CDK-associati Cullin 1 può promuovere la proliferazione cellulare e inibire l'apoptosi indotta da cisplatino nella linea di cellule di cancro gastrico AGS

CDK-associati Cullin 1 può promuovere la proliferazione cellulare e inibire l'apoptosi indotta da cisplatino nella linea di cellule di cancro gastrico AGS
Abstract
sfondo
cancro gastrico è un tumore maligno comune e altamente letale al mondo, ma i suoi resti patogenesi sfuggente. In questo studio, ci concentriamo sulle funzioni biologiche di Cullin1 CDK-associato (CAC1
), un nuovo gene della famiglia Cullin, nel carcinoma gastrico, che possono aiutare a comprendere ulteriormente l'origine di questa neoplasia.
metodi
le AGS e MGC803 linee di cellule di cancro gastrico e la linea cellulare mucosa gastrica GES-1 sono stati selezionati per lo studio. In un primo momento, CAC1
espressioni di queste linee cellulari sono stati esaminati da quantitativa in tempo reale trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (qRT-PCR) e gli esami Western Blot, quindi CAC1
small interfering RNA (CAC1
-siRNA) sono stati progettati e trasfettate nella linea cellulare AGS con un livello relativamente alto di CAC1
. Una volta CAC1
è stato messo a tacere, una serie di caratteristiche biologiche delle cellule AGS, come la proliferazione cellulare, ciclo cellulare, apoptosi, e le espressioni dei geni apoptosi legati (P53
, BCL2
e BAX
) erano determinata da MTT, citometria a flusso, rispettivamente qRT-PCR e Western blot,.
Risultati
CAC1
espressione di AGS o MGC803 era molto superiore a quella di GES-1. Dopo CAC1
espressione era effettivamente depresso da interferenze RNA nelle cellule AGS, si è verificata una significativa inibizione della crescita cellulare. Inoltre, la proporzione di cellule trattate con CAC1
-siRNA aumentato nella fase G1 e diminuita nella fase S, indicativo di arresto del ciclo cellulare G1. Ancora più importante, le proporzioni di inizio /fine apoptosi nelle cellule AGS sono stati rafforzati con cis-diaminedichloroplatinum (cisplatino, CDDP) trattamento, ma in misura maggiore con cisplatino più CAC1
-siRNA. È interessante notare che, BCL2
copie di mRNA hanno mostrato una diminuzione del 30% nel gruppo cisplatino, ma è sceso di circa il 60% in più cisplatino CAC1
-siRNA gruppo. Al contrario, il P53
espressioni mRNA ottenuto quasi un aumento di due volte nel gruppo cisplatino, oltre ad un aumento di cinque volte nel cisplatino più CAC1
-siRNA gruppo, e il BAX
livelli di mRNA avuto quasi un due e l'aumento di quattro volte, rispettivamente. Nel frattempo, P53
, BAX
e BCL2
ha mostrato gli stessi modelli di alterazione di esami Western Blot.
Conclusioni
CAC1
può promuovere la proliferazione delle cellule nella linea di cellule di cancro gastrico AGS. Inoltre, può impedire alle cellule AGS di sperimentare l'apoptosi indotta da cisplatino tramite modulazione espressioni di P53
, BCL2
e BAX
.
Parole
cancro gastrico CDK-associata Cullin1 proliferazione delle cellule del ciclo apoptosi Sfondo cancro gastrico
è uno dei tumori maligni più comuni e la seconda causa di morte per cancro nel mondo, responsabile di un totale di 989,600 nuovi casi e 738.000 morti ogni anno [1]. Negli ultimi anni, vi è stato un costante declino dell'incidenza e della mortalità rischio di cancro gastrico, nella maggior parte dei paesi [2], a causa delle enormi sviluppi nei metodi di diagnosi e trattamento. Tuttavia, il cancro gastrico rimane una grande minaccia per le persone, in particolare quelli dei paesi in via di sviluppo [1], e la sopravvivenza di tutti i pazienti affetti, anche dopo la resezione chirurgica curativa e la terapia adiuvante, è inferiore al 40% [3]
. Epidemiologica le indagini hanno portato alla luce numerosi fattori di rischio per il cancro gastrico, e la ricerca di biologia molecolare indica inoltre che la carcinogenesi gastrica comprende numerosi eventi genetici ed epigenetici, che coinvolge un gruppo di oncogeni, geni oncosoppressori, regolatori del ciclo cellulare, le molecole di adesione delle cellule e geni di riparazione del DNA [4] . Tuttavia, i meccanismi precisi di cancro gastrico sottostante non sono ben definiti.
Cullin1 CDK-associata è un nuovo gene identificato nel carcinoma del colon-retto. Esso comprende una sequenza open reading frame che codifica per una proteina di 37 kDa di 369 aminoacidi [5]. Il CAC1
proteina contiene un dominio Cullin tra gli amminoacidi 137 e 250, ed è quindi classificato come un membro della famiglia Cullin di E3 ubiquitina ligasi [5]. indagini istologiche avevano stabilito una possibile associazione di CAC1
espressione con le caratteristiche patologiche e stadi clinici dei pazienti carcinoma colorettale [5]. Inoltre, CAC1
, in vitro
, è stato espresso in modo ciclo cellulare-dipendente con elevata espressione nel tardo G1 alla fase S [5]. In particolare, CAC1
potrebbe promuovere la progressione del ciclo cellulare e stimolare l'attività chinasi di CDK2
[5]. Tuttavia, poco si sa circa la sua espressione e le caratteristiche biologiche di cancro gastrico.
Il presente studio è stato condotto per indagare l'espressione di CAC1
e per esplorare la funzione che CAC1
esibisce in linee cellulari di carcinoma gastrico. La linea cellulare AGS è stato scelto come modello per lo studio perché esprime livello relativamente alto di CAC1
, quindi CAC1
espressione è stata messa a tacere da RNA interference (RNAi), e una serie di parametri biologici rilevanti per la proliferazione cellulare, delle cellule ciclo e l'apoptosi sono stati esaminati, corrispondentemente.
Metodi
cellulare cultura
linee cellulari di cancro gastrico umano (AGS e MGC803) e linea di cellule della mucosa gastrica (GES-1) sono stati forniti dal Laboratorio centrale di Medical college, Xi 'una Università Jiaotong, Cina. Le cellule sono state coltivate in RPMI 1640 medium (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) supplementato con 10% vitello appena nato di siero (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 kU /L di penicillina, 0,1 g /l di streptomicina, 0,3 g /L di L-glutammina e 0,85 g /L NaHCO 3 a 37 ° C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO 2.
siRNA transfection
CAC1
-siRNA (senso- GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT 3 ', antisenso-5 ' UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG3 '), CAC1
controllo negativo siRNA (NC-siRNA, senso-5 'UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT 3 ', antisenso-5 'ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3 ') sono stati chimicamente sintetizzato da Shanghai GenePharma Corporation (SGC, Shanghai, Cina). Tutti i siRNA sono stati mescolati in Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) e trasfettate secondo il siRNA Transfection protocollo. L'efficienza di CAC1
atterramento è stata valutata con qRT-PCR e test Western Blot.
MTT assay
Il MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-il] -2,5-diphenyltetrazolium bromuro tiazolile blue assay chemiosensibilità colorante indicatore) è stato applicato per determinare il tasso di proliferazione delle cellule gastriche AGS. Le cellule sono state seminate ad una concentrazione di 5 × 10 3 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato. Le cellule sono state incubate per 24 ore e sono stati divisi in cinque gruppi con cinque diversi trattamenti (null, NC-siRNA (60 nmol /L (nm)), siRNA (30nm), siRNA (60nm), siRNA (90nm)) per 0, 24, 48, 72 e 96 ore, corrispondentemente. Venti sono stati aggiunti microlitri di 5 mg /ml di MTT (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA) in tampone fosfato (PBS) per pozzetto e le cellule sono stati lasciati all'interno dell'incubatore per altri 4 ore a 37 ° C, seguita da l'aggiunta di 150 microlitri DMSO. Assorbanza della soluzione colorata è stata misurata da un multi-lettore di piastre di rilevamento completamente automatizzato (Polarstar OPTIMA, BMG Labtechnologies, Offenburg, Germania) a 490 nm.
Analisi citofluorimetrica
cellule (1 × 10 5 cellule /pozzetto) sono state raccolte in 6 pozzetti per 24 ore, e sono stati trattati con diversi agenti (null, NC-siRNA, siRNA (60nm)) per 48 ore. Poi sono stati raccolti per essere lavata con 0,01 mol /L a freddo (4 ° C) PBS facendo girare a 800 rpm, 4 ° C per 8 minuti, e poi fissate in 4 ° C, 75% di etanolo per una notte. Le cellule fissate sono state centrifugate (come sopra) e nuovamente lavati con PBS. Quindi le cellule sono state trattate con 100 ml di, RNaseA-free DNasi (10 mg /ml) e incubate a 37 ° C per 10 minuti. Infine, le cellule sono state colorate con 100 pl di 100 ug /ml di ioduro di propidio (sensibili alla luce) e incubate a temperatura ambiente per 30 minuti. Le cellule provenienti da ogni campione sono stati collocati in tubi Falcon e leggere su un sorter FAC (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). I profili del ciclo cellulare sono stati interpretati con B-D FAC software Sort Cell Quest.
Analisi apoptosi
cellule (1 × 10 5 cellule /pozzetto) sono state incubate in 6 pozzetti. Dopo 24 ore, sono stati affrontati con diversi agenti (NULL, cisplatino (10 micron), cisplatino (10 micron) + NC-siRNA (60nm), cisplatino (10 micron) + siRNA (60nm)) in mezzo privo di siero per 24 ore, le cellule poi raccolti sono state colorate con annessina V /PI utilizzando kit di analisi apoptosi Vybrant No. 2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) ed analizzate mediante citometria a flusso.
quantitativa in tempo reale trascrizione inversa PCR
Expression di CAC1 in gastrici linee cellulari di cancro
RNA totale è stato isolato da varie linee cellulari (AGS, MGC803 e GES-1) con il metodo dell'acido guanidinio-fenolo-cloroformio (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, stati Uniti d'America), e cDNA sono stati sintetizzati utilizzando il kit PrimeScriptTM 1 ° Strand cDNA Synthesis (Invitrogen, Carlsbad, Stati Uniti d'America). sequenze primer utilizzati per l'amplificazione sono stati progettati da Takara (Takara Bio Inc., Shiga, Giappone) e riportate come segue: Forward Primer 5'-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; inversione di primer 5'-CAT TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3 '. β-actina
primer forward 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A -3 '; primer reverse 5'-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A -3 '. I primer sono stati usati in reazioni di PCR regolari con cDNA da cellule in modo da valutare la loro corretta progettazione e sintesi. Successivamente, i prodotti di PCR sono stati sequenziati e loro somiglianza alle sequenze nucleotidiche desiderate confermate. La quantità relativa di mRNA è stato determinato utilizzando il SYBR GREEN PCR Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, California, USA) con primer gene-specifici per CAC1
o β-actina
. Tutte le fasi sono state effettuate secondo il protocollo del produttore. Le reazioni PCR in tempo reale sono state effettuate su un termociclatore ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) con il iQ5 BioRad e MyiQTM Real-time PCR Detection System (BioRad Laboratories, Hercules, California, USA). Tre test PCR indipendenti sono state eseguite da ciascun campione RT. L'espressione di CAC1
mRNA in ogni campione è stato normalizzato contro β-actina
e il livello di espressione è stato calcolato utilizzando il ΔΔCT (delta del ciclo soglia delta) metodo
. L'espressione di geni apoptosi correlati nella linea cellulare AGS
isolamento di RNA e la sintesi del DNA sono state eseguite come indicato. Una serie di primer sono stati progettati e sintetizzati da Takara compreso P53
(forward-5 '- CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3 ', reverse-5 '- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 '), BCL2
(avanti-5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 ', reverse-5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), BAX
(avanti-5 ' - GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 '; reverse-5 ' - AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ') e β-actina
(forward 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 '; invertire 5 '- CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A -3 ') geni. Come indicato sopra real-time PCR è stata eseguita tre volte. I prodotti di PCR sono stati rilevati misurando la fluorescenza che emette al termine di ogni ciclo di reazione. Il ciclo soglia corrisponde al numero di cicli necessari per rilevare un segnale di fluorescenza di sopra della linea di base. Il β-actina
gene servito come il controllo interno della reazione.
I livelli di espressione di mRNA sono stati calcolati utilizzando il -ΔΔCT metodo 2 ed espressi in unità di quantificazione relativi. Nel dettaglio, i cicli di soglia della
gene housekeeping β-actina e dei geni bersaglio
BCL2, BAX
e P53
sono state determinate in ogni campione e per ogni periodo di tempo. valori CT sono stati normalizzati (ΔCT) sottraendo i livelli di espressione del gene di riferimento
β-actina dai corrispondenti livelli di espressione di BCL2
, BAX
e P53
in ogni campione. L'espressione genica normalizzato nelle cellule AGS trattati è stata analizzata rispetto ai loro corrispondenti greggia cellule, che hanno agito come campioni calibratore (ΔΔCT).
Esami Western blot
Cinquanta microgrammi di proteine ​​totali dalla linea cellulare AGS è stato separato su un 10% gel di poliacrilammide Trisglycine SDS e trasferiti ad una membrana di nitrocellulosa (BioRad, Hercules, California, USA). La macchia era sondato con anticorpi monoclonali murini, tra cui anti-CAC1
(GeneTex, Irvine, California, Stati Uniti d'America, 1: 1500), anti-β-actina
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 5000), anti-P53
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), anti-BCL2
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), e anti-BAX
(Santa Cruz, CA , USA; 1: 2000). analisi secondo il protocollo del produttore
statistica
Tutte le analisi statistiche sono state condotte utilizzando il software SPSS 13.0 (http: legame è stato rilevato utilizzando la macchia Imaging Systems Gel (scatola, Cambridge, UK Syngene G): Anticorpo //www. -01. ibm. com /software /analisi /SPSS /). Ciascun test è stato eseguito almeno tre volte. I dati sono stati espressi come media ± deviazione standard, e One-way ANOVA (fronte-retro) è stata eseguita per determinare la significatività delle differenze nei confronti multipli. I risultati sono stati considerati statisticamente significativi in ​​P
. ≪ 0.05
Risultati
espressione differenziale di CAC1
in linee tumorali e cellule della mucosa gastrica
CAC1
espressione di mRNA è stata valutata con real-time RT-PCR in tre linee cellulari. Ovviamente, CAC1
era espresso in ciascuna delle linee cellulari esaminati (Figura 1A). Tuttavia, le linee cellulari AGS e MGC803 hanno mostrato livelli più elevati di CAC1
mRNA rispetto alla linea cellulare GES-1 (1.0000 ± 0.0000 e 0,9507 ± 0,0176 contro 0,4340
± 0,0414, P
< 0,05). Inoltre, CAC1
espressione della proteina negli esami Western Blot ha mostrato la stessa tendenza che cambia come CAC1
mRNA (Figura 1A). Figura 1 espressione CAC1 in linee tumorali e cellule della mucosa gastrica umane. (A) in tempo reale trascrizione inversa (RT) -PCR e l'analisi Western Blot di CAC1
espressione in AGS, MGC803 e GES-1 linee cellulari (* rappresenta P
< 0,05 fra la linea cellulare GES-1 e altre linee cellulari). (B) CAC1
espressione era effettivamente depresso da 60nm CAC1
-siRNA nella linea di cellule AGS sul mRNA e livelli di proteina (* rappresenta P
< 0,05 tra il gruppo di controllo e il CAC1
-siRNA gruppo).
espressione endogena di CAC1
è stato messo a tacere con la tecnica RNAi
trasfezione transiente di cellule AGS con CAC1
-siRNA oligonucleotidi (60nm) progettato contro CAC1
sequenza efficacemente inibito la espressione di CAC1
. CAC1
espressione di mRNA è stata esaminata mediante real-time RT-PCR. Come previsto, il livello di mRNA di CAC1
era notevolmente diminuita nel CAC1
gruppo -siRNA (1.0000 ± 0.0000 contro
0,3583 ± 0,0244, P
< 0,05), ma non ha mostrato alcuna differenza significativa tra il controllo e gruppi NC-siRNA (1.0000 ± 0.0000 contro
0,9597 ± 0,0407, P
> 0,05) (Figura 1B). Nel frattempo, l'espressione della proteina CAC1 stato anche depresso dopo il trattamento siRNA negli esami Western Blot (Figura 1B).
CAC1
silenziamento inibisce la proliferazione delle cellule in cellule AGS
Al fine di indagare il ruolo CAC1
gioca in la regolazione della proliferazione cellulare, le cellule AGS affrontati da trasfezione transiente con CAC1
-siRNA di tre diversi dosaggi (30nm, 60nm e 90nm) sono stati sottoposti a test MTT. Entro quattro giorni, CAC1
silenziamento mostrato un effetto inibitorio sulla proliferazione cellulare distinta secondo diverse dosi di CAC1
-siRNA (Figura 2). densità ottiche (OD) del gruppo di controllo, il gruppo CN-siRNA e la 30nm CAC1
gruppo -siRNA non ha mostrato alcuna differenza significativa tra di loro (P
> 0,05), ma erano più alti rispetto a quelli del 60nm e 90 nm CAC1
gruppi -siRNA (P
< 0,05). È interessante notare che le cellule trattate con 60nm e 90nm CAC1
-siRNA mostrato OD quasi identiche dall'inizio alla fine (P
> 0,05). La figura 2 la crescita cellulare è stato inibito dopo silenziamento CAC1. cellule AGS sono state trasfettate con null, NC-siRNA e tre concentrazioni di CAC1
-siRNA per quattro giorni, rispettivamente. I tassi di crescita di cellule sono state determinate mediante saggi MTT.
analisi del ciclo cellulare
rispetto al controllo, la proporzione di cellule trattate con CAC1
-siRNA aumentato del 28% o giù di lì in fase G1 /G0 (45.33 % ± 0,82% contro
73.23% ± 3,04%, P
< 0,05), e una diminuzione di circa il 36% nella fase S (41.07% ± 1,07% rispetto al 5,40%
± 5,83%, P
< 0,05), con nessun cambiamento significativo nella fase G2 /M (13.61% ± 0,46% contro
21.37% ± 2,88%, P
> 0,05) (Figura 3). Questi risultati indicano che CAC1
può promuovere la progressione del ciclo cellulare delle cellule AGS attraverso il /S transizione G1. Figura 3 Knockdown di CAC1- indotta G1 arresto del ciclo cellulare nella linea cellulare AGS. analisi del ciclo cellulare delle cellule AGS trattati con o senza CAC1
siRNA SPECIFICI mediante citometria di flusso. Percentuale di cellule era marcatamente elevato in fase G1, mentre ridotta in fase S quando vengono trattati con CAC1
-siRNA (* rappresenta P
< 0,05 tra il gruppo di controllo e il CAC1
gruppo -siRNA).
Knockdown di CAC1
migliora l'apoptosi indotta da cisplatino
le cellule AGS sono stati divisi in quattro gruppi sperimentali: il gruppo di controllo, il gruppo (10 micron) cisplatino-trattati, il cisplatino PLUS GROUP NCsiRNA, e il cisplatino più CAC1
-siRNA (60nm) di gruppo. Rispetto al gruppo di controllo, le proporzioni di inizio /fine apoptosi sono stati migliorati con il trattamento cisplatino, ma in misura maggiore con cisplatino più CAC1
-siRNA (2,01% ± 0,78% rispetto al 8,87%
± 3,65% rispetto al
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25% contro
3,89% ± 0,15% contro
10,01% ± 0,09%, P
< 0,05) (Figura 4A e 4B), che significato che il colpo di CAC1
drammaticamente accelerato l'apoptosi indotta da cisplatino. Figura 4 CAC1 silenziamento migliorato l'apoptosi indotta da cisplatino in linea di cellule AGS. (A) Gli effetti del cisplatino solo e in combinazione con NC-siRNA /CAC1
-siRNA sulla precoce e tardiva apoptosi delle cellule AGS (* rappresenta P
< 0,05 tra il gruppo di controllo e gruppi trattati; #represents P
< 0,05 tra il gruppo cisplatino (CDDP) e altri gruppi trattati). (B) Apoptosis modelli di cellule AGS sono stati analizzati mediante citometria a flusso.
Profili di espressione di geni apoptosi legati
I livelli di mRNA di CAC1
, BCL2
, BAX
e P53
sono stati esaminati da qRT-PCR. L'incubazione delle cellule AGS con 10 micron cisplatino e /o 60nm CAC1
-siRNA per 24 ore ha prodotto i profili di mRNA interessanti (Figura 5A). Durante il trattamento con cisplatino, CAC1
espressione dell'mRNA notevolmente aumentato, ma è sceso a un basso livello quando CAC1
-siRNA è stato aggiunto contemporaneamente (1.0000 ± 0.0000 contro
2,1578 ± 0,2222 contro 0,3967
± 0,0078, P
< 0,05). Rispetto al gruppo di controllo, BCL2
copie di mRNA hanno mostrato una diminuzione del 30% nel gruppo cisplatino, ma è sceso di circa il 60% in più cisplatino CAC1
-siRNA gruppo (1.0000 ± 0.0000 contro
0,7090 ± 0,0210 contro
0,4030 ± 0,0171, P
< 0,05). Al contrario, P53 BAX
livelli di trascrizione dei gruppi trattati
e sono stati notevolmente migliorati. Rispetto al gruppo di controllo, l'espressione P53
ottenuto quasi un aumento di due volte nel gruppo solo cisplatino, oltre ad un aumento di cinque volte nel cisplatino più CAC1
-siRNA gruppo (1.0000 ± 0.0000 contro
3,0187 ± 0,1738 contro 5,9957
± 0,3926, P
< 0,05); il BAX
livelli di mRNA avevano quasi un due e l'aumento di quattro volte (1.0000 ± 0.0000 contro
3,0237 ± 0,2581 contro 4,9897
± 0,2923, P
< 0,05), rispettivamente. Figura 5 profili di espressione di geni apoptosi legati in risposta a cisplatino da solo o con trattamenti CAC1 -siRNA. (A) in tempo reale trascrizione inversa (RT) analisi -PCR di CAC1
, P53
, BAX
e BCL2
espressione di mRNA nelle cellule AGS (* rappresenta P
< 0,05 fra CAC1
gruppo -siRNA e gruppi trattati; #represents P
< 0,05 tra il gruppo cisplatino (CDDP) e di altri gruppi trattati). (B) Analisi Western blotting di CAC1
, P53
, BCL2
e BAX
espressione in cellule AGS.
Poi sono stati condotti test Western Blot per rilevare i livelli di proteine ​​di questi geni dopo CAC1
atterramento. Parallelamente alle suddette variazioni di mRNA, BAX
e P53
sono stati marcatamente sovraregolati mentre
BCL2 era downregulated a livello della proteina (Figura 5B).
Discussione
Il sistema ubiquitina-proteasoma svolge un ruolo fondamentale nel mantenere l'equilibrio tra la normale crescita e la proliferazione incontrollata controllando l'abbondanza di una grande varietà di proteine ​​cellulari [6]. La famiglia Cullin di ligasi ubiquitina, tradizionalmente composta da CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5
e 7 foto, rappresenta la più grande classe di ligasi RING-E3 (CRL) [6]. Senza attività catalitica intrinseca, Cullins servono come impalcature che facilitano l'assemblaggio di multimeric complessi ligasi E3 e trasferire ubiquitina dal enzima E2-coniugando al substrato. degrado substrato Cullin mediata impone una vasta gamma di processi cellulari come la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi. Una volta che i meccanismi regolatori cellulari dei malfunzionamenti Cullin incontro o perturbazioni, si verificherà inevitabilmente l'accumulo di oncoproteine ​​o eccessivo degrado delle soppressori tumorali, che possono provocare le cellule in trasformazione maligna e tumorigenesi [6]. In particolare,
cullin1, il membro più caratterizzato della famiglia Cullin, è stato dimostrato di essere strettamente associato con la carcinogenesi gastrica, e la sua sovraespressione prevede cattiva prognosi dei pazienti con carcinoma gastrico [6, 7].
I profili di espressione di geni legati al cancro in parte riflettere le loro caratteristiche biologiche nella patogenesi del cancro. Essendo un romanzo membro della famiglia Cullin, CAC1
modelli di espressione sono stati ampiamente studiati in uno studio precedente [5]. Utilizzando cDNA analisi biblioteca, CAC1
espressione è stata trovata nello stomaco normale, intestino tenue, colon, fegato, polmone, rene, muscolo, cuore, ghiandola mammaria, utero, cervello, milza, linfonodi, con alti livelli nel colon e ghiandola mammaria [5]. test Western Blot inoltre rilevati CAC1
proteina in una serie di linee di cellule normali e tumorali [5]. Per quanto riguarda il nostro studio, le AGS e MGC803 linee di cellule di cancro gastrico hanno avuto maggiore CAC1
espressione rispetto alla linea di cellule della mucosa gastrica GES-1, che indicano che CAC1
può svolgere un ruolo attivo nella carcinogenesi gastrica.
silenziamento genico da RNA interference è un potente metodo per analizzare la funzione del gene [8]. Qui, abbiamo trasfettato con successo NCsiRNA e tre concentrazioni di CAC1
-siRNA in cellule AGS. MTT analisi hanno mostrato che il potenziale proliferazione delle cellule AGS è stata potentemente inibita da 60nm e 90nm CAC1
-siRNA nella stessa misura, ma non è riuscito ad essere influenzato da 30nm CAC1
-siRNA o NC-siRNA. Era evidente che CAC1
potrebbe influenzare positivamente la proliferazione delle cellule del cancro gastrico, che era in accordo con gli studi precedenti sulla linea cellulare HeLa [5]. In esami MTT, cellule HeLa che esprimono Flag-CAC1
sottoposti capacità proliferazione superiore alle cellule di controllo finte transfettate e cellule trattate con CAC1
-siRNA hanno mostrato tassi di crescita significativamente inibito [5]. Cosa c'è di più, real-time RT-PCR e Western Blot analisi hanno confermato che l'espressione di CAC1
è stato efficacemente bloccato da 60nm CAC1
-siRNA. Presi insieme, 60nm stato determinato per essere il dosaggio sperimentale più adatto per RNAi in esami successivi.
Come regola generale, normale proliferazione cellulare dipende dal processo ciclo cellulare ordinato ed efficiente che assicura la duplicazione e trasmissione dell'informazione genetica da una cellula generazione all'altra. In altre parole, deregolazione della proliferazione cellulare si trova sempre in un ciclo cellulare anormale. In CAC1
condizioni -silencing, citometria a flusso nel nostro studio ha rivelato proporzione elevata di cellule nella fase G1 /G0 e un tasso ridotto di cellule in fase S. In sostanza, CAC1
atterramento indotta ciclo cellulare G1 arresto nelle cellule AGS, che era in linea con i risultati della linea di cellule HeLa [5]. CAC1
era anche in grado di legarsi a CDK2
e stimolando l'attività chinasi a /transizione di fase G1 S senza cambiare di molto le espressioni di cyclinA
, ciclina
, cyclinD1
, CDK2
,
RB, PTEN
, e così via [5]. Si suppone che CAC1
depressione attenua l'attività di CDK2 Comprare e interrompe la transizione G1-S.
Apoptosi è uno dei fenomeni biologici base caratterizzato da una serie di trasformazioni in morfologia cellulare [9]. Inoltre, l'apoptosi in concerto con proliferazione cellulare forma un meccanismo di bilanciamento cruciale che gestisce un gran numero di procedure fisiologiche come omeostasi tissutale e sviluppo normale [9]. In circostanze patologiche, l'apoptosi aberrante di solito contribuisce molto l'inizio e la progressione del cancro [10-12] e anche influenzare la sensibilità delle cellule tumorali agli interventi terapeutici [13].
L'attività inequivocabile di CAC1
in ciclo cellulare regolamento sollevato la possibilità che sia, più o meno, coinvolti nel processo di apoptosi. In questo studio, la percentuale di cellule apoptotiche primi /ritardo aumenta con il trattamento con cisplatino, ma è aumentata ancora di più quando CAC1
espressione è stata contemporaneamente inibita da RNAi. Vale a dire, gli indici apoptotici del cisplatino più CAC1
gruppo -siRNA ottenuto un aumento significativo rispetto a quelle dei precedenti tre gruppi con intatta CAC1
. Dati cumulativi implicano che CAC1
può indebolire l'effetto anti-cancro del cisplatino contrastando l'apoptosi indotta da cisplatino.
regolazione dell'apoptosi, tuttavia, si basa su una rete di molecole anti e proapoptotici come BCL2
famiglia [14]. BCL2
(cellule B CLL /linfoma 2) è un proto-oncogene si trova nella regione cromosomica 18q21.3, che codifica per una proteina antiapoptotica 26-kDa contenente quattro BH domini (BH1 ~ BH4)) [15]. Esso può ostacolare il rilascio del citocromo c dai mitocondri, abrogando così l'attivazione delle caspasi e infine inibizione dell'apoptosi [16]. Secondo i primi studi, la sovraespressione di BCL2
spinge le cellule verso la trasformazione maligna [17] e predice la prognosi in molti tumori maligni [18-22]. In particolare nel cancro gastrico, frequente espressione del gene BCL2
sempre si è verificato in tessuti maligni [23-25]. Alti livelli di espressione del gene BCL2
, anche se correlata con meno aggressività del cancro dello stomaco [26], ha avuto molto a che fare con la resistenza ai farmaci delle cellule tumorali [27].
BAX
(BCL2
proteina) del gene X associata si trova nella regione cromosomica 19q13.3-q13.4 umana [28]. La proteina codifica 21-kDa, in particolare, serve come un membro della famiglia proapoptotica BCL2
. BAX
proteina è composta da tre domini BH (BH1, BH2 e BH3) e condivide un sacco di omologia con la BCL2
proteina. Infatti, BAX
proteina agisce come un soppressore di BCL2
per accelerare la morte cellulare per apoptosi, formando BAX
/BCL2
complessi o in competizione con altri obiettivi BCL2
[29]. Sovraespressione del gene BAX
ha avuto un effetto negativo sulla crescita delle cellule di cancro gastrico umano, a causa della induzione di apoptosi e alla valorizzazione di chemiosensibilità delle cellule [30]. Al contrario, la soppressione della BAX
genica tumorigenesi indotta negli epiteli gastrico [23].
Cisplatino è un genere di agente chemioterapico ampiamente utilizzati nei tumori solidi compresi il cancro gastrico. E 'generalmente accettato che il suo effetto citotossico primario è il danno al DNA e conseguente induzione di apoptosi [31], in modo da variazioni di geni apoptosi associata a cisplatino cellule trattate rispecchiano penetrante i meccanismi alla base apoptosi indotta da cisplatino. Per quanto riguarda il nostro studio, CAC1
espressione era sovraregolati da trattamento con cisplatino, ma era marcatamente downregulated dal trattamento siRNA nonostante cisplatino precedente. Inoltre, alla base della crescita di apoptosi indotta da cisplatino che segue CAC1
silenziamento sono concomitanti alterazioni di espressione genica tra cui l'up-regolazione di P53
e BAX
così come la sottoregolazione di BCL2.
Questi effetti indicano che CAC1
rafforza l'apoptosi indotta da cisplatino modulando l'espressione di BCL2
, BAX
e P53
.
Come accennato in precedenza, BCL2
è apparentemente situato alla confluenza di una coppia di percorsi apoptotici, e il rapporto di BCL2
per BAX
proteina sembra essere il fattore determinante se una cellula entra nella fase esecutiva [31]. In realtà, è il BAX
rapporto che regola la sensibilità delle cellule apoptotiche stimoli [32, 33] BCL2
/. Nel processo di apoptosi indotta da cisplatino, CAC1
potrebbe proteggere le cellule AGS da apoptosi alterando BCL2
/BAX
rapporto, per CAC1
silenziamento messo in evidenza un aumento marcato di BAX
e un diminuzione di BCL2
, che era favorevole alla comparsa di apoptosi delle cellule.
interessante notare che il P53
gene nelle cellule AGS è upregulated con il trattamento cisplatino, soprattutto con soppressione sincrona CAC1
. È ben noto che P53
svolge un ruolo importante nella gestione del ciclo cellulare e apoptosi. danno al DNA derivanti da cisplatino può stimolare l'espressione della P53
proteina che si traduce in entrambi espressione della valle della proteina P21
e arresto del ciclo cellulare G1 [34]. Se confrontato con danni al DNA irreparabili, il P53
proteina innesca la morte cellulare programmata [31]. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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