 7 Netlogu, predstavlja najveću klasu RING tipa E3 ligases (CRLs) [6]. Bez intrinzičke katalitičku aktivnost, CULLINS služi kao skela koja olakšavaju montažu multimernih E3 Ugaze kompleksa i prijenos ubikvitin s E2-konjugiraju enzima na supstrat. Cullin posredovana degradacija supstrat diktira širok raspon staničnih procesa, kao što su proliferaciju, diferencijaciju i apoptozu. Nakon staničnih regulatornih mehanizama Cullin susrete smetnji ili perturbacije, akumulacija onkoproteinima ili prekomjerne razgradnje tumora smetnji neizbježno će se dogoditi, što može izazvati stanica u maligne transformacije i tumorigenezi [6]. Posebno, cullin1
, najviše naznačen član Cullin obitelji, pokazao je blisko povezana s želučanom karcinogeneze, a pojačana ekspresija predviđa lošu prognozu pacijenata s karcinomom želuca [6, 7].
Profile ekspresije gena vezanih za rak u dijelu u odnosu na njihove biološke značajke u patogenezi karcinoma. Biti novi član Cullin obitelji, CAC1 pregled izraz obrasci su opsežno istraživana u prethodnom istraživanju [5]. Pomoću cDNA knjižnice za analizu, CAC1 pregled ekspresija pronađen je u normalnom želudac, tanko crijevo, debelo crijevo, jetra, pluća, bubreg, mišić, srce, mliječne žlijezde, uterusa, mozga, slezene, limfnih čvorova, s visokim razinama u debelom crijevu i mliječna žlijezda [5]. 'Western blot testovi dodatno otkrivenih CAC1 pregled proteina domaćina normalnih i staničnih linija raka. [5] S obzirom na naše studije, AGS i MGC803 želučani stanične linije raka imali više CAC1 pregled izraz nego GES-1 želučane sluznice stanične linije koje ukazuju da CAC1 pregled može igrati aktivnu ulogu u želučanom karcinogeneze. Pregled utišavanje gena s RNA interferencije je snažan način za analizu funkcije gena [8]. Ovdje smo uspješno transficirana NCsiRNA i tri koncentracije CAC1 pregled -siRNA u AGS stanica. MTT analize pokazale su da je proliferacija potencijal AGS stanica snažno je inhibirana 60 nM i 90nm CAC1 pregled -siRNA u istoj mjeri, ali nije uspio da se pod utjecajem 30nm CAC1 pregled -siRNA ili NC-siRNA. Bilo je očito da CAC1 pregled može pozitivno utjecati na proliferaciju stanica karcinoma želuca, što je u skladu s prethodnim istraživanjima na stanične linije HeLa [5]. U MTT ispitivanja, HeLa stanice eksprimiraju Flag-CAC1
podvrgnut veću proliferaciju sposobnost od lažno transfektirane kontrolne stanice i stanice koje su tretirane s CAC1
-siRNA pokazala brzina značajno inhibira rast [5]. Štoviše, u realnom vremenu RT-PCR i Western blot analiza je potvrdila da je izraz CAC1 Netlogu učinkovito bio blokiran 60 nM CAC1 pregled -siRNA. Uzeti zajedno, 60 nM određeno je da je najprikladniji eksperimentalni doza za RNAi u kasnijim pregledima.
Kao opće pravilo, normalno proliferacija stanica ovisi o procesu uredno i učinkovito staničnog ciklusa koja osigurava dupliciranje i prijenos genetskih informacija iz jedne stanice generacije u generaciju. Drugim riječima, deregulacija stanične proliferacije uvijek leži u nenormalnog staničnog ciklusa. Pod CAC1 pregled -silencing uvjetima, protočna citometrija u naša studija otkrila je povišen udio stanica u G1 /G0 i smanjenu brzinu stanica u S fazi. U biti, CAC1 pregled obaranje izazvana G1 staničnog ciklusa u AGS stanice, što je u skladu s rezultatima iz stanične linije HeLa [5]. CAC1 pregled je također sposoban vezati se za CDK2 Netlogu te poticanje svoju aktivnost kinaze u G1 /S faze tranzicije bez uvelike mijenja izraze cyclinA Netlogu, ciklin Netlogu, cyclinD1 Netlogu, CDK2
RB pregled, PTEN pregled, i tako dalje. [5] Pretpostavlja se da CAC1 pregled, depresija slabi aktivnost CDK2 pregled i prekida G1-S tranziciju.
Apoptoza je jedan od osnovnih bioloških pojava karakterizira niz transformacija u morfologiju stanica [9]. Nadalje, apoptoza u dogovoru sa staničnom proliferacijom formira ključni mehanizam za balansiranje koji upravlja velik broj fizioloških postupaka, kao što homeostaze tkiva i normalnog razvoja [9]. U patološkim okolnostima, nenormalna apoptoza obično mnogo doprinosi pokretanju i napredovanja raka [10-12], pa čak i utjecati na osjetljivost stanica raka na terapijske intervencije [13].
Nedvosmislenu aktivnost CAC1 Netlogu u staničnom ciklusu regulacija podigao mogućnost da je, više ili manje, koji su uključeni u proces apoptoze. U trenutnoj studiji, udio rane /kasne apoptotičnih stanica povećava se s cisplatinom liječenja, ali je povećao još više kada CAC1 pregled izraz istovremeno je inhibirana RNAi. To jest, apoptotične indeksi cisplatine plus CAC1
-siRNA skupine dobiva značajan porast u usporedbi s onima iz prijašnjih tri skupine s netaknutom CAC1 Netlogu. Kumulativni podaci upućuju na to da CAC1 pregled može oslabiti učinak protiv raka cisplatina by suzbijanju uzrokovana cisplatinom apoptozu. Pregled Uredba apoptoze, međutim, oslanja na mrežu anti i proapoptotskih molekula, kao što su BCL2 pregled obitelji [14]. BCL2 pregled (B stanice CLL /limfom 2) je proto-onkogena koji se nalazi u 18q21.3 kromosomske regije, koja kodira za antiapoptotsku 26-kDa protein koji sadrži četiri BH domene (BH1 ~ BH4)) [15]. To može ometati oslobađanje citokroma c iz mitohondrija, pa ukidanje aktivaciju kaspaze i konačno inhibira apoptozu [16]. Prema prvim istraživanjima, prekomjerna ekspresija BCL2 pregled vozi stanice prema maligne transformacije [17] i predviđa prognozu u mnogim malignih bolesti [18-22]. Osobito kod raka želuca, česti izraz je BCL2 pregled gena uvijek se dogodila u malignim tkivima [23-25]. Visoke razine ekspresije na BCL2
gena, ali u korelaciji s manje agresije raka želuca [26], ima puno veze s otpornosti na lijekove od stanica raka [27]. Pregled Bax pregled (BCL2
povezane X protein), gen se nalazi u ljudskoj kromosomske regije 19q13.3-q13.4 [28]. Njegov 21-kDa protein kodiranje naročito služi kao proapoptotskih član BCL2
obitelji. Bax pregled protein sastoji se od tri područja BiH (BH1, BH2 i BH3) i dionica puno homologije s BCL2
proteina. Doista, Bax pregled protein djeluje kao supresor BCL2 Netlogu ubrzati umiranju stanica procesom apoptoze, formiranjem Bax pregled /BCL2
komplekse ili se natječu s drugim BCL2
ciljeva [29]. Hiperekspresija Bax pregled gena imalo negativan učinak na rast stanica u ljudskom karcinomu želuca, zbog indukcije apoptoze i poboljšanje staničnog kemosenzitivnost [30]. Naprotiv, potiskivanje Bax pregled inducirane tumorigenesis ekspresije gena u želučanom epitela [23].
Cisplatin je vrsta kemoterapijski agens široko koristi u čvrstim maligniteta, uključujući rak želuca. Općenito je prihvaćeno da je primarni citotoksični učinak oštećenja DNA i naknadno indukcija apoptoze [31], pa varijance gena apoptoze povezane u stanicama cisplatin tretira penetratingly ogledalo mehanizma koji je fundamentalan uzrokovana cisplatinom apoptozu. Što se tiče našeg istraživanja, CAC1 pregled, ekspresija je regulirano cisplatinom tretman, ali je bio izrazito regulirani od strane siRNA tretman unatoč prethodnom cisplatinom. Nadalje, u podlozi povećanje cisplantinom inducirane apoptoze koja slijedi CAC1 pregled utišavanje su istovremene ekspresije gena promjene uključujući upregulation p53
i Bax pregled kao i nizvodne regulacije BCL2.
Ti učinci ukazuju da CAC1 pregled jača uzrokovana cisplatinom apoptozu modulacijom izražavanje BCL2 Netlogu, Bax Netlogu i p53 Netlogu.
Kao što je ranije spomenuto, BCL2 pregled naizgled nalazi se na približavanje par apoptične putevi, a omjer BCL2 Netlogu da Bax pregled proteina čini se da je konačna odrednica da li je stanica ulazi u fazu izvršavanja [31]. U stvari, to je BCL2 pregled /Bax pregled odnos koji regulira osjetljivost stanica na apoptotičnih podražaja [32, 33]. U procesu cisplatinom apoptozi, CAC1 pregled može zaštititi AGS stanice od apoptoze mijenjanjem BCL2
/Bax pregled omjer, jer CAC1 pregled utišavanje izveo izrazito povećanje BAX pregled i smanjenje BCL2 Netlogu, što je pogodno za nastanak stanica apoptoze.
Zanimljivo, p53 pregled gena u AGS stanicama regulira prema gore s liječenja cisplatinom, pogotovo sa sinkronim suzbijanje CAC1 Netlogu. Poznato je da je P53 pregled igra važnu ulogu u upravljanju staničnim ciklusom i apoptozu. oštećenja DNA kao rezultat cisplatinom može potaknuti ekspresiju p53
proteina koji rezultira u oba izraza nizvodno P21
proteina i G1 staničnog ciklusa [34]. Ako suočen s nepopravljive štete DNA, p53 pregled proteina izaziva programiranu staničnu smrt [31]. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Korisnost intranazalnog ketamina i midazolama za obavljanje želučanih aspirata u djece: dvostruko slijepo, placebom kontrolirano, randomizirano study
• Udruge od PTPN11 G /A polimorfizma kod introna 3 s Helicobactor pyloriseropositivity, želuca atrofije i karcinoma želuca u Japanese