CDK-associeret Cullin 1 kan fremme celleproliferation og inhiberer cisplatin-induceret apoptose i AGS gastrisk cancercellelinie line

CDK-associeret Cullin 1 kan fremme celleproliferation og inhiberer cisplatin-induceret apoptose i AGS gastrisk cancercellelinie
Abstract
Baggrund
mavekræft er en almindelig og meget dødbringende malignitet i verden, men dens patogenese stadig undvigende. I denne undersøgelse har vi fokus på de biologiske funktioner af CDK-associeret Cullin1 (cac1
), en roman gen af ​​cullin familie i mavekræft, som kan hjælpe os til yderligere at forstå oprindelsen af ​​denne malignitet.
Metoder
den AGS og MGC803 mavekræft cellelinjer og den GES-1 maveslimhinden cellelinje blev udvalgt til undersøgelsen. I første omgang blev cac1
udtryk for disse cellelinier undersøgt ved kvantitativ realtids revers transkription polymerasekædereaktion (QRT-PCR) og Western blot undersøgelser, så cac1
lille interfererende RNA (cac1
-siRNA) blev konstrueret og transficeret ind i AGS-cellelinien med et relativt højt niveau af cac1
. Når cac1
blev stille i en række biologiske egenskaber AGS celler, såsom celleproliferation, cellecyklus, apoptose, og udtryk for apoptose-relaterede gener (P53
, BCL2
og BAX
) var bestemt ved MTT, flowcytometri, QRT-PCR og Western blot, henholdsvis.
Resultater Salg cac1
ekspression af AGS eller MGC803 var meget højere end den for GES-1. Efter cac1
udtryk blev reelt deprimeret af RNA-interferens i AGS celler, markant celievækstinhiberingen indtraf. Endvidere er andelen af ​​celler behandlet med cac1
-siRNA steg i G1-fasen og faldt i S-fasen, der indikerer G1 cellecyklusstop. Endnu vigtigere, sammenlignede andelen af ​​tidlig /sen apoptose i AGS celler forbedret med cis-diamindichlorplatin (cisplatin, CDDP) behandling, men i højere grad med cisplatin plus cac1
-siRNA. Interessant, Bcl2
mRNA kopier viste et fald i cisplatin-gruppen 30%, men faldt med omkring 60% i cisplatin plus cac1
-siRNA gruppe. Omvendt opnået p53
mRNA udtryk næsten en fordobling i cisplatin gruppen, i tillæg til en femdobling i cisplatin plus cac1
-siRNA gruppe, og BAX
mRNA-niveauer havde næsten en to-og fire-fold forøgelse hhv. I mellemtiden, P53
, BAX
og BCL2
viste de samme ombygning mønstre i Western blot undersøgelser.
Konklusioner
cac1
kan fremme celle proliferation i AGS mavekræft cellelinje. Desuden kan det forhindre AGS celler fra at opleve cisplatin-induceret apoptose via modulerende udtryk for P53
, BCL2
og BAX
.
Nøgleord
mavekræft CDK-associerede Cullin1 spredning Cell cyklus Apoptose Baggrund
mavekræft er en af ​​de mest almindelige maligne tumorer og den næststørste årsag til kræft dødsfald i verden, der er ansvarlig for i alt 989,600 nye tilfælde og 738.000 dødsfald årligt [1]. Over de seneste år har der været et støt fald i forekomsten og dødeligheden risiko for mavekræft i de fleste lande [2], på grund af de enorme udvikling i diagnose og behandlingsmetoder. Men mavekræft fortsat en stor trussel for mennesker, især dem i udviklingslandene [1], og overlevelsen af ​​alle ramte patienter, selv efter helbredende kirurgisk resektion og adjuverende behandling, er mindre end 40% [3].
Epidemiologisk undersøgelser har afdækket mange risikofaktorer for mavekræft, og molekylærbiologisk forskning indikerer endvidere, at gastrisk carcinogenese omfatter mange genetiske og epigenetiske begivenheder, der involverer en klynge af onkogener, tumorsuppressorgener, celle cyklus regulatorer, celleadhæsionsmolekyler og DNA reparation gener [4] . Imidlertid er de præcise mekanismer, der ligger gastrisk cancer ikke veldefineret.
CDK-associeret Cullin1 er et hidtil ukendt gen identificeret i colorektal carcinom. Den omfatter en åben læseramme-sekvens, som koder for et 37 kDa protein med 369 aminosyrer [5]. Den cac1
protein indeholder en cullin domæne mellem aminosyrerne 137 og 250, og er derfor klassificeret som et medlem af cullin familie af E3 ubiquitin ligaser [5]. Histologiske undersøgelser havde etableret en mulig sammenslutning af cac1
udtryk med patologiske funktioner og kliniske faser af kolorektale karcinom patienter [5]. Desuden cac1
, in vitro
, blev udtrykt i en cellecyklus-afhængig måde med høj ekspression i den sene G1 til S-fasen [5]. Især kunne cac1
fremme cellecyklusprogression og stimulere kinase aktivitet af CDK2
[5]. Ikke desto mindre er kendt lidt om sit udtryk og biologiske egenskaber i mavekræft.
Den foreliggende undersøgelse blev udført for at undersøge ekspressionen af ​​cac1
og til at udforske den funktion, cac1
udfører i gastrisk karcinom cellelinjer. AGS cellelinien blev valgt som model for undersøgelsen, fordi det udtrykte relativt højt niveau af cac1
, derefter cac1
ekspression blev bragt til tavshed af RNA-interferens (RNAi), og en række biologiske parametre relevant for celleproliferation, celle- cyklus og apoptose blev undersøgt, tilsvarende.
Metoder
Cell kultur
Humane gastriske kræft cellelinier (AGS og MGC803) og maveslimhinden cellelinje (GES-1) blev leveret af Central Laboratory of Medical College, Xi 'en Jiaotong University, Kina. Celler blev dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% serum fra nyfødte kalve (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 kU /L penicillin, 0,1 g /l streptomycin, 0,3 g /L L-glutamin og 0,85 g /l NaHCO 3 ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO 2.
siRNA transfektion
cac1
-siRNA (sense- GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT 3 ', antisense-5 ' UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG3 '), cac1
negativ kontrol siRNA (NC-siRNA, sans-5 'UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT 3 ', antisense-5 'ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3 '), blev kemisk syntetiseret af Shanghai GenePharma Corporation (SGC, Shanghai, Kina). Alle siRNA'er blev blandet i lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Californien, USA) og transficeret ifølge siRNA transfektionsprotokol. Effektiviteten af ​​cac1
knockdown blev evalueret med QRT-PCR og Western blot test.
MTT assay
MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazoliumbromid thiazolyl blå indikatorfarvestof) kemosensitivitet assay blev anvendt til at bestemme proliferationshastigheden af ​​AGS gastriske celler. Celler blev podet ved en koncentration på 5 × 10 3 celler per brønd i 96-brønds plader. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt. Celler blev inkuberet i 24 timer og blev inddelt i fem grupper med fem forskellige behandlinger (null, NC-siRNA (60 nmol /L (nM)), siRNA (30 nM), siRNA (60nm), siRNA (90 nM)) i 0, 24, 48, 72 og 96 timer, tilsvarende. Tyve mikroliter af 5 mg /ml MTT (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA) i phosphatbufret saltvand (PBS) blev tilsat per brønd, og cellerne blev efterladt inde i inkubatoren i yderligere 4 timer ved 37 ° C, efterfulgt af tilsætningen af ​​150 pi DMSO. Absorbansen af ​​den farvede opløsning blev målt ved et fuldautomatisk multi-afsløring mikropladelæser (POLARstar OPTIMA, BMG Labtechnologies, Offenburg, Tyskland) ved 490 nm.
Flowcytometrisk analyse
celler (1 x 10 5 celler /brønd) blev høstet i 6-brønds plader i 24 timer, og blev behandlet med forskellige midler (null, NC-siRNA, siRNA (60nm)) i 48 timer. Derefter blev de opsamlet skal vaskes med 0,01 mol /l kold (4 ° C) PBS ved centrifugering ved 800 opm, 4 ° C i 8 minutter, og derefter fikseret i 4 ° C, 75% ethanol i en nat. Fikserede celler blev centrifugeret (som ovenfor) og vasket igen med PBS. Derefter blev cellerne behandlet med 100 pi DNase-fri, RNaseA (10 mg /ml) og inkuberet ved 37 ° C i 10 minutter. Endelig blev cellerne farvet med 100 pi 100 pg /ml propidiumiodid (lysfølsomme) og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Celler fra hver prøve blev placeret i Falcon-rør og læse på en FAC sorter (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Cellecyklus profiler blev fortolket med B-D FAC Sorter Cell Quest software.
Apoptose analyse
Cells (1 × 10 5 celler /brønd) blev inkuberet i 6-brønds plader. Efter 24 timer blev de behandlet med forskellige midler (null, cisplatin (10 uM), cisplatin (10 uM) + NC-siRNA (60nm), cisplatin (10 uM) + siRNA (60nm)) i serum-frit medium i 24 timer, blev derefter opsamlet celler farvet med Annexin V /PI hjælp Vybrant apoptose assaykit No. 2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) og analyseret ved flowcytometri.
Kvantitativ realtids-revers transkription-PCR
Expression af cac1 i gastriske cancercellelinier Salg Totalt RNA blev isoleret fra forskellige cellelinjer (AGS, MGC803 og GES-1) under anvendelse af syren guanidinium-phenol-chloroform fremgangsmåden (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, USA), og cDNA'er blev syntetiseret ved hjælp af PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). Primer sekvenser anvendt til forstærkning er designet af Takara (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) og med følgende betegnelser: fremad primer 5'-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; reverse primer 5'-CAT TTA CAG FTT AAT GCC TTT ACT-3 '. β-actin
fremad primer 5'TGG CAC CCA GCA CAA TGA A -3 « reverse primer 5'CTA AGT CAT AGT CCG FTT AGA AGC A -3 ". Primere blev anvendt i almindelige PCR-reaktioner med cDNA fra celler således at evaluere deres udformning og syntese. Efterfølgende blev PCR-produkterne sekventeret og deres lighed med de ønskede nukleotidsekvenser bekræftet. Den relative mængde af mRNA blev bestemt under anvendelse af SYBR GREEN PCR Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, Californien, USA) med genspecifikke primere til cac1
eller β-Actin
. Alle trin blev udført ifølge producentens protokol. Real-time PCR reaktioner blev udført på en ABI 7500 termisk cycler (Applied Biosystems, Foster City, Californien, USA) med BioRad iQ5 og MyiQTM Real-time PCR Detection System (BioRad Laboratories, Hercules, Californien, USA). Tre uafhængige PCR blev udført fra hver RT prøve. Ekspressionen af ​​cac1
mRNA i hver prøve blev normaliseret mod β-actin
ekspressionsniveauet blev beregnet under anvendelse af ΔΔCT (delta delta tærskelcyklus) metode.
Ekspression af apoptose-relaterede gener i AGS-cellelinje
RNA-isolering og cDNA-syntese blev udført som angivet. En serie af primere blev designet og syntetiseret af Takara herunder P53
(frem-5 '- CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3 ', reverse-5 '- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 '), BCL2
(fremad-5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 ', reverse-5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), BAX
(fremad-5 ' - GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 '; reverse-5 ' - AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ") og β-actin Hotel (fremadrettet 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 '; reverse 5 ' - CTA AGT CAT AGT CCG FTT AGA AGC A -3 ") gener. Som angivet ovenfor realtids-PCR blev udført tre gange. PCR-produkterne blev påvist ved måling af emitterende fluorescens ved afslutningen af ​​hver reaktionscyklus. Tærskelcyklen svarer til antallet af cyklusser, der kræves til at detektere et fluorescenssignal over grundlinjen. Den β-Actin
genet tjente som intern kontrol af reaktionen.
MRNA ekspressionsniveauer blev beregnet under anvendelse af 2 -ΔΔCT metode og udtrykt i relative kvantificering enheder. I detaljer blev tærskel cyklusser af husholdning gen β-actin-
og målgener BCL2
, BAX
og P53
bestemt i hver prøve og for hver periode. Ct-værdier blev normaliseret (ACt) ved at subtrahere ekspressionsniveauerne af referencen gen β-Actin
fra de tilsvarende ekspressionsniveauer af BCL2
, BAX
og P53
i hver prøve. Den normaliserede genekspression i de behandlede AGS-celler blev analyseret i forhold til deres matchende ubehandlede celler, der fungerede som kalibrator prøver (ΔΔCT). Salg Western blot undersøgelser
Halvtreds mikrogram totalt protein fra AGS cellelinje blev separeret på en 10% Trisglycine SDS polyacrylamidgel og overført til en nitrocellulosemembran (BioRad, Hercules, Californien, USA). Blottet blev probet med monoklonale muse-antistoffer, herunder anti-cac1
(GeneTex, Irvine, Californien, USA, 1: 1500), anti-β-Actin
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 5000), anti-P53
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), anti-BCL2
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), og anti-BAX
(Santa Cruz, Californien , USA; 1: 2000). Antistofbinding blev påvist under anvendelse af Gel Blot-Imaging Systems (Syngene G: BOX, Cambridge, UK). Ifølge fabrikantens protokol
Statistiske analyser
Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS 13.0 software (http: //www -01. ibm. com /software /analytics /SPSS /). Hver analyse blev udført mindst tre gange. Dataene blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse, og En-vejs ANOVA-test (to-sidet) blev udført for at bestemme betydningen af ​​forskelle i multiple sammenligninger. Resultaterne blev anset for at være statistisk signifikant ved P
<. 0,05
Resultater
Differential udtryk for cac1
i gastrisk cancer og slimhinder cellelinjer
cac1
mRNA ekspression blev evalueret med real-time RT-PCR i tre cellelinier. Naturligvis blev cac1
udtrykt i hver af de undersøgte cellelinier (figur 1A). Dog viste AGS og MGC803 cellelinjer højere niveauer af cac1
mRNA end GES-1 cellelinje (1,0000 ± 0,0000 og 0,9507 ± 0,0176 versus
0,4340 ± 0,0414, P
< 0,05). Desuden cac1
proteinekspression i Western blot undersøgelser viste den samme skiftende tendens som cac1
mRNA (figur 1A). Figur 1 cac1 ekspression i humane gastriske cancer og mucosale cellelinier. (A) Real-time revers transkription (RT) -PCR og western blot analyse af cac1
udtryk i AGS, MGC803 og GES-1 cellelinjer (* repræsenterer P
< 0,05 mellem GES-1-cellelinje og andre cellelinjer). (B) cac1
udtryk blev reelt deprimeret af 60nm cac1
-siRNA i AGS celle linje på mRNA og protein niveau (* repræsenterer P
< 0,05 mellem kontrolgruppen og cac1
-siRNA gruppe).
Endogen udtryk for cac1
blev stille af RNAi teknik
Forbigående transfektion af AGS celler med cac1
-siRNA oligoer (60nm) designet mod cac1
sekvens effektivt hæmmede udtryk for cac1
. Cac1
mRNA ekspression blev undersøgt ved real-time RT-PCR. Som forventet blev mRNA niveau af cac1
faldet betydeligt i cac1
-siRNA gruppe (1,0000 ± 0,0000 versus
0,3583 ± 0,0244, P
< 0,05), men viste ingen signifikant forskel mellem kontrol- og NC-siRNA grupper (1,0000 ± 0,0000 versus
0,9597 ± 0,0407, P
> 0,05) (Figur 1B). I mellemtiden blev cac1 proteinekspression også deprimeret efter siRNA behandling i Western blot undersøgelser (figur 1B).
Cac1
nedregulering inhiberer celleproliferation i AGS cellelinje
For at undersøge den rolle cac1
spiller i reguleringen af ​​celleproliferation, blev AGS celler ved transient transfektion behandles med cac1
-siRNA af tre forskellige doser (30 nM, 60nm og 90nm) udsat for MTT-analysen. Inden for fire dage, cac1
lyddæmpning udstillet en tydelig hæmmende virkning på celleproliferation efter forskellige doser af cac1
-siRNA (figur 2). Optiske tætheder (ODS) i kontrolgruppen, NC-siRNA-gruppen og 30 nM cac1
-siRNA gruppen viste ingen signifikant forskel med hinanden (P
> 0,05), men var højere end for 60nm og 90 nM cac1
-siRNA grupper (P
< 0,05). Interessant, celler behandlet med 60nm og 90 nM cac1
-siRNA viste næsten identiske OD fra begyndelsen til enden (P
> 0,05). Figur 2 Cellevækst blev inhiberet følgende cac1 silencing. AGS celler blev forbigående transficeret med null, NC-siRNA og tre koncentrationer af cac1
-siRNA for fire dage hhv. Vækstrater af celler blev bestemt ved MTT-assays.
Cell cyklus analyse
Sammenlignet med den kontrol, er andelen af ​​celler behandlet med cac1
-siRNA steg med 28%, eller i G1 /G0 fase (45,33 % ± 0,82% mod
73,23% ± 3,04%, P
< 0,05), og faldt med ca. 36% i S-fasen (41,07% ± 1,07% mod
5,40% ± 5,83%, P
< 0,05), uden nogen væsentlige ændringer i G2 /M-fasen (13.61% ± 0,46% versus
21,37% ± 2,88%, P
> 0,05) (figur 3). Disse resultater indikerer, at cac1
kan fremme cellecyklusprogression af AGS-celler gennem G1 /S overgang. Figur 3 Knockdown af CAC1- induceret G1 cellecyklusstop i AGS cellelinje. Cellecyklusanalyse af AGS celler behandlet med eller uden cac1
-specifik siRNA ved flowcytometri. Andel af celler blev markant forhøjet i G1 fasen mens reduceret i S-fasen, når de behandles med cac1
-siRNA (* repræsenterer P
< 0,05 mellem kontrolgruppen og cac1
-siRNA gruppe).
Knockdown af cac1
øger cisplatin-induceret apoptose
den AGS celler blev inddelt i fire forsøgsgrupper: kontrolgruppen cisplatin-behandlede (10 uM) gruppe, den cisplatin plus NCsiRNA gruppe, og cisplatin plus cac1
-siRNA (60nm) gruppe. Sammenlignet med kontrolgruppen, blev andelene af tidlig /sen apoptose forbedret med cisplatin behandling, men i højere grad med cisplatin plus cac1
-siRNA (2,01% ± 0,78% versus
8,87% ± 3,65% versus
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25% versus
3,89% ± 0,15% versus
10.01% ± 0,09%, P
< 0,05) (Figur 4A og 4B), hvilket betød, at den knockdown af cac1
dramatisk accelereret cisplatin-induceret apoptose. Figur 4 cac1 silencing forøget cisplatin-induceret apoptose i AGS cellelinie. (A) Virkningerne af cisplatin alene og i kombination med NC-siRNA /cac1
-siRNA på tidlig og sen apoptose af AGS celler (* repræsenterer P
< 0,05 mellem kontrolgruppen og behandlede grupper; #represents P
< 0,05 mellem cisplatin (CDDP) gruppe og andre behandlede grupper). (B) Apoptosis mønstre af AGS-celler blev analyseret ved flowcytometri.
Expression profiler af apoptose-relaterede gener
mRNA niveauer af cac1
, BCL2
, BAX
og P53
blev undersøgt ved QRT-PCR. Inkubation af AGS celler med 10 pM cisplatin og /eller 60nm cac1
-siRNA i 24 timer producerede interessante mRNA profiler (figur 5A). Under cisplatin behandling, cac1
mRNA-ekspression stærkt forøget, men faldt til et lavt niveau, når cac1
-siRNA blev tilføjet samtidig (1,0000 ± 0,0000 versus
2,1578 ± 0,2222 versus
0,3967 ± 0,0078, P
< 0,05). Sammenlignet med kontrolgruppen viste Bcl2
mRNA kopierer et fald i cisplatin-gruppen 30%, men faldt med omkring 60% i cisplatin plus cac1
-siRNA gruppe (1,0000 ± 0,0000 versus
0,7090 ± 0,0210 versus
0,4030 ± 0,0171, P
< 0,05). Omvendt blev P53
og BAX
transcript niveauer af behandlede grupper langt forbedret. Sammenlignet med kontrolgruppen, den P53
ekspression opnået næsten en fordobling i cisplatin alene gruppen, ud over en fem gange stigning i cisplatin plus cac1
-siRNA gruppe (1,0000 ± 0,0000 versus
3,0187 ± 0,1738 versus
5,9957 ± 0,3926, P
< 0,05); Bax
mRNA niveauer havde næsten en to-og fire-fold forøgelse (1,0000 ± 0,0000 versus
3,0237 ± 0,2581 versus
4,9897 ± 0,2923, P
< 0,05), hhv. Figur 5 Expression profiler af apoptose-relaterede gener i respons til cisplatin alene eller med cac1 -siRNA behandlinger. (A) Real-time revers transkription (RT) -PCR analyse af cac1
, P53
, BAX
BCL2
mRNA ekspression i AGS celler (* repræsenterer P
< 0,05 mellem cac1
-siRNA gruppe og behandlede grupper; #represents P
< 0,05 mellem cisplatin (CDDP) gruppe og andre behandlede grupper). (B) Western blotting analyse af cac1
, P53
, BCL2
og BAX
udtryk i AGS celler.
Derefter Western blot blev udført for at detektere protein niveauer af disse gener efter cac1
knockdown. Sideløbende med de førnævnte mRNA ændringer blev BAX
og P53
markant opreguleret mens BCL2
blev nedreguleret på proteinniveau (figur 5B).
Diskussion
ubiquitin-proteasom system spiller en central rolle i at opretholde balancen mellem normal vækst og ukontrolleret proliferation ved at styre overflod af en lang række cellulære proteiner [6]. Cullin'et familie af ubiquitin ligaser, traditionelt sammensat af CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5 fotos og 7
, repræsenterer den største klasse af RING-typen E3 ligaser (CRL) [6]. Uden iboende katalytisk aktivitet, cullins tjene som scaffolds, der letter samlingen af ​​multimere E3 ligase komplekser og overføre ubiquitin fra E2-konjugerende enzym til substratet. Cullin-medieret substrat nedbrydning dikterer en lang række cellulære processer, såsom proliferation, differentiering og apoptose. Når cellen reguleringsmekanismer af cullin støder fejl eller forstyrrelser, vil ophobning af oncoproteiner eller overdreven forringelse af tumorsuppressorer uundgåeligt opstår, som kan provokere celler i malign transformation og tumorigenese [6]. Især cullin1
, det mest karakteriserede medlem af cullin familie, viste sig at være tæt forbundet med gastrisk carcinogenese, og dets overekspression forudser dårlig prognose for patienter med gastrisk karcinom [6, 7].
Udtrykket profiler af cancerrelaterede gener delvis afspejler deres biologiske funktioner i patogenesen af ​​cancer. Bliver en hidtil ukendt medlem af cullin familien, har cac1
ekspressionsmønstre blevet grundigt undersøgt i et tidligere studie [5]. Anvendelse af cDNA bibliotek analyse blev cac1
ekspression fundet i normal mave, tyndtarm, colon, lever, lunge, nyre, muskler, hjerte, brystkirtel, uterus, hjernen, milten, lymfeknude, med høje niveauer i colon og brystkirtel [5]. Western blot test derudover opdaget cac1
protein i en vært af normale og cancercellelinier [5]. Med hensyn til vores undersøgelse, den årlige vækstundersøgelse og MGC803 mavekræft cellelinjer havde højere cac1
udtryk end GES-1 maveslimhinden cellelinje, der tyder på, at cac1
kan spille en aktiv rolle i gastrisk carcinogenese.
Gene silencing ved RNA-interferens er en kraftfuld metode til at analysere genfunktion [8]. Her har vi med succes transficeret NCsiRNA og tre koncentrationer af cac1
-siRNA i AGS celler. MTT-analyser viste, at spredning potentiale AGS celler kraftigt blev hæmmet af 60nm og 90 nM cac1
-siRNA i samme grad, men undlod at være påvirket af 30 nM cac1
-siRNA eller NC-siRNA. Det var tydeligt, at cac1
positivt kan påvirke celledeling i gastrisk kræft, hvilket var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af HeLa-cellelinje [5]. I MTT undersøgelser, HeLa-celler, der udtrykker Flag-cac1
undergik højere proliferation evne end de mock transficerede kontrolceller, og celler behandlet med cac1
-siRNA viste signifikant inhiberet vækst [5]. Hvad mere er, real-time RT-PCR og western blot analyser bekræftet, at ekspressionen af ​​cac1
virkningsfuldt blev blokeret af 60nm cac1
-siRNA. Tilsammen blev 60nm bestemt til at være den mest egnede eksperimentelle dosering for RNAi i efterfølgende undersøgelser.
Som hovedregel normal celleproliferation afhænger velordnet og effektiv cellecyklus proces, der sikrer overlapning og transmission af genetisk information fra en celle generation til den næste. Med andre ord, deregulering af celleproliferation altid ligger i en unormal cellecyklus. Under cac1
-silencing betingelser, flowcytometri i vores undersøgelse viste forhøjede andel af celler i G1 /G0 fase og en reduceret sats af celler i S-fasen. I det væsentlige, cac1
knockdown induceret G1 cellecyklusstop i AGS-celler, som var i overensstemmelse med resultaterne fra HeLa-cellelinien [5]. Cac1
var også i stand til at binde til CDK2
og stimulere dets kinase aktivitet ved G1 /S faseovergang uden stærkt at ændre udtryk for cyclinA
, cyclin
, cyclinD1
, CDK2
, RB
, PTEN
, og så videre [5]. Det er meningen, at cac1
depression dæmper aktiviteten af ​​CDK2
afbryder G1-S overgang.
Apoptose er en af ​​de grundlæggende biologiske fænomener karakteriseret ved en række transformationer i cellemorfologi [9]. Endvidere apoptose i forening med celleproliferation udgør en afgørende udligningsmekanisme, der styrer et stort antal fysiologiske procedurer såsom vævshomeostase og normal udvikling [9]. Under patologiske omstændigheder, afvigende apoptose normalt bidrager meget til initiering og progression af kræft [10-12], og endda påvirke følsomheden af ​​kræftceller til terapeutiske indgreb [13].
Utvetydige aktivitet cac1
i cellecyklus regulering rejst den mulighed, at det er mere eller mindre, er involveret i processen med apoptose. I den aktuelle undersøgelse, at andelen af ​​tidlige /sene apoptotiske celler steget med cisplatin behandling, men steget endnu mere, så når cac1
udtryk blev samtidig hæmmet af RNAi. Det vil sige, apoptotiske indekser i den cisplatin plus cac1
-siRNA gruppe opnået en signifikant stigning i forhold til dem af de tidligere tre grupper med intakt cac1
. Kumulative data indebærer, at cac1
kan svække anti-cancer effekt af cisplatin ved at modvirke cisplatin-induceret apoptose.
Forordning af apoptose, dog afhængig af et netværk af anti- og proapoptotiske molekyler såsom BCL2
familie [14]. BCL2
(B-celle CLL /lymfom 2) er et proto-onkogen beliggende i det kromosomale region 18q21.3, som koder for en antiapoptotisk 26-kDa protein, som indeholder fire BH-domæner (BH1 ~ BH4)) [15]. Det kan hindre frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier, således ophævelse af aktivering af caspaser og endelig inhibere apoptose [16]. Ifølge tidlige undersøgelser, overekspression af BCL2
driver celler mod malign transformation [17] og forudsiger prognosen hos mange maligniteter [18-22]. Især i gastrisk cancer, hyppig ekspression af BCL2
gen altid forekom i maligne væv [23-25]. Høje ekspressionsniveauer af BCL2
genet, selvom korreleret med mindre aggression af mavekræft [26], havde meget at gøre med resistens af kræftcellerne [27].
BAX Hotel (BCL2
associeret X protein) genet er lokaliseret i det humane kromosomale region 19q13.3-q13.4 [28]. Dens 21-kDa indkoder protein, især fungerer som et pro-apoptotisk medlem af BCL2
familien. BAX
protein består af tre BH domæner (BH1, BH2-, og BH3) og deler en masse af homologi med BCL2
protein. Faktisk til BAX
protein virker som en suppressor af BCL2
accelerere apoptotisk celledød, ved at danne BAX
/BCL2
komplekser eller ved at konkurrere med andre BCL2
mål [29]. Overekspression af BAX
gen havde en negativ effekt på cellevækst i human gastrisk cancer på grund af induktion af apoptose og til forbedringen af ​​cellens kemosensitivitet [30]. Tværtimod undertrykkelse af BAX
genekspression tumordannelse hos gastrisk epitel [23].
Cisplatin er en slags kemoterapeutisk middel vid udstrækning anvendes i faste maligniteter inklusive gastrisk cancer. Det er almindeligt accepteret, at dets primære cytotoksiske effekt er DNA-skade og efterfølgende induktion af apoptose [31], så varianserne for apoptose-associerede gener i cisplatin behandlede celler indtrængende spejl mekanismerne bag cisplatin-induceret apoptose. Som for vores undersøgelse blev cac1
udtryk opreguleret af cisplatin behandling, men blev markant nedreguleret af siRNA behandling trods tidligere cisplatin. Endvidere ligger til grund for stigningen af ​​cisplatin-induceret apoptose, der følger cac1
lyddæmpning er samtidige genekspression ændringer herunder opregulering af P53
og BAX
samt nedregulering af BCL2.
Disse virkninger tyder på, at cac1
styrker cisplatin-induceret apoptose ved at modulere ekspressionen af ​​BCL2
, BAX
og P53
.
som tidligere nævnt, BCL2
er tilsyneladende placeret på konvergensen af ​​et par apoptotiske veje, og forholdet mellem BCL2
til BAX
protein synes at være den endelige faktor for, om en celle kommer ind i udførelsen fase [31]. Faktisk er det den BCL2
/BAX
ratio, der regulerer følsomheden af ​​cellerne på apoptotiske stimuli [32, 33]. I processen med cisplatin-induceret apoptose, cac1
kan beskytte AGS celler fra apoptose ved at ændre BCL2
/BAX
forholdet, for cac1
lyddæmpning bragt ud en udtalt stigning i BAX
og en fald i BCL2
, som var befordrende for forekomsten af ​​celleapoptose.
Interessant nok blev den P53
genet i AGS celler opreguleres med cisplatin behandling, især med synkron undertrykkelse af cac1
. Det er velkendt, at P53
spiller en vigtig rolle i styringen af ​​cellecyklussen og apoptose. DNA skader som følge af cisplatin kan stimulere ekspression af P53
protein, der medfører både ekspression af nedstrøms P21
protein og G1 cellecyklusstandsning [34]. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Utility af intranasal Ketamin og Midazolam til at udføre gastrisk aspirater hos børn: en dobbeltblind, placebokontrolleret, randomiseret studie
• Sammenslutninger af en PTPN11 G /A polymorfi ved intron 3 med Helicobactor pyloriseropositivity, gastrisk atrofi og mavekræft i japansk