CDK-asociované Cullin 1 môže podporovať proliferáciu buniek a inhibujú cisplatinou indukovanú apoptózu v žalúdku AGS karcinóm line

CDK-asociované Cullin 1 môže podporovať proliferáciu buniek a inhibujú cisplatinou indukovanú apoptózu v AGS žalúdočné rakovina bunkové línie
Abstrakt
pozadie
rakovina žalúdka je bežný a veľmi smrteľný zhubný nádor na svete, ale jej patogenéza zostáva nejasná. V tejto štúdii sme sa zamerali na biologických funkcií CDK-spojené Cullin1 (CAC1
), nové génu Cullin rodiny, pri rakoviny žalúdka, ktoré môžu pomôcť nám k ďalšiemu pochopeniu vzniku tohto zhubného nádoru.
metódy
AGS a MGC803 žalúdočné rakovina bunkové línie a žalúdočnej sliznice bunkové línie GES-1 boli vybrané pre štúdium. Spočiatku CAC1
prejavy týchto bunkových línií boli skúmané pomocou kvantitatívnej real-time reverznej transkripcie PCR (QRT-PCR) a Western blot skúšky, potom CAC1
malé interferujúce RNA (CAC1
-siRNA) boli navrhnuté a transfekovány do bunkovej línie AGS s relatívne vysokou úrovňou CAC1
. Raz CAC1
bol umlčaný, rad biologických vlastností AGS buniek, ako je proliferácia buniek, bunkového cyklu, apoptózy, a vyjadrenie génov apoptózy súvisiace s (P53
BCL2 stroje a BAX
) boli určená MTT, prietoková cytometria, QRT-PCR a Western blot, príslušne.
Výsledky
CAC1
expresie AGS alebo MGC803 bola oveľa vyššia ako u GES-1. Po CAC1
expresie bola účinne pokorený RNA interferencie v AGS bunkách, došlo k výraznej inhibíciu rastu buniek. Okrem toho sa podiel buniek ošetrených CAC1
-siRNA vzrástla v G1 fáze a pokles v S fáze, svedčí o zástavy G1 bunkového cyklu. Ešte dôležitejšie je, proporcie skoré /neskoré apoptózy v bunkách AGS boli obohatený o cis-diaminedichloroplatinum liečby (cisplatina, CDDP), ale vo väčšej miere s cisplatinou a CAC1
-siRNA. Je zaujímavé, že bcl2
mRNA kópií ukázala asi 30% zníženie v skupine cisplatina, ale klesla zhruba o 60% v cisplatinou a CAC1
-siRNA skupiny. Naopak, p53 mRNA
výrazy získať takmer dvojnásobný nárast v skupine cisplatinou, navyše k päťnásobné zvýšenie cisplatinou a CAC1
-siRNA skupiny a Bax
mRNA mal takmer dvoch a štvornásobne sa zväčšenie, resp. Medzitým P53
Bax stroje a bcl2
vykazovala rovnaký pozmeňovanie vzory v westernovým prenosom vyšetrenia.
Závery
CAC1
môžu podporovať proliferáciu buniek v žalúdočnej rakovina bunkovej línie AGS. Navyše môže zabrániť AGS buniek dochádza cisplatinou indukovanú apoptózu prostredníctvom modulácie výrazy P53
BCL2 stroje a BAX
.
Kľúčové
Karcinóm žalúdka CDK-spojený Cullin1 bunková proliferácia cyklu apoptózu pozadia rakovina žalúdka
je jedným z najčastejších zhubných nádorov a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu vo svete, ktorý je zodpovedný za celkovo 989,600 nových prípadov a 738,000 úmrtí ročne [1]. V priebehu minulých rokoch došlo k trvalému poklesu výskytu a úmrtnosti riziko vzniku rakoviny žalúdka vo väčšine krajín [2], vzhľadom k obrovským vývojom v diagnostických a liečebných metód. Avšak, rakovina žalúdka je stále veľkou hrozbou pre ľudí, a to najmä v rozvojových krajinách [1], a prežitie všetkých postihnutých pacientov, a to aj po kuratívnej chirurgickej resekcii a adjuvantnej liečbu, je nižší ako 40% [3]
. Epidemiologické vyšetrovanie odhalilo mnohých rizikových faktorov rakoviny žalúdka a výskumu molekulárnej biológie ďalej vyplýva, že žalúdočné karcinogenéze obsahuje početné genetické a epigenetické udalosti, zahŕňajúce zhluk onkogény, tumor supresorových génov, regulátorov bunkového cyklu, bunkových adhéznych molekúl a génov opravy DNA [4] , Avšak presný mechanizmus základnej rakovina žalúdka nie sú dobre definované.
CDK-spojené Cullin1 je nový gén identifikovaný u kolorektálneho karcinómu. To zahŕňa otvorený čítací rámec sekvencie otvorený, ktorá kóduje 37 kDa proteín o 369 aminokyselinách [5]. CAC1
proteín obsahuje Cullin doménu medzi aminokyselinami 137 a 250, a preto je klasifikovaný ako člen rodiny Cullin E3 ubiquitin ligázu [5]. Histologické vyšetrenie založil možnú asociáciu CAC1
prejavu s patologickými rysmi a klinických štádiách pacientov s kolorektálnym karcinómom [5]. Okrem toho, CAC1
, in vitro
, bola vyjadrená v závislá na bunkovom cykle spôsobom s vysokou expresiu v neskorej G1 do S fázy, [5]. Pozoruhodne, CAC1
mohol podporovať progresiu bunkového cyklu a stimulovať kinasovou aktivitu CDK2
[5]. Avšak, len málo je známe o jeho expresie a biologickými vlastnosťami v karcinómu žalúdka.
Tejto štúdia bola vykonaná s cieľom preskúmať expresiu CAC1
a preskúmať funkcie, ktorá CAC1
vykonáva v karcinómu žalúdka bunkových línií. Bunková línia AGS bola vybraná ako model pre štúdium, pretože sa vyjadril pomerne vysokú úroveň CAC1
, potom CAC1
výraz bol umlčaný RNA interferencia (RNAi), a sériu biologických parametrov relevantných pre proliferáciu buniek, buniek bolo vyšetrených cyklu a apoptóza, zodpovedajúcim spôsobom.
metódy
bunkovej kultúre
ľudských bunkových línií karcinómu žalúdka (AGS a MGC803) a žalúdočnej sliznice bunkové línie (GES-1) boli poskytnuté centrálne laboratóriá Medical College, Xi "Jiaotong univerzita, Čína. Bunky boli kultivované v médiu RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) doplnenom 10% novorodencov teľacieho séra (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 KU /l penicilínu, 0,1 g /l streptomycínu, 0,3 g /l L-glutamínu a 0,85 g /l NaHCO 3 pri 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére obsahujúcej 5% CO 2.
siRNA transfekcia
CAC1
-siRNA (sense- GGA UGG UGC CAU AGA ATT UCA 3 ', antisencie-5 ' UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG3 '), CAC1
negatívne kontrolné siRNA (NC-siRNA, sense-5 'UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT 3 ', antisencie-5 'ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3 ") boli chemicky syntetizované Shanghai GenePharma Corporation (SGC, Shanghai, Čína). Všetky siRNA boli zmiešané do Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) a transfektovaly podľa siRNA transfekcia protokolu. Účinnosť CAC1
Knockdown bola hodnotená s QRT-PCR a testy Western Blot.
MTT test
MTT (3- [4,5-dimetyl-thiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid thiazolyl blue marker farbivo) chemosensitivity skúška bola použitá pre určenie rýchlosti proliferácie AGS žalúdočných buniek. Bunky boli schovať v koncentrácii 5 x 10 3 buniek na jamku v 96-jamkových doštičkách. Všetky experimenty boli vykonané v troch opakovaniach. Bunky boli inkubované po dobu 24 hodín a boli rozdelené do piatich skupín po piatich rôznych spôsobov liečby (null, NC-siRNA (60 nmol /l (nM)), siRNA (30 nM), siRNA (60 nm), siRNA (90nm)) na 0 ° C, 24, 48, 72 a 96 hodín, zodpovedajúcim spôsobom. Dvadsať mikrolitrov 5 mg /ml MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) boli pridané do každej jamky a bunky boli ponechané v inkubátore po dobu ďalších 4 hodín pri teplote 37 ° C, a následne prídavok 150 ul DMSO. Absorbancia farebných roztoku bola meraná s plne automatizovaným multi-detekcia mikrodoštičiek (Polarstar OPTIMA, BMG Labtechnologies, Offenburg, Nemecko) pri 490 nm.
Prietokové cytometrie
bunky (1 x 10 5 buniek /jamka) boli zozbierané v 6-jamkových doštičkách po dobu 24 hodín, a boli liečené rôznymi látkami (null, NC-siRNA, siRNA (60 nm)) počas 48 hodín. Potom sa oddelí, premyje sa 0,01 mol /l chladu (4 ° C) PBS otáčaním pri 800 otáčkach za minútu, 4 ° C počas 8 minút, a potom fixované v 4 ° C, 75% etanolu po dobu cez noc. Fixované bunky boli centrifugovány (pozri vyššie) a znovu premyté PBS. Potom boli bunky ošetrené 100 ul DNázy-free, RNaseA (10 mg /ml) a inkubuje sa pri teplote 37 ° C počas 10 minút. Nakoniec boli bunky zafarbené 100 ul 100 ug /ml propidium jodidu (citlivé na svetlo) a inkubuje pri teplote miestnosti po dobu 30 minút. Bunky z každej vzorky sa umiestni do skúmaviek Falcon a čítať na FAC triedičky (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Profily bunkového cyklu boli interpretované s B-D FAC zoradiť Cell Quest softvéru.
Apoptózu analýza
buniek (1 x 10 5 buniek /jamku) boli inkubované v 6-jamkových doštičkách. Po 24 hodinách boli riešené rôznymi látkami (null, cisplatina (10 uM), cisplatina (10 uM) + NC-siRNA (60 nm), cisplatina (10 uM) + siRNA (60 nm)) v médiu po dobu 24 bez séra hodín, potom sa získané bunky boli zafarbené annexin V /PI pomocou Vybrant apoptóza testovacia súprava č.2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) a analyzované prietokovou cytometriou.
kvantitatívne real-time PCR s reverznej transkripciou
Expression z CAC1 žalúdočné nádorových bunkových línií
Celková RNA bola izolovaná z rôznych bunkových línií (AGS, MGC803 a GES-1) za použitia metódy kyseliny guanidinium-fenol-chloroform (TRIzolu, Invitrogen, Carlsbad, USA), a cDNA boli syntetizované pomocou PrimeScriptTM 1. Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). Sekvencia primérov použité pre amplifikáciu boli navrhnuté Takara (Takara Bio Inc., Shiga, Japonsko) a sú uvedené v: dopredný primer 5'-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; reverznej primer 5'-CAT TTA CAG SCS AAT GCC TTT ACT-3 '. beta-aktínu
dopredný primer 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA -3 '; reverznej primer 5'-CTA AGT AGT CAT CCG SCS AGA AGC -3 ". Primery boli použité v PCR reakciách s pravidelnými cDNA z buniek, aby bolo možné vyhodnotiť ich správne konštrukciu a syntézu. Následne sa PCR produkty boli sekvenované a ich podobnosť sa požadovaných nukleotidových sekvencií potvrdené. Relatívne množstvo mRNA bola stanovená za použitia SYBR GREEN PCR Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) s primermi génovo špecifických pre CAC1
alebo beta-aktínu
. Všetky kroky sa vykonávali podľa protokolu výrobcu. Real-time PCR reakcie boli vykonané na termocykléra ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) s BIORADE iQ5 a real-time PCR systém MyiQTM Detection (BIORADE Laboratories, Hercules, California, USA). Tri nezávislé PCR testy boli vykonané z každej vzorky RT. Expresia CAC1
mRNA v každej vzorke je normalizované na beta-aktínu stroje a hladina expresie bola vypočítaná s použitím ΔΔCT (delta prahová hodnota delta cyklus) metódou.
Expresiu génov apoptózy súvisiace s v bunkovej línii AGS
izolácie RNA a cDNA syntézy boli vykonané, ako je uvedené. Rad primery boli navrhnuté a syntetizované takara vrátane P53
(Forward-5 '- CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3 "reverse-5 ' - AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 '), BCL2
(vpred-5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 "reverse-5 '- TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), Bax
(vpred-5 ' - GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 '; reverse-5 ' - AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ") a β-aktínu
(vpred 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA a-3 '; zvrátiť 5 ' - CTA AGT AGT CAT CCG SCS AGA AGC -3 ") gény. Ako je uvedené vyššie real-time PCR bola vykonaná trikrát. PCR produkty boli detekované meraním fluorescencie emitujúca na konci každého reakčného cyklu. Prah cyklu zodpovedá počtu cyklov potrebných na detekciu fluorescenčného signálu nad základnou líniou. Beta-aktínu
gen slúžila ako vnútorná kontrola reakcie.
Expresné hladiny mRNA boli vypočítané za použitia -ΔΔCT metódy 2 a vyjadrené v relatívnych jednotkách kvantifikácie. V detaile, prahové cykly upratovanie gén beta-aktínu stroje a cieľové gény BCL2
, Bax stroje a P53
boli stanovené v každej vzorke a pre každé obdobie. Hodnoty Ct boli normalizované (ΔCT) odpočítaním úrovne expresie referenčného génu β-aktínu
od zodpovedajúcich expresných hladín v BCL2
, Bax stroje a P53
v každej vzorke. Normalizovaná expresia génu v bunkách ošetrených AGS bola analyzovaná vzhľadom k ich zodpovedajúcich neošetrených buniek, ktoré sa správal ako vzorky kalibrátorov (ΔΔCT).
Western blot vyšetrenie
Päťdesiat mikrogramov celkového proteínu z bunkovej línie AGS sa oddelí na 10% Trisglycine SDS polyakrylamidovom gélu a prenesené na nitrocelulózové membránu (BIORADE, Hercules, Kalifornia, USA). Blot bol testovaný s myšou monoklonálne protilátky, vrátane anti-CAC1
(GeneTex, Irvine, Kalifornia, USA, 1: 1500), anti-beta-aktínu
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 5000), anti-P53
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), anti-BCL2
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), a Anti-Bax
(Santa Cruz, CA , USA, 1: 2000). Väzba protilátky bola detekovaná pomocou gélu vymaž zobrazovacích systémov (Syngene G: truhlík, Cambridge, UK). Podľa protokolu výrobcu
štatistické analýzy
Všetky štatistické analýzy boli vykonané pomocou softwaru SPSS 13.0 (http: //www -01. IBM. com /softvér /analytics /SPSS /). Každý test bol vykonávaný najmenej trikrát. Údaje boli vyjadrené ako priemer ± smerodajná odchýlka, a One-way ANOVA testu (obojstranný) bola vykonaná na stanovenie významnosti rozdielov v rôznych porovnaniach. Výsledky boli považované za štatisticky významné pri P
. ≪ 0,05
Výsledky
rozdielnu expresiu CAC1
v karcinómu žalúdka a slizničnej bunkových línií
CAC1
mRNA expresia bola hodnotená s real-time RT-PCR v troch bunkových línií. Je zrejmé, že CAC1
bol vyjadrený v každej zo skúmaných bunkových líniách (obrázok 1a). Avšak, AGS a MGC803 bunkové línie vykazovali vyššie hladiny CAC1
mRNA, ako bunkové línie GES-1 (1,0000 ± 0,0000 a 0,9507 ± 0,0176 proti
0,4340 ± 0,0414, P
menšie ako 0,05). Okrem toho, CAC1
expresie proteínov vo Western Blot vyšetrení ukázala rovnaký trend ako meniace CAC1
mRNA (obrázok 1a). Obrázok 1 CAC1 v bunkách ľudského karcinómu žalúdka a slizničnej bunkových línií. (A) v reálnom čase reverznej transkripcie (RT) -PCR a western blot analýzy CAC1
expresie v AGS, MGC803 a GES-1 bunkovej línie (* znamená P Hotel &0,05 medzi bunkové línie GES-1 a ďalšie bunkové línie). (B) CAC1
expresie bola účinne stlačená 60Nm CAC1
-siRNA v bunkovej línii AGS na mRNA a proteínové úrovni (* znamená P Hotel &0,05 medzi kontrolnou skupinou a CAC1
-siRNA skupina).
Endogénna vyjadrenie CAC1
bol umlčaný RNAi techniky
Prechodné transfekcia AGS buniek CAC1
-siRNA oligonukleotidy (60Nm) určený proti CAC1
sekvencie účinne inhibuje výrazom CAC1
. CAC1
expresie mRNA bola skúmaná pomocou real-time RT-PCR. Ako sa dalo očakávať, hladiny mRNA CAC1
bol v CAC1
skupine -siRNA (1,0000 ± 0,0000 proti
0,3583 ± 0,0244, P Hotel &0,05) značne znížil, ale nepreukázala žiadny významný rozdiel medzi kontrolou a NC-siRNA skupiny (1,0000 ± 0.0000 proti
0,9597 ± 0,0407, P Hotel > 0,05) (obrázok 1b). Medzitým, výrazom CAC1 proteín bol tiež v depresii po liečbe siRNA v westernovým prenosom vyšetrenia (obrázok 1b).
CAC1
umlčanie inhibuje proliferáciu buniek v bunkovej línii AGS
Aby bolo možné skúmať úlohu CAC1
hrá v regulácia bunkovej proliferácie, AGS bunky riešené prechodnú transfekcia s CAC1
-siRNA troch rôznych dávkach (30 nM, 60 nm a 90nm), boli podrobené testu MTT. Počas štyroch dní, CAC1
umlčanie vykazoval zreteľný inhibičný účinok na bunkovú proliferáciu v závislosti na rôznych dávok CAC1
-siRNA (obrázok 2). Optická hustota (ODS) z kontrolnej skupiny, skupina NC-siRNA a na 30nm CAC1
skupina -siRNA nepreukázala žiadny významný rozdiel sa navzájom (P Hotel &0,05), ale boli vyššie ako tie, ktoré v 60Nm a 90nm CAC1
-siRNA skupiny (P Hotel < 0,05). Je zaujímavé, že bunky ošetrené 60Nm a 90nm CAC1
-siRNA ukázala takmer identické ODS od začiatku do konca (P Hotel > 0,05). Obrázok 2 Rast buniek bol inhibovaný nasledujúce CAC1 umlčania. AGS bunky boli prechodne transfekovány null, NC-siRNA a tri koncentrácie CAC1
-siRNA za štyri dni, v príslušnom poradí. Rýchlosť rastu buniek boli stanovené pomocou MTT testov.
Analýza bunkového cyklu
v porovnaní s kontrolný podiel buniek ošetrených CAC1
-siRNA zvýšila o 28%, alebo tak v G1 /G0 fáze (45.33 % ± 0,82% v porovnaní s
73.23% ± 3,04%, P Hotel &0,05), a znížili približne o 36% vo fáze s (41,07% ± 1,07% v porovnaní s
5,40% ± 5,83%, P Hotel < 0,05), bez zásadných zmien v G2 /M fázy (13,61% ± 0,46% oproti
21.37% ± 2,88%, P Hotel &0,05) (obrázok 3). Tieto výsledky ukazujú, že CAC1
môžu podporovať progresiu bunkového cyklu z AGS buniek pomocou G1 /S prechodom. Obrázok 3 Vyradenie CAC1- vyvolané G1 zastavenie bunkového cyklu v bunkovej línii AGS. Analýza bunkového cyklu AGS buniek ošetrených s alebo bez CAC1
-specifických siRNA pomocou prietokovej cytometrie. Podiel buniek bola významne zvýšená vo fáze G1 a zároveň znižuje vo fáze S, keď boli ošetrené CAC1
-siRNA (* znamená P Hotel &0,05 medzi kontrolnou skupinou a skupinou CAC1
-siRNA).
Vyradenie CAC1
zvyšuje cisplatinou indukovanú apoptózu
AGS buniek boli rozdelení do štyroch experimentálnych skupín: kontrolná skupina, skupina cisplatinu ošetrené (10 uM), cisplatiny a skupinových NCsiRNA a cisplatiny navyše CAC1
-siRNA (60Nm) skupinu. V porovnaní s kontrolnou skupinou, proporcie skoré /neskoré apoptóze bola posilnená s cisplatinou liečby, ale vo väčšej miere s cisplatinou a CAC1
-siRNA (2,01% ± 0,78% oproti
8,87% ± 3,65% v porovnaní s
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25% oproti 3,89%
± 0,15% v porovnaní s
10.01% ± 0,09%, P Hotel < 0,05) (Obrázok 4A a 4B), čo znamenalo, že vyradenie CAC1
výrazne urýchliť cisplatinou indukovanú apoptózu. Obrázok 4 CAC1 tlmenie hluku zvyšuje apoptózu indukovanú cisplatinou v bunkovej línii AGS. (A) Účinky cisplatiny samotnej a v kombinácii s NC-siRNA /CAC1
-siRNA na skoré a neskoré apoptózy AGS buniek (* predstavuje P Hotel &0,05 medzi kontrolnou skupinou a liečených skupín; #represents P Hotel &0,05 medzi skupinou cisplatina (CDDP) a ďalších liečených skupín). (B) apoptózy vzory AGS buniek boli analyzované pomocou prietokovej cytometrie.
Profily expresie génov apoptózy súvisiace s
Hladiny mRNA CAC1
BCL2
, Bax stroje a P53
boli skúmané QRT-PCR. Inkubácia buniek s AGS 10 uM cisplatiny a /alebo 60 nm CAC1
-siRNA po dobu 24 hodín robil vytvoriť zaujímavé mRNA profily (Obrázok 5A). Pri liečbe cisplatinou, CAC1
expresie mRNA výrazne zvýšila, ale klesla na nízku úroveň, keď CAC1
-siRNA bol pridaný súčasne (1,0000 ± 0,0000 proti
2,1578 ± 0,2222 proti
0,3967 ± 0,0078, p
< 0,05). V porovnaní s kontrolnou skupinou, bcl2
mRNA kópií ukázala pokles o 30% v skupine s cisplatinou, ale klesla zhruba o 60% v cisplatinou a CAC1
-siRNA skupina (1,0000 ± 0,0000 proti
0,7090 ± 0,0210 proti
0,4030 ± 0,0171, P Hotel &0,05). Naopak, P53 stroje a Bax
úrovne Prepis liečených skupín boli výrazne posilnená. V porovnaní s kontrolnou skupinou, na P53
výrazu získané takmer dvojnásobný nárast samotnej cisplatiny skupine, okrem päťnásobný nárast cisplatinou a CAC1
-siRNA skupiny (1,0000 ± 0,0000 oproti
3,0187 ± 0,1738 proti
5,9957 ± 0,3926, P Hotel < 0,05); na Bax
hladiny mRNA mal takmer dvoch a štyroch-násobné zväčšenie (1,0000 ± 0.0000 proti
3,0237 ± 0,2581 proti
4,9897 ± 0,2923, P Hotel < 0,05), resp. Obrázok 5 profilov expresie génov apoptózy súvisiace v reakcii na samotnú cisplatinou alebo s CAC1 -siRNA ošetrenie. (A) v reálnom čase reverznej transkripcie (RT) -PCR analýzu CAC1
, P53
, Bax stroje a BCL2
expresie mRNA v bunkách AGS (* znamená P Hotel &0,05 medzi CAC1
-siRNA skupine a liečenej skupiny; #represents P Hotel < 0,05 medzi skupinou cisplatina (CDDP) a ďalších exponovaných skupín). (B) Western blotting analýza CAC1
P53
bcl2 stroje a Bax
expresie v bunkách AGS.
Potom testy Western blot boli vykonané na zistenie hladiny proteínu týchto génov po CAC1
porazený. Súbežne s vyššie uvedenými zmenami mRNA, BAX stroje a P53
boli Výrazne sa zvyšuje, zatiaľ čo BCL2
bola downregulated na úrovni proteínu (obrázok 5B).
Diskusia
ubikvitin-proteazómu systému hrá kľúčovú úlohu v udržiavaní rovnováhy medzi normálny rast a nekontrolované proliferáciu riadením hojnosť veľkého množstva bunkových proteínov [6]. Cullin rodiny ubikvitinu Ligas, tradične skladajú z CUL1, 2, 3, 4a, 4b, 5 a 7
, predstavuje najväčšiu triedu RING typu E3 ligázu (CRL) [6]. Bez vlastnej katalytickú aktivitu, Cullins slúži ako lešenie, ktoré uľahčujú montáž multimerní komplexy E3 ligázu a prenášajú ubikvitin z E2-konjugácie enzýmu k substrátu. Cullin sprostredkovaná degradácia substrátu určuje celý rad bunkových procesov, ako je proliferácia, diferenciácia a apoptózy. Akonáhle bunkových regulačných mechanizmov Cullin stretávajú porúch alebo porúch, sa bude nutne dôjsť ku kumulácii onkoproteínov alebo nadmerné degradácii nádorových supresor, ktoré môžu vyvolať buniek do malígny transformáciu a vzniku nádorov [6]. Najmä cullin1
najviac charakterizovaný člen rodiny Cullin, bolo preukázané, že úzko spolupracuje s žalúdočné karcinogenéze a jeho nadmerná expresia predikuje zlú prognózu pacientok s karcinómom žalúdka [6, 7].
Expresné profily génov súvisiacich s rakovinou čiastočne odráža ich biologické funkcie v patogenéze rakoviny. Ako nový člen rodiny Cullin, CAC1
expresné vzory boli rozsiahlo skúmaná v predchádzajúcej štúdii [5]. Za použitia cDNA knižnica pre analýzu, CAC1
expresie bola nájdená v normálnom žalúdka, tenkého čreva, hrubého čreva, pečene, pľúc, obličiek, svalov, srdca, prsné žľazy, maternice, mozgu, slezine, lymfatických uzlín, s vysokými hladinami v hrubom čreve a prsnej žľazy [5]. Western blot testy dodatočne zistilo CAC1
proteínu v mnohých normálnych a nádorových bunkových línií [5]. Čo sa týka našej štúdii, AGS a MGC803 žalúdočné rakovina bunkové línie mali vyššie CAC1
výraz než žalúdočnej sliznice bunkové línie GES-1, ktoré by naznačovali, že CAC1
môže zohrávať aktívnu úlohu v žalúdku rakoviny.
umlčanie génov pomocou RNA interferencie je účinný spôsob pre analýzu génovej funkcie [8]. Tu sme úspešne transfektovaly NCsiRNA a tri koncentrácie CAC1
-siRNA do AGS buniek. MTT analýzy ukázali, že šírenie potenciál AGS buniek bola silne inhibovaná 60Nm a 90nm CAC1
-siRNA v rovnakej miere, ale nedokázal byť ovplyvňovaný 30nm CAC1
-siRNA alebo NC-siRNA. Bolo zrejmé, že CAC1
mohli mať pozitívny vplyv na proliferáciu buniek karcinómu žalúdka, čo bolo v súlade s predchádzajúcimi štúdiami na bunkovej línii Hela [5]. V MTT skúšky, Hela bunky exprimujúce Flag-CAC1
prešiel vyššia proliferačnú schopnosť ako falošne transfekované kontrolné bunky a bunky ošetrené CAC1
-siRNA ukázala významne inhibujú tempo rastu [5]. A čo viac, real-time RT-PCR a western blot analýzy potvrdili, že expresia CAC1
bol najúčinnejšie blokovaný 60Nm CAC1
-siRNA. Celkovo vzaté, 60 nm bola stanovená ako najvhodnejšia experimentálne dávka pre RNAi v nasledujúcich skúškach.
Ako všeobecné pravidlo platí, normálne bunkové proliferácie závisí na procese, riadny a efektívny bunkového cyklu, ktorý zaisťuje zdvojovanie a prenos genetickej informácie z jednej bunky generácie na generáciu. Inými slovami, deregulácii bunkovej proliferácie vždy leží v abnormálnom bunkovým cyklom. Pod CAC1
-silencing podmienok, prietoková cytometria v našej štúdia odhalila zvýšenú podiel buniek v G0 /G1 fáze a zníženú rýchlosť buniek v S fáze. V podstate možno povedať, CAC1
knockdown vyvolané G1 bunkového cyklu v bunkách AGS, čo je v súlade s výsledkami z bunkovej línie HeLa [5]. CAC1
bol tiež schopné sa viazať na CDK2 stroje a podporu jeho kinasovou aktivitu v G1 /S fázového prechodu, bez toho, aby výrazne meniť výrazy cyclinA
, cyklin
cyclinD1
, CDK2
, RB
, Ptení
, a tak ďalej [5]. Predpokladá sa, že CAC1
depresia zoslabuje aktivitu CDK2 stroje a preruší G1-S prechodu.
Apoptóza je jednou zo základných biologických javov, sa vyznačuje radom transformácií v bunkovej morfológii [9]. Okrem toho, apoptóza v súčinnosti s bunkovou proliferáciou tvoria kľúčovú kompenzačného mechanizmu, ktorá spravuje veľké množstvo fyziologických procesov, ako sú tkanivové homeostázy a normálny vývoj [9]. Za patologických podmienok, aberantne apoptóza zvyčajne veľmi prispieva k iniciácii a progresii karcinómu [10-12] a dokonca aj vplyv na citlivosť nádorových buniek k liečebných zákrokov [13].
Jednoznačne aktivitu CAC1
v bunkovom cykle regulácia zvýšila možnosť, že je viac alebo menej, podieľajúce sa na procese apoptózy. V tejto štúdii, je podiel skorých /neskoré apoptotických buniek sa zvyšuje s cisplatinou liečby, ale zvýšila ešte viac, keď sa CAC1
výraz súčasne inhibuje RNAi. To znamená, že, apoptotické indexy Cisplatinou + CAC1
skupiny -siRNA získať významné zvýšenie v porovnaní s tými, bývalých troch skupín s neporušenou CAC1
. Súhrnné údaje naznačujú, že CAC1
môžu oslabiť protirakovinové účinky cisplatiny neutralizáciou cisplatinou indukovanú apoptózu.
Reguláciu apoptózy, však, sa opiera o sieť anti- a proapoptotických molekúl, ako je napríklad rodina BCL2
[14]. BCL2
(B bunková CLL /lymfóm 2) je preto-onkogén umiestnený v chromozomálnej oblasti 18q21.3, ktorý kóduje pre antiapoptotickým 26-kDa proteín, ktorý obsahuje štyri domény BH (BH1 ~ BH4)) [15]. To môže brániť uvoľňovaniu cytochrómu c z mitochondrií, čím sa ruší aktiváciu kaspázy a nakoniec inhibíciu apoptózy [16]. Podľa skorších štúdií, nadmerná expresia BCL2
poháňa bunky k malígnej transformácii [17] a predpovedá prognózu v mnohých malígnych ochorení [18-22]. Zvlášť u karcinómu žalúdka, časté expresie génu bcl2
vždy došlo v malígnych tkanivách [23-25]. Vysoké hladiny expresie génu BCL2
, keď korelovaná s menšou agresivitou rakoviny žalúdka [26], mal veľa čo do činenia s rezistencie nádorových buniek [27].
Bax
(BCL2
gén spojený X proteín) sa nachádza v ľudskej chromozomálne oblasti 19q13.3-q13.4 [28]. Jeho 21-kDa kódujúci proteín, najmä slúži ako proapoptotickým člena rodiny BCL2
. BAX
proteín sa skladá z troch BH domén (BH1, BH2 a BH 3) a podiely veľa homológie s BCL2
proteín. Vskutku, Bax
proteín pôsobí ako supresor bcl2
k urýchleniu apoptotické bunkovej smrti, vytvorením Bax
/bcl2
komplexy alebo súťažiť s ostatnými BCL2
cieľov [29]. Zvýšená expresia génu Bax
malo negatívny vplyv na rast buniek v ľudskom karcinómu žalúdka, vzhľadom na indukciu apoptózy a k zvýšeniu bunkovej chemosenzitivity [30]. Naopak, potlačenie Bax
indukované tvorbe nádorov génovej expresie v žalúdku epitelu [23].
Cisplatina je druh chemoterapeutického činidlá široko používaný v pevných nádorových ochorení, vrátane rakoviny žalúdka. Je všeobecne známe, že jeho hlavnou cytotoxický účinok je poškodenie DNA a následné indukciu apoptózy [31], takže variancie apoptózu spojené génov v bunkách liečených cisplatina prenikavo zrkadlo základné mechanizmy cisplatinou indukovanú apoptózu. Čo sa týka našej štúdii, CAC1
expresie bola up-regulovaná cisplatinou liečby, ale bol výrazne downregulated pôsobením siRNA cez predchádzajúce cisplatiny. Okrem toho, je základom zvýšenie cisplatinou indukovanej apoptózy, ktorá nasleduje CAC1
tlmenie hluku sú sprievodné génovej expresie úpravy vrátane upregulaci P53 a Bax
, rovnako ako downregulace BCL2.
Tieto účinky naznačujú, že CAC1
posilňuje cisplatinou indukovanú apoptózu moduláciou expresie bcl2
BAX stroje a P53
.
Ako už bolo spomenuté predtým, bCL2
sa zdanlivo nachádza na konvergenciu pár apoptotické dráhy, a pomer BCL2
na Bax
proteínu sa zdá byť konečný určujúce, či je bunka vstupuje do realizačnej fázy [31]. V skutočnosti, to je BCL2
/Bax
pomer, ktorý určuje citlivosť buniek na apoptotické stimuly [32, 33]. V procese cisplatinou indukovanej apoptóze, CAC1
môže chrániť bunky pred apoptózou AGS zmenou BCL2
/Bax
pomer, pre tlmenie hluku CAC1
priniesla výrazný nárast BAX
a zníženie BCL2
, ktorý bol napomáhajúce vzniku bunkovej apoptózy.
zaujímavé je, že p53
génu v bunkách AGS bola up-regulovaná s liečbou cisplatinou, a to najmä s synchrónny potlačenie CAC1
. Je dobre známe, že P53
hrá dôležitú úlohu v riadení bunkového cyklu a apoptózy. Poškodenie DNA v dôsledku cisplatiny môže stimulovať expresiu p53
proteínu, ktorá vedie k expresii oboch nadväzujúcich P21
bielkovín a G1 zastavenie bunkového cyklu [34]. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Užitočnosť intranazálne ketamínu a midazolamu vykonať žalúdočné aspirates u detí s dvojito zaslepenej, placebom kontrolovanej, randomizovanej štúdii
• Združenie sa PTPN11 G /A polymorfizmus v IntronA 3 s Helicobactor pyloriseropositivity, žalúdočné atrofia a rakoviny žalúdka v japončine