CDK-1 associado Cullin pode promover a proliferação de células e inibir a apoptose induzida por cisplatina no AGS line

célula cancerosa gástrica CDK-1 associado Cullin pode promover a proliferação de células e inibir a apoptose induzida por cisplatina na linha celular de cancro gástrico AGS
Resumo
Fundo
o câncer gástrico é um tumor maligno comum e altamente letal no mundo, mas sua patogênese permanece indefinida. Neste estudo, vamos nos concentrar nas funções biológicas do Cullin1 CDK-associado (CAC1
), um novo gene da família cullin, no câncer gástrico, o que pode nos ajudar a entender melhor a origem desta malignidade.
métodos
a AGS e MGC803 linhas celulares de cancro gástrico e a linha de células de mucosa gástrica GES-1 foram seleccionados para o estudo. Em primeiro lugar, CAC1
expressões dessas linhas de células foram examinadas por quantitativo em tempo real da reacção de transcrição reversa em cadeia da polimerase (qRT-PCR) e exames de Western blot, em seguida, CAC1
pequeno ARN interferente (CAC1
-siRNA) foram desenhados e transfectado para a linha celular de AGS, com um nível relativamente elevado de CAC1
. Uma vez CAC1
foi silenciado, uma série de características biológicas de células AGS como a proliferação celular, ciclo celular, apoptose e expressão de genes relacionados com a apoptose (P53
, BCL2 Comprar e BAX
) foram determinada por MTT, citometria de fluxo,
qRT-PCR e western blot, respectivamente. Os resultados de expressão
AGS ou MGC803 CAC1
foi muito mais elevada do que a de GES-1. Após CAC1
expressão foi efetivamente pressionado por interferência de RNA em células AGS, inibição do crescimento celular significativa ocorreu. Além disso, a proporção de células tratadas com CAC1
-siRNA aumentada na fase G1 e diminuiu na fase S, indicativo da paragem do ciclo celular G1. Mais importante ainda, as proporções de precoce /tardio da apoptose em células de AGS foram reforçadas com o tratamento com cis-diaminodicloroplatina (cisplatina, CDDP), mas em maior medida com a cisplatina com o CAC1
-siRNA. Curiosamente, BCL2
cópias de mRNA mostrou uma diminuição de 30% no grupo cisplatina, mas caiu em cerca de 60% no grupo cisplatina com CAC1
-siRNA. Por outro lado, o P53
expressões de ARNm obtido um aumento de quase duas-vezes no grupo cisplatina, para além de um aumento de cinco vezes na cisplatina com grupo CAC1
-siRNA, e a BAX
níveis de mRNA teve quase um aumento de duas ou quatro vezes, respectivamente. Enquanto isso, P53
, BAX Comprar e BCL2
mostraram os mesmos padrões de alteração em exames western blot.
Conclusões
CAC1
pode promover a proliferação celular na linha de células de câncer gástrico AGS. Além disso, pode evitar que as células AGS de experimentar a apoptose induzida pela cisplatina por meio de modulação expressões de P53
, BCL2 Comprar e BAX
.
Palavras-chave
O câncer gástrico CDK-associado Cullin1 Proliferação celular ciclo de fundo apoptose
cancro gástrico é um dos tumores malignos mais comuns e a segunda principal causa de morte por cancro em todo o mundo, responsável por um total de 989,600 e 738,000 novos casos de mortes por ano [1]. Nos últimos anos, tem havido um declínio constante na incidência e mortalidade risco de câncer gástrico na maioria dos países [2], devido aos desenvolvimentos tremendos nos métodos de diagnóstico e tratamento. No entanto, o câncer gástrico continua a ser uma grande ameaça para as pessoas, especialmente nos países em desenvolvimento [1], e para a sobrevivência de todos os pacientes afetados, mesmo após a ressecção cirúrgica curativa e terapia adjuvante, é inferior a 40% [3].
Epidemiológica investigações descobriram muitos fatores de risco para o câncer gástrico, e investigação em biologia molecular indica ainda que carcinogênese gástrica compreende numerosos eventos genéticos e epigenéticos, envolvendo um conjunto de oncogenes, genes supressores de tumor, reguladores do ciclo celular, moléculas de adesão celular e genes de reparo de DNA [4] . No entanto, os mecanismos precisos do cancro gástrico subjacente não estão bem definidas.
Cullin1 associada-CDK é um novo gene identificado em carcinoma colorrectal. Ele abrange uma sequência de estrutura de leitura aberta que codifica uma proteína de 37 kDa de 369 aminoácidos [5]. O CAC1
proteína contém um domínio Cullin entre os aminoácidos 137 e 250, e, portanto, é classificada como um membro da família de culina ubiquitina ligases E3 [5]. investigações histológicas tinha estabelecido uma possível associação de CAC1
expressão com características patológicas e estágios clínicos de pacientes colorectal carcinoma [5]. Além disso, CAC1
, in vitro
, foi expressa de uma forma dependente do ciclo celular com expressão elevada no final da fase G1 para a fase S [5]. Notavelmente, CAC1
poderia promover a progressão do ciclo celular e estimular a atividade quinase de CDK2
[5]. No entanto, pouco se sabe sobre a sua expressão e características biológicas no câncer gástrico.
O presente estudo foi realizado para investigar a expressão de CAC1
e explorar a função que CAC1
executa em linhas de células de carcinoma gástrico. A linha celular de AGS foi seleccionado como o modelo para o estudo, pois expressa relativamente elevado nível de CAC1
, em seguida, CAC1
expressão foi silenciado por interferência de ARN (ARNi), e uma série de parâmetros biológicos relevantes para a proliferação celular, célula ciclo e apoptose foram examinados, de forma correspondente.
Métodos
cultura celular
Humanos linhas celulares de cancro gástrico (AGS e MGC803) e linha de células da mucosa gástrica (GES-1) foram fornecidos pelo Laboratório Central do Medical College, Xi 'an Jiaotong University, China. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, EUA) suplementado com 10% de soro de vitelo recém-nascido (Gibco BRL, Grand Island, NY, EUA), 100 kU /L de penicilina, 0,1 g /L de estreptomicina, 0,3 g /l de L-glutamina e 0,85 g /l de NaHCO 3 a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO 2.
siARN transfecção
CAC1
-siRNA (sentido- GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT 3 ', antisense-5 ' UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG3 '), CAC1
controle negativo siRNA (NC-siRNA, o senso-5 'UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT 3 ', antisense-5 'ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3 ') foram sintetizados quimicamente por Shanghai GenePharma Corporation (SGC, Xangai, China). Todos os ARNic foram misturados em Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) e transfectado de acordo com o protocolo de transfecção de siRNA. A eficiência de CAC1
knockdown foi avaliada com ensaios de Western blot de qRT-PCR e. Ensaio MTT
O MTT (brometo de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazólio tiazolilo ensaio de quimio-sensibilidade do corante azul indicador) foi aplicada para determinar a taxa de proliferação de células gástricas AGS. As células foram semeadas a uma concentração de 5 × 10 3 células por poço em placas de 96 poços. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. As células foram incubadas durante 24 horas e foram divididos em cinco grupos com cinco tratamentos diferentes (null, NC-siARN (60 nmol /L (nM)), siARN (30 nM), siARN (60 nM), siARN (90nm)) para 0, 24, 48, 72 e 96 horas, de forma correspondente. Vinte microlitros de 5 mg /ml de MTT (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, EUA) em tampão fosfato salino (PBS) foram adicionados por poço e as células foram deixadas no interior da incubadora por mais 4 h a 37 ° C, seguido pela a adição de 150 ul de DMSO. A absorvância da solução de cor foi medida por um leitor de microplacas de multi-detecção totalmente automatizado (Polarstar Optima, BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemanha) a 490 nm.
Análise citométrica de fluxo
células (1 × 10 5 células /poço) foram semeados em placas de 6 poços por 24 horas, e foram tratados com diferentes agentes (null, NC-siRNA, siARN (60 nM)) durante 48 horas. Em seguida, eles foram recolhidos para serem lavadas com 0,01 mol /L a frio (4 ° C) PBS por centrifugação a 800 rpm, 4 ° C durante 8 minutos, e em seguida fixadas em 4 ° C, 75% de etanol por uma noite. As células fixadas foram centrifugadas (como acima) e novamente lavadas com PBS. Em seguida, as células foram tratadas com 100 ul de, com ARNase A isenta de ADNase (10 mg /ml) e incubou-se a 37 ° C durante 10 minutos. Finalmente, as células foram coradas com 100 ul de 100 ug /mL de iodeto de propídio (sensível à luz) e incubou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. As células de cada amostra foram colocadas em tubos Falcon e lidas num classificador FAC (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA). Os perfis do ciclo celular foram interpretados com software Ordenar celular Procura B-D FAC.
Análise de Apoptose As células
(1 × 10 5 células /poço) foram incubadas em placas de 6 poços. Depois de 24 horas, que foram examinados, com diferentes agentes (null, a cisplatina (10 uM), a cisplatina (10 uM) + NC-siRNA (60 nM), a cisplatina (10 uM) + siRNA (60nm)) em meio isento de soro durante 24 hora, em seguida as células recolhidas foram coradas com Anexina V /PI utilizando o ensaio de apoptose Vybrant kit No. 2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EUA) e analisadas por citometria de fluxo.
quantitativo em tempo real reversa PCR de transcrição
Expressão de CAC1 em linhas celulares de cancro gástrico
o ARN total foi isolado a partir de várias linhas celulares (AGS, e MGC803 GES-1) utilizando o método do ácido de guanidínio-fenol-clorofórmio (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, EUA), e de cDNAs foram sintetizados utilizando o Kit PrimeScriptTM primeira cadeia de cDNA Synthesis (Invitrogen, Carlsbad, EUA). As sequências dos iniciadores utilizados para amplificação foram projetados pela Takara (Takara Bio Inc., Shiga, Japão) e listadas a seguir: a frente 5'-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; iniciador inverso 5'-CAT TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3 '. β-actina
iniciador directo 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A -3 '; iniciador inverso 5'CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A -3 '. Os iniciadores foram utilizados em reacções de PCR normais com cDNA a partir de células de modo a avaliar a sua concepção e síntese adequada. Subsequentemente, os produtos de PCR foram sequenciados e a sua semelhança com as sequências de nucleótidos desejadas confirmada. A quantidade relativa de ARNm foi determinada utilizando o SYBR Green PCR master mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA) com iniciadores específicos para o gene para CAC1
ou β-Actina
. Todas as etapas foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante. As reacções de PCR em tempo real foram efectuadas em um termociclador ABI 7500 (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, EUA) com o IQ5 BioRad e MyiQTM real-time PCR Detection System (BioRad Laboratories, Hercules, Califórnia, EUA). Três ensaios de PCR independentes foram realizados a partir de cada amostra de RT. A expressão de ARNm CAC1
em cada amostra foi normalizado contra β-actina
e o nível de expressão foi calculada utilizando a ΔΔCT (delta ciclo limite delta) método.
Expressão de genes relacionados com apoptose na linha celular AGS
isolamento de ARN e síntese de ADNc foram realizadas conforme observado. Uma série de primers foram desenhados e sintetizados pela Takara incluindo P53
(forward-5 '- CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3 ', 5 reversa '- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 '), BCL2
(forward-5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 ', inverter-5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), BAX
(forward-5 ' - GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 '; inverter-5 ' - AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ') e β-actina
(forward 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 '; reverter 5 '- CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A -3 ') genes. Tal como indicado acima PCR em tempo real foi realizada três vezes. Os produtos de PCR foram detectados através da medição da fluorescência emitindo no final de cada ciclo de reacção. O ciclo limite corresponde ao número de ciclos necessários para detectar um sinal de fluorescência acima do valor basal. O gene β-Actina
serviu como o controlo interno da reacção.
Os níveis de expressão de mRNA foram calculados usando o -ΔΔCT método 2 e expressa em unidades de quantificação relativa. Em detalhe, os ciclos de limiar da β-actina gene housekeeping
e os genes alvo
BCL2, BAX Comprar e P53
foram determinados em cada amostra e para cada período de tempo. , Os valores Ct foram normalizados (ΔCT) subtraindo os níveis do gene de referência
β-actina de expressão a partir dos níveis de expressão correspondentes da BCL2
BAX
e P53
em cada amostra. A expressão do gene nas células normalizada AGS tratados foram analisados ​​em relação aos seus correspondentes células não tratadas, que funcionaram como amostras de calibrador (ΔΔCT).
Exames Western blot
Cinquenta microgramas de proteína total a partir da linha celular de AGS foi separado numa 10% de gel de poliacrilamida SDS Trisglycine e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (BioRad, Hercules, Califórnia, EUA). O blot foi sondado com anticorpos monoclonais de ratinho anti-CAC1 incluindo
(GeneTex, Irvine, Califórnia, EUA, 1: 1500), anti-β-Actina
(Santa Cruz, CA, EUA; 1: 5000), anti-P53
(Santa Cruz, CA, EUA; 1: 2000), anti-BCL2
(Santa Cruz, CA, EUA; 1: 2000), e anti-BAX
(Santa Cruz, CA , EUA; 1: 2000). analisa de acordo com o protocolo do fabricante
Estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS 13.0 (http: ligação do anticorpo foi detectada usando os sistemas de gel mancha de imagem (BOX, Cambridge, Reino Unido Syngene g): //www. -01. ibm. com /software /analytics /SPSS /). Cada ensaio foi realizado pelo menos três vezes. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão, e One-way ANOVA (dois lados) foi realizado para determinar a significância das diferenças em comparações múltiplas. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos a P Art < 0,05.

Resultados da expressão diferencial de CAC1
em linhas de câncer e células da mucosa gástrica
CAC1
expressão de mRNA foi avaliado com em tempo real de RT-PCR em três linhas celulares. Obviamente, CAC1
foi expresso em cada uma das linhas celulares examinadas (Figura 1A). No entanto, as linhas celulares AGS e MGC803 apresentaram maiores níveis de CAC1
mRNA do que a linha de células de GES-1 (1,0000 ± 0,0000 e 0,9507 ± 0,0176 contra
0,4340 ± 0,0414, P Art < 0,05). Além disso, a expressão da proteína CAC1
em exames de Western blot mostrou a mesma tendência de mudança como CAC1
ARNm (Figura 1A). Figura expressão 1 CAC1 em linhas de câncer e células da mucosa gástrica humanos. (A) em tempo real de transcrição reversa (RT) análise de transferência de Western de expressão CAC1
em AGS, e MGC803 GES-1 linhas celulares (-PCR e * representa P
< 0,05 entre a linha de células 1 GES- e outras linhas de células). (B) CAC1
expressão foi efetivamente pressionado por 60 nM CAC1
-siRNA na linha de células AGS sobre o nível de proteína (* representa P Art <mRNA e 0,05 entre o grupo controle eo CAC1
-siRNA grupo).
expressão endógena de CAC1
foi silenciado pela técnica de RNAi
Transient transfecção de células AGS com CAC1
-siRNA oligos (60 nM) projetado contra CAC1
sequência efetivamente inibiu o expressão de CAC1
. CAC1
expressão do mRNA foi examinada por em tempo real de RT-PCR. Como esperado, o nível de mRNA de CAC1
foi consideravelmente diminuída em CAC1
grupo -siRNA (1,0000 ± 0,0000 contra
0,3583 ± 0,0244, P Art < 0,05), mas não mostrou diferença significativa entre o controle e grupos NC-siRNA (1,0000 ± 0,0000 contra
0,9597 ± 0,0407, P Art > 0,05) (Figura 1B). Enquanto isso, a expressão da proteína CAC1 também estava deprimido após o tratamento de siARN em exames de Western blot (Figura 1B).
CAC1
silenciamento inibe a proliferação celular em linhas celulares AGS
A fim de investigar o papel CAC1
desempenha na a regulação da proliferação celular, células AGS abordados por transfecção transiente com CAC1
-siRNA de três dosagens diferentes (30 nM, 60 nM e 90 nm) foram submetidos a ensaio de MTT. Em quatro dias, CAC1
silenciamento exibiu um efeito inibitório sobre a proliferação celular distinta de acordo com diferentes doses de CAC1
-siRNA (Figura 2). As densidades ópticas (DO) do grupo de controlo, o grupo NC-siRNA e a 30nM CAC1
grupo -siRNA não mostrou nenhuma diferença significativa entre si (P
> 0,05), mas eram mais elevados do que os da 60 nM e 90nm CAC1
grupos -siRNA (P Art < 0,05). Curiosamente, as células tratadas com 60 nM e 90nm CAC1
-siRNA mostrou ODs quase idênticos a partir do início ao fim (P Art > 0,05). Figura 2 O crescimento celular foi inibido após o silenciamento CAC1. AGS células foram transfectadas transientemente com nulo, NC-siRNA e três concentrações de CAC1
-siRNA para quatro dias, respectivamente. As taxas de crescimento de células foram determinados por ensaios MTT.
análise do ciclo celular
Em comparação com o controlo, a proporção de células tratadas com CAC1
-siRNA aumentou em 28% ou menos na fase G1 /G0 (45,33 % ± 0,82% versus
73,23% ± 3,04%, P
< 0,05), e diminuiu cerca de 36% na fase S (41,07% ± 1,07% versus
5,40% ± 5,83%, P
< 0,05), sem qualquer alteração significativa na fase G2 /M (13,61% ± 0,46% versus
21,37% ± 2,88%, P
> 0,05) (Figura 3). Estes resultados indicam que CAC1
pode promover a progressão do ciclo celular de células AGS através da transição G1 /S. Figura 3 knockdown de CAC1- G1 induzida paragem do ciclo celular na linha celular de AGS. análise do ciclo celular das células tratadas com AGS ou sem CAC1
siARN espec�ico por citometria de fluxo. Proporção de células foi marcadamente elevada na fase G1 enquanto reduzida na fase S quando tratados com CAC1
-siRNA (* representa P Art < 0,05 entre o grupo controle eo CAC1
grupo -siRNA).
Knockdown de CAC1
intensifica a apoptose induzida pela cisplatina
as células AGS foram divididos em quatro grupos experimentais: o grupo controle, o grupo tratado com cisplatina (10 mM), a cisplatina com o grupo NCsiRNA, ea cisplatina mais CAC1
-siRNA (60 nM) grupo. Comparado com o grupo controle, as proporções de início /final de apoptose foram reforçadas com o tratamento com cisplatina, mas em maior medida com a cisplatina com CAC1
-siRNA (2,01% ± 0,78% versus
8,87% ± 3,65% versus
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25% versus
3,89% ± 0,15% versus
10,01% ± 0,09%, P
< 0,05) (Figura 4A e 4B), o que significava que o knockdown de CAC1
acelerou dramaticamente apoptose induzida por cisplatina. Figura 4 CAC1 silenciamento melhorado apoptose induzida por cisplatina em linhas celulares AGS. (A) Os efeitos da cisplatina isoladamente e em combinação com NC-siRNA /CAC1
-siRNA na apoptose precoce e tardia de células AGS (* representa P Art < 0,05 entre o grupo controle e grupos tratados; #represents P
< 0,05 entre o grupo de cisplatina (CDDP) e outros grupos tratados). padrões (B) a apoptose de células AGS foram analisadas por citometria de fluxo.
perfis de expressão de genes relacionados com a apoptose
Os níveis de mRNA de CAC1
, BCL2
, BAX Comprar e P53
foram examinados por qRT-PCR. A incubação das células com AGS cisplatina 10 uM e /ou 60 nM CAC1
-siRNA durante 24 h produziu perfis de ARNm de interesse (Figura 5A). Sob o tratamento com cisplatina, CAC1
expressão de mRNA aumentou consideravelmente, mas caiu para um nível baixo quando CAC1
-siRNA foi adicionado simultaneamente (1,0000 ± 0,0000 contra
2,1578 ± 0,2222 contra
0,3967 ± 0,0078, P
< 0,05). Comparado com o grupo controle, BCL2
cópias de mRNA mostrou uma diminuição de 30% no grupo cisplatina, mas caiu em cerca de 60% no cisplatina com CAC1
-siRNA grupo (1,0000 ± 0,0000 contra
0,7090 ± 0,0210 contra
0,4030 ± 0,0171, P
< 0,05). Por outro lado, P53 Comprar e BAX
níveis de transcrição dos grupos tratados foram amplamente reforçada. Em comparação com o grupo de controlo, a expressão de p53
obtido um aumento de quase duas-vezes no grupo da cisplatina, para além de um aumento de cinco vezes na cisplatina com grupo CAC1
-siRNA (1,0000 ± 0,0000 contra
3,0187 ± 0,1738 contra
5,9957 ± 0,3926, P Art < 0,05); a BAX
níveis de mRNA tinha quase um de dois e de aumento de quatro vezes (1,0000 ± 0,0000 contra
3,0237 ± 0,2581 contra
4,9897 ± 0,2923, P Art < 0,05), respectivamente. Figura 5 os perfis de expressão de genes relacionados com a apoptose em resposta a cisplatina sozinha ou com tratamentos CAC1 -siRNA. (A) em tempo real transcrição (RT) Análise-PCR de CAC1
, P53
, BAX Comprar e BCL2
expressão de mRNA em células AGS (* representa P Art <reversa; 0,05 entre CAC1
grupo -siRNA e grupos tratados; P #represents
< 0,05 entre o grupo de cisplatina (CDDP) e outros grupos tratados). (B) Análise de transferência de Western de CAC1
, P53
, BCL2
e expressão do Bax
em células AGS.
Então ensaios de Western blot foram realizados para detectar os níveis de proteína dos genes após CAC1
knockdown. Em paralelo com as mudanças de mRNA acima mencionados, BAX Comprar e P53
foram acentuadamente regulada enquanto BCL2
foi regulada negativamente no nível de proteína (Figura 5B).
Discussão
O sistema ubiquitina-proteassoma desempenha um papel fundamental na manutenção do equilíbrio entre o crescimento normal e proliferação descontrolada pelo controle da quantidade de uma grande variedade de proteínas celulares [6]. A família Cullin de ubiquitina ligases, tradicionalmente compostos por CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5 e 7

, representa a maior classe de ligases de anel do tipo E3 (LCRs) [6]. Sem actividade catalítica intrínseca, culinas servir como suportes que facilitam a montagem de complexos multiméricos de ligase E3 e transferem a ubiquitina a partir da enzima E2-conjugar ao substrato. degradação de substrato Cullin mediada dita uma grande variedade de processos celulares tais como a proliferação, a diferenciação e a apoptose. Uma vez que os mecanismos reguladores celulares de avarias Cullin encontro ou de perturbações, a acumulação de oncoproteínas ou degradação excessiva de supressores tumorais, ocorrerá inevitavelmente, o que pode provocar células em transformação maligna e tumorigénese [6]. Em particular, cullin1
, o membro mais bem caracterizado da família cullin, foi provado ser estreitamente associado com a carcinogênese gástrica, e sua sobre-expressão prediz mau prognóstico de pacientes com carcinoma gástrico [6, 7].
Os perfis de expressão de genes relacionados ao câncer em parte reflectir as suas características biológicas na patogênese do câncer. Sendo um novo membro da família cullin, CAC1
padrões de expressão têm sido extensivamente investigada em um estudo anterior [5]. Utilizando ADNc Biblioteca de análise, CAC1
expressão foi encontrado no estômago normal, intestino delgado, cólon, fígado, pulmão, rim, músculo, coração, glândula mamária, útero, cérebro, baço, nódulo linfático, com níveis elevados no cólon e glândula mamaria [5]. testes de Western blot, adicionalmente detectado CAC1
proteína em uma série de linhas normais e cancerosas de células [5]. No que diz respeito ao nosso estudo, os AGS e MGC803 linhas celulares de cancro gástrico teve maior expressão CAC1
do que a linha de células da mucosa gástrica GES-1, que indicam que CAC1
pode desempenhar um papel activo na carcinogênese gástrica.
gene silenciamento por interferência de ARN é um método poderoso para analisar a função do gene [8]. Aqui, nós transfectadas com sucesso NCsiRNA e três concentrações de CAC1
-siRNA em células AGS. A análise de MTT mostrou que o potencial de proliferação de células AGS foi potentemente inibida por 60 nM e 90nm CAC1
-siRNA com a mesma intensidade, mas não ser influenciada por 30 nM CAC1
-siRNA ou NC-siRNA. Foi aparente que CAC1
poderia afectar positivamente a proliferação celular no cancro gástrico, o que estava de acordo com estudos anteriores sobre a linha de células HeLa [5]. Em exames de MTT, as células HeLa que expressam Bandeira-CAC1
sofreu maior capacidade de proliferação do que as células de controlo simuladas transfectadas e células tratadas com CAC1
-siRNA mostrou taxa de crescimento significativamente inibido [5]. Além do mais, em tempo real RT-PCR e análises de Western blot confirmou que a expressão de CAC1
foi eficazmente bloqueada por 60 nM CAC1
-siRNA. Tomados em conjunto, 60 nM foi determinada como sendo a dose experimental mais adequado para RNAi em exames posteriores.
Como regra geral, a proliferação de células normais depende de processo de ciclo de célula ordenada e eficiente, que assegura a duplicação e a transmissão de informação genética a partir de uma célula geração para a seguinte. Em outras palavras, a desregulação da proliferação celular encontra-se sempre em um ciclo celular anormal. Sob condições CAC1
-silencing, citometria de fluxo no nosso estudo revelou elevada proporção de células na fase G1 /G0 e uma taxa reduzida de células na fase S. Em essência, CAC1
knockdown induzida paragem do ciclo celular G1 nas células AGS, o que era consistente com os resultados a partir da linha de células HeLa [5]. CAC1
também era capaz de se ligar a CDK2
e estimular a sua actividade quinase na transição de fase G1 /S, sem alterar muito as expressões de cyclinA
, ciclina
, cyclinD1
, CDK2
, RB
, PTEN
, e assim por diante [5]. Supõe-se que a depressão CAC1
atenua a actividade de CDK2
e interrompe a transição G1-S.
A apoptose é um dos fenómenos biológicos de base caracteriza-se por uma série de transformações na morfologia celular [9]. Além disso, a apoptose em conjunto com a proliferação de células constitui um mecanismo de equilíbrio crucial que gere um grande número de processos fisiológicos, tais como a homeostase do tecido e desenvolvimento normais [9]. Em circunstâncias patológicas, a apoptose aberrante geralmente contribui muito para o início e progressão do câncer [10-12] e até mesmo influenciar a sensibilidade das células cancerosas para intervenções terapêuticas [13].
A atividade inequívoca de CAC1
no ciclo celular regulação levantou a possibilidade que é, mais ou menos, envolvido no processo de apoptose. No estudo actual, a percentagem de células apoptóticas inicial /tardio aumentaram com o tratamento com cisplatina, mas aumentou ainda mais quando CAC1
expressão foi simultaneamente inibida por RNAi. Ou seja, os índices apoptóticos da cisplatina com CAC1
grupo -siRNA obteve um aumento significativo em comparação com os dos antigos três grupos com CAC1 intacta
. dados cumulativos implica que CAC1
pode enfraquecer o efeito anti-câncer de cisplatina por contrariar a apoptose induzida pela cisplatina.
regulamento da apoptose, no entanto, depende de uma rede de moléculas anti e pró-apoptóticos tais como BCL2
família [14]. BCL2
(células B CLL /linfoma 2) é um proto-oncogene localizado na região cromossómica 18q21.3, que codifica para uma proteína anti-apoptótica de 26 kDa que contém quatro domínios BH (BH1 ~ BH4)) [15]. Pode impedir a libertação de citocromo c das mitocôndrias, revoga, assim, a activação de caspases e, finalmente, inibir a apoptose [16]. De acordo com estudos recentes, a sobre-expressão de BCL2
dirige células para a transformação maligna [17] e prediz o prognóstico em muitas malignidades [18-22]. Particularmente no câncer gástrico, expressão frequente de gene BCL2
sempre ocorreu em tecidos malignos [23-25]. elevados níveis de expressão do gene BCL2
, embora correlacionados com menos agressividade de câncer de estômago [26], teve muito a ver com a resistência aos medicamentos das células cancerosas [27].
BAX
(BCL2
X gene da proteína associada) está localizado na região cromossómica 19q13.3-q13.4 humana [28]. A sua proteína de codificação 21 kDa, em particular, serve como um membro do pró-apoptótica da família BCL2
. BAX
proteína consiste em três domínios BH (BH1, BH2 e BH3) e compartilha um monte de homologia com a BCL2
proteína. Com efeito, BAX
proteína actua como um supressor de BCL2
para acelerar a morte celular por apoptose, através da formação de BAX
/BCL2
complexos ou por competição com outros alvos BCL2
[29]. A sobre-expressão do gene da BAX
teve um efeito negativo sobre o crescimento celular no cancro gástrico humano, devido à indução de apoptose e para o melhoramento da quimio-sensibilidade de células [30]. Pelo contrário, a supressão da expressão do gene BAX
tumorigénese induzida no epitélio gástrico [23].
Cisplatina é um tipo de agente quimioterapêutico largamente utilizado em tumores sólidos, incluindo o cancro gástrico. É geralmente aceite que o seu efeito citotóxico principal é o dano de ADN e subsequente indução da apoptose [31], de modo que as variações de genes associados a apoptose em células tratadas cisplatina penetrantemente espelham os mecanismos subjacentes a apoptose induzida por cisplatina. Como para o nosso estudo, CAC1
expressão foi regulada por tratamento com cisplatina, mas foi marcadamente reprimidos pelo tratamento siRNA apesar cisplatina anterior. Além disso, subjacente ao aumento da apoptose induzida pela cisplatina que se segue CAC1
silenciamento são alterações na expressão do gene concomitantes, incluindo a regulação positiva de P53
e BAX
, bem como a regulação negativa de BCL2.
Estes efeitos sugerem que CAC1
fortalece a apoptose induzida pela cisplatina, modulando a expressão de BCL2
, BAX Comprar e P53
.
Como mencionado anteriormente, BCL2
é aparentemente situado na convergência de um par de vias apoptóticas, e o rácio de BCL2
a BAX
proteína parece ser o determinante final se uma célula entra na fase de execução [31]. De facto, é a BCL2
/BAX
relação que governa a sensibilidade das células a estímulos apoptóticos [32, 33]. No processo de apoptose induzida pela cisplatina, CAC1
pode proteger as células AGS da apoptose, alterando BCL2
BAX
relação /, por CAC1
silenciamentos trouxe um aumento acentuado da BAX
e uma diminuição da BCL2
, que foi favorável para a ocorrência da apoptose celular.
Curiosamente, o
gene p53 nas células AGS foi regulada positivamente com o tratamento com cisplatina, especialmente com supressão de sincronismo de CAC1
. É bem conhecido que a p53
desempenha um papel importante na gestão do ciclo celular e apoptose. danos de ADN resultante da cisplatina pode estimular a expressão da proteína P53
que resulta em tanto a expressão de proteína a jusante e a paragem do ciclo celular G1 [34] P21
. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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