CDK associé Cullin 1 peut favoriser la prolifération cellulaire et inhiber l'apoptose induite par le cisplatine dans la lignée cellulaire de cancer gastrique AGS

CDK associé Cullin 1 peut favoriser la prolifération cellulaire et inhiber l'apoptose induite par le cisplatine dans la lignée cellulaire de cancer gastrique AGS
Résumé de l'arrière-plan
Le cancer gastrique est une tumeur maligne commune et hautement létale dans le monde, mais sa pathogénie reste insaisissable. Dans cette étude, nous nous concentrons sur les fonctions biologiques de Cullin1 CDK associé (CAC1
), un nouveau gène de la famille Cullin, dans le cancer gastrique, ce qui peut nous aider à mieux comprendre l'origine de cette tumeur maligne.
Méthodes
les AGS et MGC803 lignées cellulaires de cancer gastrique et l'estomac lignée cellulaire de la muqueuse GES-1 ont été sélectionnés pour l'étude. Dans un premier temps, CAC1 de les expressions de ces lignées cellulaires ont été examinés par quantitative en temps réel la transcription inverse polymerase chain reaction (qRT-PCR) et les examens de western blot, puis CAC1
petits ARN interférents (CAC1
-siRNA) ont été conçus et transfecté dans la lignée de cellules AGS avec un niveau relativement élevé de CAC1
. Une fois CAC1
a été réduit au silence, une série de caractéristiques biologiques des cellules AGS telles que la prolifération cellulaire, cycle cellulaire, l'apoptose, et les expressions de gènes liés à l'apoptose (P53
, BCL2
et BAX
) étaient déterminé par MTT, cytométrie en flux, les résultats de qRT-PCR et western blot, respectivement.
CAC1 de l'expression de l'AGS ou MGC803 était beaucoup plus élevé que celui de GES-1. Après avoir CAC1 de l'expression a effectivement été enfoncé par l'interférence d'ARN dans les cellules AGS, une inhibition significative de la croissance cellulaire est survenue. En outre, la proportion de cellules traitées avec CAC1
-siRNA augmentée dans la phase G1 et diminuée dans la phase S, ce qui indique l'arrêt du cycle cellulaire G1. Plus important encore, les proportions de début /fin de l'apoptose dans les cellules AGS ont été améliorés par la cis-diaminedichloroplatine (le cisplatine, le CDDP) le traitement, mais dans une plus large mesure avec cisplatine plus CAC1
-siRNA. Fait intéressant, l'ARNm des copies de BCL2 ont montré une diminution de 30% dans le groupe cisplatine, mais a chuté d'environ 60% dans le cisplatine plus CAC1
-siRNA groupe. A l'inverse, le P53 de les expressions d'ARNm obtenu une augmentation de près de deux fois dans le groupe cisplatine, en plus d'une augmentation de cinq fois dans le cisplatine plus CAC1
-siRNA groupe et le BAX de niveaux d'ARNm eu presque deux et quatre fois l'augmentation, respectivement. Pendant ce temps, P53
, BAX
et BCL2
a montré les mêmes modèles d'altération dans les examens de western blot. De Conclusions de la CAC1
peut favoriser la prolifération cellulaire dans la lignée cellulaire de cancer gastrique AGS. En outre, il peut empêcher les cellules AGS de l'expérience de l'apoptose induite par le cisplatine par modulation des expressions de P53
, BCL2
et BAX
.
Mots-clés
cancer gastrique CDK associé Cullin1 prolifération cycle cellulaire Apoptose Contexte cancer gastrique
est l'une des tumeurs malignes les plus courantes et la deuxième cause de décès par cancer dans le monde, responsable d'un total de 989,600 nouveaux cas et 738.000 décès par an [1]. Au cours des dernières années, il y a eu une baisse constante du risque d'incidence et de mortalité du cancer gastrique dans la plupart des pays [2], en raison des développements considérables dans les méthodes de diagnostic et de traitement. Cependant, le cancer gastrique reste une grande menace pour les gens, en particulier ceux des pays en développement [1], et la survie de tous les patients touchés, même après résection chirurgicale curative et traitement adjuvant, est inférieur à 40% de Epidemiologic [3]. les enquêtes ont découvert de nombreux facteurs de risque de cancer de l'estomac, et la recherche en biologie moléculaire indique en outre que la carcinogenèse gastrique comprend de nombreux événements génétiques et épigénétiques, impliquant un groupe d'oncogènes, des gènes suppresseurs de tumeurs, les régulateurs du cycle cellulaire, des molécules d'adhésion cellulaire et des gènes de réparation d'ADN [4] . Cependant, les mécanismes précis de cancer gastrique sous-jacent ne sont pas bien définies.
Cullin1 CDK associé est un nouveau gène identifié dans le carcinome colorectal. Elle en embrasse une séquence de cadre de lecture ouvert qui code pour une protéine de 37 kDa de 369 acides aminés [5]. Le CAC1
protéine contient un domaine cullin entre les acides aminés 137 et 250, et est donc considéré comme un membre de la famille cullin de E3 ubiquitine ligases [5]. investigations histologiques avaient établi une association possible de CAC1 de l'expression avec des caractéristiques pathologiques et les stades cliniques de patients atteints de carcinome colorectal [5]. Par ailleurs, CAC1
, in vitro
, a été exprimée d'une manière cellulaire dépendant du cycle avec une expression élevée à la fin du G1 à la phase S [5]. En particulier, CAC1
pourrait favoriser la progression du cycle cellulaire et de stimuler l'activité kinase de CDK2
[5]. Néanmoins, on sait peu sur son expression et les caractéristiques biologiques dans le cancer gastrique.
La présente étude a été réalisée pour étudier l'expression de CAC1
et d'explorer la fonction CAC1 de les exécute dans des lignées cellulaires de carcinome gastrique. La lignée cellulaire AGS a été choisi comme modèle pour l'étude parce qu'il a exprimé un niveau relativement élevé de CAC1
, puis CAC1 de l'expression a été réduit au silence par interférence ARN (ARNi), et une série de paramètres biologiques pertinents pour la prolifération des cellules, cellules le cycle et l'apoptose ont été examinés, en conséquence.
Méthodes
lignées cellulaires de cancer gastrique humaines
culture cellulaire (AGS et MGC803) et la lignée cellulaire de la muqueuse gastrique (GES-1) ont été fournis par le Laboratoire Central de Medical College, Xi 'une université Jiaotong, en Chine. Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) additionné de 10% de veau nouveau-né sérum (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 kU /L pénicilline, 0,1 g /L de streptomycine, 0,3 g /L de L-glutamine et 0,85 g /L de NaHCO 3 à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2.
siRNA transfection
CAC1
-siRNA (sens- GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT 3 ', antisens 5 ' UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG3 '), contrôle négatif de CAC1 siRNA (NC-siRNA, sens-5 'UUC UCC GAA UGT GUC ACG UTT 3 ', antisens 5 'ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3 ') ont été synthétisés chimiquement par Shanghai GenePharma Corporation (CGT, Shanghai, Chine). Tous les ARNsi ont été mélangés dans Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA) et transfectées selon le protocole Transfection siRNA. L'efficacité de l'effet de choc de CAC1 a été évaluée par des essais de transfert de Western qRT-PCR.
Test MTT The MTT (bromure de 3- [4,5-diméthylthiazol-2-yl] -2,5-diphényltétrazolium thiazolyle bleu colorant indicateur) essai de chimiosensibilité a été appliqué pour déterminer le taux de cellules gastriques AGS de prolifération. Les cellules ont été ensemencées à une concentration de 5 x 10 3 cellules par puits dans des plaques à 96 puits. Toutes les expériences ont été réalisées en triple. Les cellules ont été incubées pendant 24 heures et ont été divisées en cinq groupes de cinq différents traitements (null, NC-siRNA (60 nmol /L (nM)), l'ARNsi (30 nM), l'ARNsi (60nM), l'ARNsi (90nm)) de 0, 24, 48, 72 et 96 heures, de manière correspondante. Vingt microlitres de 5 mg /ml de MTT (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA) dans un tampon phosphate salin (PBS) ont été ajoutés par puits et les cellules ont été laissées à l'intérieur de l'incubateur pendant 4 h à 37 ° C, suivie par l'addition de 150 ul de DMSO. Analyse des flux cytométrique
cellules de Absorbance de la solution colorée a été mesurée par un multi-détection lecteur de microplaques entièrement automatisé (POLARstar OPTIMA, BMG Labtechnologies, Offenburg, Allemagne) à 490 nm. (1 × 10 5 cellules /puits) ont été récoltées dans des plaques de 6 puits pendant 24 heures et ont été traitées avec différents agents (null, NC-ARNsi ARNsi (60nM)) pendant 48 heures. Ensuite, ils ont été prélevés pour être lavé avec 0,01 mol /L à froid (4 ° C), du PBS par centrifugation à 800 tours par minute, 4 ° C pendant 8 minutes, puis fixés à 4 ° C, l'éthanol à 75% pendant une nuit. Les cellules fixées ont été centrifugés (comme ci-dessus) et on les lave à nouveau avec du PBS. Ensuite, les cellules ont été traitées avec 100 ul de, RNase exempte de DNase (10 mg /ml) et incubées à 37 ° C pendant 10 minutes. Enfin, les cellules ont été colorées avec 100 ul de 100 pg /ml d'iodure de propidium (sensible à la lumière) et mis en incubation à température ambiante pendant 30 minutes. Les cellules de chaque échantillon ont été placés dans des tubes Falcon et lus sur un trieur de FAC (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Les profils du cycle cellulaire ont été interprétés avec B-D FAC logiciel Trier Cell Quest.
Analyse Apoptose
cellules (1 x 10 5 cellules /puits) ont été incubés dans des plaques 6 puits. Au bout de 24 heures, elles ont été traitées avec différents agents (null, le cisplatine (10 um), de cisplatine (10 uM) + NF-siRNA (60nM), le cisplatine (10 pM) + siRNA (60nm)) dans un milieu exempt de sérum pendant 24 heures, les cellules alors recueillies ont été colorées avec l'annexine V /PI en utilisant le kit test d'apoptose Vybrant n ° 2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, Etats-Unis) et analysées par cytométrie en flux.
quantitative en temps réel inverse expression de transcription PCR de CAC1 dans l'ARN total de cancer gastrique lignées cellulaires a été isolées à partir de différentes lignées cellulaires (AGS, MGC803 et GES-1) en utilisant la méthode guanidinium-phénol-chloroforme acide (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, États-Unis), et des ADNc ont été synthétisés en utilisant le kit PrimeScriptTM premier brin d'ADNc Synthèse (Invitrogen, Carlsbad, USA). Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification ont été conçus par Takara (Takara Bio Inc., Shiga, Japon) et énumérées comme suit: amorce sens 5'-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; amorce inverse 5'-CAT TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3 '. amorce sens de β-actine 5'TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 '; amorce inverse 5'- CTA AGT CAT AGT GCC CCT AGA AGC A -3 '. Amorces ont été utilisées dans des réactions PCR avec l'ADNc à partir régulières des cellules afin d'évaluer leur conception et de synthèse appropriée. Ensuite, les produits de PCR ont été séquencés et leur similitude avec les séquences nucléotidiques désirées confirmées. La quantité relative d'ARNm a été déterminée en utilisant le SYBR GREEN PCR Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, Californie, États-Unis) avec des amorces spécifiques de gènes pour CAC1
ou β-actine
. Toutes les étapes ont été réalisées conformément au protocole du fabricant. Les réactions de PCR en temps réel ont été effectuées sur un cycleur thermique ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, Californie, États-Unis) avec le iQ5 BioRad et système MyiQTM PCR en temps réel de détection (BioRad Laboratories, Hercules, Californie, USA). Trois essais de PCR indépendantes ont été effectuées à partir de chaque échantillon de RT. L'expression de la CAC1 de l'ARNm dans chaque échantillon a été normalisée par rapport à β-actine
et le niveau d'expression a été calculée en utilisant la ΔΔCT (cycle de seuil delta delta) de l'Expression du procédé. De gènes liés à l'apoptose dans la lignée de cellules AGS
l'isolement de l'ARN et la synthèse d'ADNc ont été effectuées comme il est indiqué. Une série d'amorces ont été conçues et synthétisées par Takara y compris P53
(forward-5 '- CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3 ', reverse-5 '- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 '), BCL2
(forward-5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 ', reverse-5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), (forward-5 de BAX ' - GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 '; reverse-5 ' - AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ') et β-actine
(avant 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 '; reverse 5 '- CTA AGT CAT AGT GCC CCT AGA AGC A -3 ') gènes. Comme indiqué ci-PCR en temps réel a été effectuée trois fois. Les produits de PCR ont été détectés par mesure de la fluorescence d'émission à la fin de chaque cycle de réaction. Le cycle de seuil correspond au nombre de cycles requis pour détecter un signal de fluorescence au-dessus de la ligne de base. Le gène de la β-actine a servi de contrôle interne de la réaction.
Les niveaux d'expression de l'ARNm ont été calculées en utilisant le -ΔΔCT méthode 2 et exprimés en unités de quantification relative. Dans le détail, les cycles de seuil du
de β-actine gène de ménage et les gènes cibles de
BCL2, BAX
et P53
ont été déterminés dans chaque échantillon et pour chaque période de temps. valeurs CT ont été normalisées (ACt) en soustrayant les niveaux du gène de référence
β-actine expression des niveaux d'expression correspondants de la BCL2
, BAX
et P53
dans chaque échantillon. L'expression génique normalisée dans les cellules AGS traitées ont été analysées par rapport à leurs cellules correspondantes non traitées, qui ont agi comme des échantillons d'étalonnage (ΔΔCT).
Examens Western Blot
Cinquante microgrammes de protéine totale à partir de la lignée de cellules AGS a été séparé sur un 10% Trisglycine gel de SDS polyacrylamide et transférés sur une membrane de nitrocellulose (BioRad, Hercules, Californie, Etats-Unis). Le transfert a été sondé avec des anticorps monoclonaux de souris, y compris anti-CAC1
(GeneTex, Irvine, Californie, USA, 1: 1500), (Santa Cruz, CA, USA, 1: 5000) de anti-β-actine, anti-P53
(Santa Cruz, CA, USA, 1: 2000), anti-BCL2
(Santa Cruz, CA, USA, 1: 2000), et anti-BAX de (Santa Cruz, Californie , États-Unis; 1: 2000). liaison de l'anticorps a été détecté en utilisant les blot Imaging Systems Gel (Syngene G: BOX, Cambridge, Royaume-Uni). selon le protocole du fabricant Analyses statistiques
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel SPSS 13.0 (http: //www -01. ibm. com /software /analytics /spss /). Chaque essai a été effectué au moins trois fois. Les données ont été exprimées en moyenne ± écart-type, et One-way test ANOVA (recto-verso) a été effectuée afin de déterminer l'importance des différences dans les comparaisons multiples. Les résultats ont été considérés comme statistiquement significatifs à P
<. Résultats de 0,05
expression différentielle de CAC1
dans des lignées cellulaires de cancer et de la muqueuse gastrique
CAC1
expression de l'ARNm a été évaluée avec en temps réel RT-PCR dans les trois lignées cellulaires. De toute évidence, CAC1
a été exprimée dans chacune des lignées cellulaires étudiées (Figure 1A). Cependant, les lignées cellulaires AGS et MGC803 ont montré des niveaux plus élevés de CAC1 de l'ARNm de la lignée cellulaire GES-1 (1,0000 ± 0,0000 et 0,9507 ± 0,0176 contre
0,4340 ± 0,0414, P
< 0,05). En outre, l'expression de la protéine de CAC1 dans les examens de western blot a montré la même tendance de changement que l'ARNm (Figure de 1A) de CAC1. Figure expression 1 CAC1 dans des lignées cancéreuses et cellules de la muqueuse gastrique humaine. (A) en temps réel la transcription inverse (RT) -PCR et analyse par transfert Western de CAC1 de l'expression dans AGS, MGC803 et GES-1 lignées cellulaires (* représente P
< 0,05 entre la lignée cellulaire GES-1 et d'autres lignées cellulaires). (B) L'expression de CAC1 a effectivement été déprimée par -siRNA de 60nM CAC1 dans la lignée de cellules AGS de l'ARNm et des protéines (P * représente
< 0,05 entre le groupe témoin et le CAC1
-siRNA groupe).
expression endogène de CAC1
a été réduit au silence par la technique ARNi
de transfection transitoire de cellules AGS avec CAC1
-siRNA oligos (60nM) conçu contre la séquence CAC1 de inhibe efficacement la expression de CAC1
. L'expression de l'ARNm de CAC1 a été examinée en temps réel RT-PCR. Comme prévu, le niveau d'ARNm de CAC1
a considérablement diminué dans le groupe -siRNA de CAC1 (1.0000 ± 0.0000 contre
0,3583 ± 0,0244, P
< 0,05), mais n'a pas montré de différence significative entre le contrôle et les groupes NC-siRNA (1,0000 ± 0,0000 contre
0.9597 ± 0,0407, P
> 0,05) (figure 1B). Pendant ce temps, CAC1 expression de la protéine a également été déprimé après le traitement siRNA dans les examens de western blot (figure 1B).
CAC1
silençage inhibe la prolifération cellulaire dans la lignée cellulaire AGS
Afin d'étudier le rôle CAC1
joue dans la régulation de la prolifération cellulaire, les cellules AGS traitées par transfection transitoire avec CAC1 de -siRNA de trois doses différentes (30 nM, 60 nm et 90 nm) ont été soumis à un test MTT. Dans les quatre jours, CAC1 de l'silençage a présenté un effet inhibiteur distinct sur la prolifération cellulaire en fonction de différentes doses de CAC1 de -siRNA (figure 2). densités optiques (SACO) du groupe témoin, le groupe NC-siRNA et le groupe -siRNA du 30 nM CAC1 montré aucune différence significative entre eux (P
> 0,05), mais étaient plus élevés que ceux de la 60nM et 90nm CAC1 de groupes -siRNA (P
< 0,05). Fait intéressant, les cellules traitées avec 60nM et -siRNA de 90nm CAC1 ont montré ODs presque identiques du début à la fin (P
> 0,05). Figure 2 La croissance cellulaire a été inhibée silençage CAC1 suivante. les cellules AGS ont été transitoirement transfectées avec null, NC-siRNA et trois concentrations de CAC1 de -siRNA pour quatre jours, respectivement. Les taux de cellules de croissance ont été déterminées par des essais de MTT.
analyse du cycle cellulaire
comparaison avec le contrôle, la proportion de cellules traitées avec CAC1
-siRNA a augmenté de 28%, ou dans la phase G1 /G0 (45.33 % ± 0,82% par rapport à
73,23% ± 3,04%, P
< 0,05), et une diminution d'environ 36% dans la phase S (41,07% ± 1,07% par rapport à
5,40% ± 5,83%, P
< 0,05), sans changement significatif dans la phase G2 /M (13,61% ± 0,46% par rapport à
21,37% ± 2,88%, P
> 0,05) (Figure 3). Ces résultats indiquent que CAC1
peut favoriser la progression du cycle cellulaire des cellules AGS à travers la transition G1 /S. Figure 3 Knockdown de CAC1- G1 induit un arrêt du cycle cellulaire dans la lignée de cellules AGS. L'analyse du cycle cellulaire des cellules AGS traitées avec ou sans ARNsi spécifique de CAC1 de par cytométrie de flux. Proportion de cellules est sensiblement plus élevée dans la phase G1 pendant réduite dans la phase S, lorsqu'ils sont traités avec CAC1
-siRNA (* représente P
< 0,05 entre le groupe témoin et le groupe
CAC1 -siRNA).
Knockdown de CAC1
améliore l'apoptose induite par le cisplatine
les cellules AGS ont été divisés en quatre groupes expérimentaux: le groupe témoin, le groupe cisplatine traités (10 uM), le cisplatine, plus groupe NCsiRNA et le cisplatine ainsi CAC1
-siRNA (60nM) groupe. Par rapport au groupe témoin, les proportions de début /fin de l'apoptose ont été améliorés avec le traitement cisplatine, mais dans une plus grande mesure avec cisplatine plus CAC1
-siRNA (2,01% ± 0,78% par rapport à
8,87% ± 3,65% par rapport à
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25% par rapport à
3,89% ± 0,15% par rapport à
10,01% ± 0,09%, P
< 0,05) (figure 4A et 4B), ce qui signifie que le knockdown de CAC1
considérablement accéléré l'apoptose induite par le cisplatine. Figure 4 CAC1 silençage amélioré l'apoptose induite par le cisplatine dans la lignée cellulaire AGS. (A) Les effets du cisplatine seul et en combinaison avec NC-siRNA /CAC1
-siRNA sur l'apoptose précoce et tardive des cellules AGS (* représente P
< 0,05 entre le groupe témoin et les groupes traités; #represents P
< 0,05 entre le groupe de cisplatine (CDDP) et d'autres groupes traités). motifs (B) Apoptose de cellules AGS ont été analysées par les profils de gènes liés à l'apoptose par cytométrie en flux de. Expression
Les taux d'ARNm de CAC1
, BCL2
, BAX
et P53
ont été examinés par qRT-PCR. L'incubation des cellules AGS avec 10 uM de cisplatine et /ou de 60nM -siRNA CAC1 pendant 24 heures a produit les profils d'ARNm intéressants (figure 5A). Sous traitement par le cisplatine, l'expression de l'ARNm CAC1 fortement augmenté, mais a chuté à un niveau bas quand on a ajouté de CAC1 -siRNA simultanément (1,0000 ± 0,0000 ± 2,1578 par rapport à
0,2222 ± 0,3967 par rapport à
0,0078, P
< 0,05). En comparaison avec le groupe témoin, ARNm des copies de BCL2 ont montré une diminution de 30% dans le groupe cisplatine, mais a chuté d'environ 60% dans le cisplatine plus CAC1
-siRNA groupe (1.0000 ± 0.0000 contre
0,7090 ± 0,0210 contre
0,4030 ± 0,0171, P
< 0,05). A l'inverse, P53 BAX de niveaux de groupes traités de transcription
et ont été grandement améliorées. En comparaison avec le groupe témoin, l'expression P53
obtenu une augmentation de près de deux fois dans le seul groupe de cisplatine, en plus d'une augmentation de cinq fois dans le cisplatine plus CAC1
-siRNA groupe (1.0000 ± 0.0000 contre
3,0187 ± 0,1738 contre
5,9957 ± 0,3926, P
< 0,05); le BAX de niveaux d'ARNm avaient presque deux et quatre fois l'augmentation (1.0000 ± 0.0000 contre
3,0237 ± 0,2581 contre
4,9897 ± 0,2923, P
< 0,05), respectivement. La figure 5 profils d'expression de gènes liés à l'apoptose en réponse à la cisplatine seul ou avec des traitements CAC1 -siRNA. (A) en temps réel la transcription inverse (RT) analyse de -PCR de CAC1
, P53
, BAX
et BCL2
expression de l'ARNm dans les cellules AGS (* représente P
< 0,05 entre le groupe -siRNA de CAC1 et les groupes traités; #represents P
< 0,05 entre le groupe (CDDP) de cisplatine et d'autres groupes traités). (B) d'analyse Western blot de CAC1
, P53
, BCL2
et BAX de l'expression dans les cellules AGS.
Puis tests western blot ont été réalisées pour détecter les niveaux de ces gènes de protéines après CAC1
knockdown. En parallèle avec les changements d'ARNm susmentionnés, BAX
et P53
ont été nettement surexprimés alors
BCL2 a été downregulated sur le niveau de la protéine (figure 5B). Discussion de la
Le système ubiquitine-protéasome joue un rôle crucial dans le maintien de l'équilibre entre la croissance normale et la prolifération non contrôlée par le contrôle de l'abondance d'une grande variété de protéines cellulaires [6]. La famille cullin des ubiquitine ligases, traditionnellement composé de CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5 et 7

, représente la plus grande classe de ligases RING type E3 (LRC) [6]. Sans activité catalytique intrinsèque, Cullins servent échafauds qui facilitent l'assemblage des complexes multimériques E3 ligase et de transférer l'ubiquitine E2 de l'enzyme de conjugaison sur le substrat. Cullin dégradation du substrat médiée dicte une large gamme de processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et l'apoptose. Une fois les mécanismes de régulation de cellules de dysfonctionnements cullin de rencontre ou de perturbations, l'accumulation des oncoprotéines ou une dégradation excessive des suppresseurs de tumeur va inévitablement se produire, ce qui peut provoquer des cellules dans la transformation maligne et la tumorigenèse [6]. En particulier,
cullin1, le membre le plus caractérisé de la famille Cullin, a été prouvé être étroitement associée à la carcinogenèse gastrique et sa surexpression prédit un mauvais pronostic des patients atteints de cancer gastrique [6, 7].
Les profils d'expression des gènes liés au cancer en partie refléter leurs caractéristiques biologiques dans la pathogenèse du cancer. Être un nouveau membre de la famille de cullin, les profils d'expression de CAC1 ont été largement étudiés dans une précédente étude [5]. En utilisant un ADNc d'analyse bibliothèque, CAC1 de l'expression a été trouvée dans l'estomac normal, l'intestin grêle, du côlon, du foie, du poumon, du rein, du muscle, du cœur, des glandes mammaires, de l'utérus, le cerveau, la rate, les ganglions lymphatiques, avec des niveaux élevés dans le côlon et glande mammaire [5]. des essais de transfert de Western en outre détecté CAC1 de la protéine dans une série de lignées cellulaires normales et cancéreuses [5]. En ce qui concerne notre étude, les AGS et MGC803 lignées cellulaires de cancer gastrique avaient l'expression de CAC1 supérieure à la gastrique lignée cellulaire de la muqueuse GES-1, qui indiquent que CAC1
peut jouer un rôle actif dans la carcinogenèse gastrique.
silençage génique par interférence d'ARN est une méthode puissante pour l'analyse de la fonction génique [8]. Ici, nous avons transfecté avec succès NCsiRNA et trois concentrations de CAC1
-siRNA dans les cellules AGS. MTT analyses ont montré que le potentiel de prolifération de cellules AGS a puissamment inhibé par 60nM et -siRNA de 90nm CAC1 au même degré, mais il n'a pas pu être influencée par -siRNA de 30 nM CAC1 ou NC-ARNsi. Il était évident que CAC1
pourrait influer positivement sur la prolifération cellulaire dans le cancer gastrique, ce qui est en accord avec des études antérieures sur la lignée cellulaire HeLa [5]. Dans les examens MTT, les cellules HeLa exprimant Flag-CAC1
ont subi une capacité de prolifération supérieure à celle des cellules témoins simulées de transfection et les cellules traitées avec CAC1
-siRNA taux de croissance a montré une inhibition significative [5]. De plus, en temps réel RT-PCR et Western blot analyses ont confirmé que l'expression de CAC1
a été efficacement bloqué par -siRNA de 60nM CAC1. Pris ensemble, 60nM a été déterminée à la dose expérimentale la plus appropriée pour l'ARNi dans les examens ultérieurs.
En règle générale, la prolifération cellulaire normale dépend du processus du cycle cellulaire ordonnée et efficace qui assure la duplication et la transmission de l'information génétique d'une cellule génération à l'autre. En d'autres termes, la dérégulation de la prolifération cellulaire se situe toujours dans un cycle cellulaire anormale. Dans des conditions de -silencing CAC1, cytométrie en flux dans notre étude a révélé la proportion élevée de cellules dans la phase G1 /G0 et un taux réduit de cellules dans la phase S. En substance, l'effet de choc induit un arrêt du cycle cellulaire de G1 CAC1 dans les cellules AGS, ce qui était cohérent avec les résultats de la lignée cellulaire HeLa [5]. CAC1
était également capable de se lier à CDK2
et stimuler son activité de kinase à la transition G1 /S de phase sans changer grandement les expressions de cycline
, cycline
, cyclinD1
, CDK2
,
RB, PTEN
, etc. [5]. On suppose que CAC1 de la dépression atténue l'activité de la CDK2
et interrompt la transition G1-S.
L'apoptose est l'un des phénomènes biologiques de base, caractérisé par une série de transformations de morphologie cellulaire [9]. En outre, l'apoptose, de concert avec la prolifération cellulaire constitue un mécanisme d'équilibrage essentiel qui gère un grand nombre de procédures physiologiques tels que l'homéostasie tissulaire normale et le développement [9]. Dans des circonstances pathologiques, l'apoptose aberrante contribue généralement beaucoup à l'initiation et la progression du cancer [10-12] et même influencer la sensibilité des cellules cancéreuses à des interventions thérapeutiques [13].
L'activité sans équivoque de CAC1
dans le cycle cellulaire la régulation a soulevé la possibilité qu'il soit plus ou moins impliqué dans le processus d'apoptose. Dans l'étude actuelle, la proportion de cellules apoptotiques début /fin a augmenté avec le traitement cisplatine, mais il a augmenté encore plus quand CAC1 de l'expression a été simultanément inhibée par l'ARNi. Autrement dit, les indices apoptotiques de la cisplatine plus CAC1
groupe -siRNA obtenu une augmentation significative par rapport à celles des trois premiers groupes avec intact CAC1
. Les données cumulées impliquent que CAC1
peut affaiblir l'effet anti-cancer du cisplatine en contrecarrant l'apoptose induite par le cisplatine.
règlement de l'apoptose, cependant, repose sur un réseau de molécules anti et pro-apoptotiques tels que BCL2 de la famille [14].
BCL2 (cellules B CLL /lymphome 2) est un proto-oncogène située dans la région chromosomique 18q21.3 d', qui code pour une protéine anti-apoptotique 26 kDa contenant quatre domaines BH (BH1 BH4 ~)) [15]. Elle peut entraver la libération du cytochrome c à partir des mitochondries abrogeait ainsi l'activation des caspases et, enfin, inhiber l'apoptose [16]. Selon les premières études, la surexpression de BCL2
pousse les cellules vers la transformation maligne [17] et prédit le pronostic dans de nombreuses tumeurs malignes [18-22]. En particulier dans le cancer gastrique, l'expression fréquente du gène de la BCL2 se produit toujours dans les tissus malins [23-25]. les niveaux d'expression élevés de l'BCL2
gène, bien corrélée avec moins d'agressivité du cancer de l'estomac [26], avaient beaucoup à voir avec la résistance aux médicaments des cellules cancéreuses [27].
(le BCL2 de BAX
protéine X), le gène associé est situé dans la région chromosomique 19q13.3-à Q13.4 humaine [28]. Codant pour la protéine de 21 kDa, en particulier, sert d'élément pro-apoptotique de la famille BCL2
. BAX de la protéine est constituée de trois domaines BH (BH1, BH2 et BH3) et des actions beaucoup d'homologie avec la BCL2
protéine. En effet, les actes de protéines BAX comme un suppresseur de BCL2
pour accélérer la mort cellulaire apoptotique, en formant BAX
/BCL2
complexes ou en concurrence avec d'autres cibles BCL2 de
[29]. La surexpression du gène de la BAX a un effet négatif sur la croissance cellulaire dans le cancer gastrique humain, en raison de l'induction de l'apoptose et à l'amélioration de la chimiosensibilité cellule [30]. Au contraire, la suppression de l'expression génique induite par la tumorigenèse de BAX dans les épithéliums gastrique [23].
Cisplatine est une sorte d'agent chimiothérapeutique largement utilisé dans les tumeurs solides telles que le cancer gastrique. Il est généralement admis que l'effet cytotoxique primaire est un dommage à l'ADN et l'induction subséquente de l'apoptose [31], de sorte que les variations de gènes d'apoptose associée dans les cellules traitées au cisplatine miroir pénétrant les mécanismes sous-jacents de l'apoptose induite par le cisplatine. En ce qui concerne notre étude, CAC1 de l'expression a été augmentée par le traitement cisplatine, mais a été marquée par un traitement downregulated siRNA malgré le cisplatine précédent. En outre, la base de l'augmentation de l'apoptose induite par le cisplatine qui suit CAC1 s silençage sont concomitantes des altérations de l'expression génique, y compris la régulation positive de la P53 et Bax

ainsi que la régulation négative de BCL2.
Ces effets indiquent que CAC1
renforce l'apoptose induite par le cisplatine en modulant l'expression de BCL2
, BAX
et P53
.
Comme mentionné précédemment, BCL2
est apparemment situé à la convergence d'un couple de apoptotiques, et le rapport de BCL2
Bax de la protéine semble être le dernier facteur déterminant si une cellule entre dans la phase d'exécution [31]. En fait, il est BCL2
/BAX de ratio qui régit la sensibilité des cellules à des stimuli apoptotiques [32, 33]. Dans le processus de l'apoptose induite par le cisplatine, CAC1
pourrait protéger les cellules AGS de l'apoptose en modifiant BCL2
/BAX
rapport, pour CAC1
silencing mis en évidence une augmentation prononcée de BAX
et un diminution de BCL2
, ce qui est favorable à l'apparition de l'apoptose cellulaire. le plus intéressant, le P53
gène dans les cellules AGS a été régulée à la hausse par le traitement au cisplatine, en particulier avec suppression synchrone CAC1
. Il est bien connu que P53
joue un rôle important dans la gestion du cycle cellulaire et l'apoptose. lésions de l'ADN résultant de cisplatine peut stimuler l'expression de la protéine P53
qui se traduit à la fois l'expression de la protéine P21 en aval
et G1 arrêt du cycle cellulaire [34]. Si confrontés à des lésions de l'ADN irréparable, la P53
protéine déclenche la mort cellulaire programmée [31]. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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