CDK-assosiert Cullin en kan fremme celleproliferasjon og hemme cisplatin-indusert apoptose i AGS magekreft cellelinje

CDK-assosiert Cullin en kan fremme celleproliferasjon og hemme cisplatin-indusert apoptose i AGS magekreft cellelinje
Abstract
Bakgrunn
Magekreft er en vanlig og svært dødelig kreftform i verden, men dens patogeneserelaterte restene flyktig. I denne studien har vi fokus på de biologiske funksjoner av CDK-forbundet Cullin1 (cac1
), en roman gen av Cullin familien, magekreft, som kan hjelpe oss til ytterligere å forstå opprinnelsen til denne malignitet.
metoder
den AGS og MGC803 mage kreft cellelinjer og GES-en mageslimhinnen cellelinje ble valgt for studien. I begynnelsen ble cac1
uttrykk for disse cellelinjer undersøkt av kvantitativ real-time revers transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR) og vestlige blot eksamener, så cac1
små interfererende RNA (cac1
-siRNA) ble utformet og transfektert inn i AGS-cellelinjen med et forholdsvis høyt nivå av cac1
. Når cac1
ble stille, en rekke biologiske egenskapene til AGS celler som celleproliferasjon, cellesyklus, apoptose, og uttrykk for apoptose relaterte gener (P53
, BCL2 Hotell og BAX
) var bestemt ved MTT, strømningscytometri, QRT-PCR og western blot, respektivt.
Resultater
cac1
ekspresjon av AGS eller MGC803 var mye høyere enn for GES-1. Etter cac1
uttrykk ble effektivt deprimert av RNA interferens i AGS celler, oppsto betydelig hemming av cellevekst. Videre økte andelen av celler behandlet med cac1
-siRNA i G1 fase og redusert i S-fasen, G1 som indikerer cellesyklus-stans. Enda viktigere, ble proporsjonene tidlig /sen apoptose i AGS celler forbedret med cis-diaminedichloroplatinum (cisplatin, CDDP) behandling, men til en høyere grad med cisplatin pluss cac1
-siRNA. Interessant, BCL2
mRNA kopier viste om en nedgang i cisplatin gruppen 30%, men falt med rundt 60% i cisplatin pluss cac1
-siRNA gruppe. Derimot er P53
mRNA uttrykk fått nesten en dobling i cisplatin gruppen, i tillegg til en fem-dobling i cisplatin pluss cac1
-siRNA gruppe, og BAX
mRNA nivåer hadde nesten to og fire ganger styrking, henholdsvis. I mellomtiden, P53
, BAX Kjøpe og BCL2
viste de samme endringsmønster i vestlige blot undersøkelser.
Konklusjoner
cac1
kan fremme celleproliferasjon i AGS magekreft cellelinje. Videre kan det forhindre AGS celler fra å oppleve cisplatin-indusert apoptose via modulerende uttrykk for P53
, BCL2 Hotell og BAX
.
Nøkkelord
Magekreft CDK-forbundet Cullin1 spredning Cellesyklus apoptose Bakgrunn
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de vanligste ondartede svulster og den nest største årsaken til kreftdød i verden, ansvarlig for totalt 989,600 nye tilfeller og 738,000 dødsfall årlig [1]. Over de siste årene har det vært en jevn nedgang i forekomst og dødelighet risiko for magekreft i de fleste land [2], på grunn av den enorme utviklingen i diagnostisering og behandlingsmetoder. Men fortsatt magekreft en stor trussel mot mennesker, særlig de i utviklingsland [1], og overlevelse av alle berørte pasienter, selv etter kurativ kirurgisk reseksjon og adjuvant behandling, er mindre enn 40% [3].
Epidemiologiske undersøkelsene har avdekket mange risikofaktorer for magekreft, og molekylærbiologi forskning viser videre at magekreft omfatter en rekke genetiske og epigenetiske hendelser, som involverer en klynge av onkogener, tumorsuppressorgener, cellesyklus regulatorer, celleadhesjonsmolekyler og DNA-reparasjonsgener [4] . Imidlertid er de nøyaktige mekanismer underliggende magekreft ikke godt definert.
CDK-assosierte Cullin1 er et nytt gen som er identifisert i kolorektal karsinom. Det omfatter en åpen leseramme sekvens som koder for et 37 kDa protein på 369 aminosyrer [5]. Den cac1
protein inneholder en Cullin domene mellom aminosyrene 137 og 250, og er derfor klassifisert som et medlem av Cullin familien av E3 ubiquitin ligaser [5]. Histologiske undersøkelser hadde etablert en mulig sammenheng mellom cac1
uttrykk med patologiske funksjoner og kliniske stadier av kolorektal karsinom pasienter [5]. Videre cac1
, in vitro
, ble uttrykt i en cellesyklusavhengig måte med høy ekspresjon i sen G1 til S-fasen [5]. Spesielt, kan cac1
fremme cellesyklusprogresjon og stimulere kinaseaktiviteten av CDK2 product: [5]. Likevel er lite kjent om sitt uttrykk og biologiske egenskaper i magekreft.
Denne studien ble gjennomført for å undersøke uttrykket av cac1
og å utforske den funksjonen som cac1
utfører i mage carcinom cellelinjer. Den AGS cellelinjen ble valgt som modell for å studere fordi det uttrykt relativt høyt nivå av cac1
, så cac1
uttrykk ble brakt til taushet av RNA interferens (RNAi), og en rekke biologiske parametre som er relevante for celleproliferasjon, celle syklus og apoptose ble undersøkt, tilsvarende.
Metoder
Cell kultur
menneske mage kreft cellelinjer (AGS og MGC803) og mageslimhinnen cellelinje (GES-1) ble levert av Central Laboratory of Medical College, Xi 'an Jiaotong University, Kina. Celler ble dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) supplementert med 10% nyfødt kalveserum (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 kU /l penicillin, 0,1 g /l streptomycin, 0,3 g /l L-glutamin og 0,85 g /l NaHCOs 3 ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO 2.
siRNA transfeksjon
cac1
-siRNA (fornuftig- GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT 3 ', antisense-5 ' UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG3 '), cac1
negativ kontroll siRNA (NC-siRNA, sans-5 'UUC UCC GAA CGU HiG ACG UTT 3 ', antisense-5 'ACG UGA CAC Guu CGG AGA ATT 3 ') ble kjemisk syntetisert ved Shanghai GenePharma Corporation (SGC, Shanghai, Kina). Alle sirnas ble blandet inn Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) og transfektert i henhold til siRNA Transfeksjon protokollen. Effektiviteten av cac1
knockdown ble evaluert med QRT-PCR og western blot-tester.
MTT målings
MTT (3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid tiazolyl blå indikatorfarge) kjemosensitivitet analysen ble anvendt for å bestemme den formeringshastigheten av AGS gastriske celler. Celler ble sådd ut ved en konsentrasjon på 5 x 10 3-celler per brønn i 96-brønners plater. Alle forsøk ble utført in triplo. Celler ble inkubert i 24 timer og ble oppdelt i fem grupper med fem forskjellige behandlinger (null, NC-siRNA (60 nmol /L (nM)), siRNA (30nm), siRNA (60nm), siRNA (90 nM)) for 0, 24, 48, 72 og 96 timer, tilsvarende. Tyve mikroliter av 5 mg /ml MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) i fosfatbufret saltvann (PBS) ble tilsatt per brønn og cellene ble igjen inne i inkubatoren i ytterligere 4 timer ved 37 ° C, etterfulgt av tilsetning av 150 ul DMSO. Absorbansen av den fargede løsningen ble målt av en helautomatisk multi-gjenkjenning mikroplateleser (Polarstar OPTIMA, BMG Labtechnologies, Offenburg, Tyskland) ved 490 nm.
Flowcytometrisk analyse
celler (1 x 10 5 celler /brønn) ble høstet i 6-brønners plater i 24 timer, og ble behandlet med ulike agenter (null, NC-siRNA, siRNA (60nm)) i 48 timer. Deretter ble de samlet for å bli vasket med 0,01 mol /l kald (4 ° C) PBS ved spinning ved 800 rpm, 4 ° C i 8 minutter, og deretter fiksert i 4 ° C, 75% etanol i en natt. Fikserte celler ble sentrifugert (som ovenfor) og vasket en gang med PBS. Da celler ble behandlet med 100 ul av DNase-fri, RNaseA (10 mg /ml) og inkubert ved 37 ° C i 10 minutter. Til slutt, ble cellene farget med 100 ul av 100 ug /ml propidiumjodid (lyssensitiv) og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Celler fra hver prøve ble plassert i Falcon rør og lese på en FAC sorterer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Cellesyklus-profiler ble tolket med B-D FAC Sorter Cell quest programvare.
Apoptose analyse
celler (1 x 10 5-celler /brønn) ble inkubert i 6-brønners plater. Etter 24 timer ble de adresseres med forskjellige midler (null, cisplatin (10 uM), cisplatin (10 pM) + NC-siRNA (60nm), cisplatin (10 pM) + siRNA (60nm)) i serumfritt medium i 24 timer, deretter samlet inn celler ble farget med Annexin V /PI bruker Vybrant apoptose analysesett nr 2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) og analysert ved flowcytometri.
kvantitativ real-time revers transkripsjon PCR
Expression av cac1 i magekreft cellelinjer
Total RNA ble isolert fra forskjellige cellelinjer (AGS, MGC803 og GES-1) ved hjelp av syre guanidinium-fenol-kloroform-metoden (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, USA), og cDNA ble syntetisert bruker PrimeScriptTM første Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). Primer sekvenser for forsterkning ble designet av Takara (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) og oppført som følger: forover primer 5'-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; reverse primer 5'-CAT TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3 '. β-Actin
frem primer 5'TGG CAC CCA GCA CAA TGA A -3 '; revers primer 5'CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A -3 '. Primere ble anvendt i vanlige PCR-reaksjoner med cDNA fra celler slik som å evaluere riktig design og syntese. Deretter ble PCR-produktene sekvensert og deres likhet med de ønskede nukleotidsekvensene bekreftet. Den relative mengden av mRNA ble bestemt ved hjelp av SYBR GREEN PCR Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, California, USA) med genet spesifikke primere for cac1
eller β-Actin
. Alle trinn ble utført i henhold til produsentens protokoll. Real-time PCR reaksjoner ble utført på en ABI 7500 termosykler (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) med BioRad iQ5 og MyiQTM Real-time PCR Detection System (BioRad Laboratories, Hercules, California, USA). Tre uavhengige PCR-tester ble utført fra hver prøve RT. Uttrykket av cac1
mRNA i hver prøve ble normalisert mot β-actin Hotell og uttrykket nivået ble beregnet ved hjelp av ΔΔCT (delta delta terskel syklus) -metoden.
Uttrykk av apoptose relaterte gener i AGS cellelinje
RNA isolering og cDNA-syntese ble utført som angitt. En serie av primere ble utformet og syntetisert av Takara inkludert P53 plakater (forover-5 '- CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3 ', reverse-5 '- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 '), BCL2 plakater (forover-5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 ', reverse-5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), BAX plakater (forover-5 ' - GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 '; reverse-5 ' - AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ') og β-Actin plakater (frem 5'-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 '; reversere 5 '- CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC En -3 ') gener. Som angitt ovenfor real-time PCR ble utført tre ganger. PCR-produktene ble detektert ved å måle fluorescensen mitterende ved slutten av hver reaksjon syklus. Terskelen syklus svarer til antallet av sykluser som kreves for å detektere en fluorescens-signal over grunnlinjen. Den β-aktin-genet
tjente som indre kontroll av reaksjonen.
Den mRNA-ekspresjonsnivåer ble beregnet ved bruk av to -ΔΔCT metode og uttrykt i relative enheter kvantifisering. I detalj, ble terskel sykluser av husholdningsgenet β-Actin
og målgener BCL2
, BAX Kjøpe og P53
bestemmes i hver prøve og for hver tidsperiode. CT verdier ble normalisert (ΔCT) ved å trekke uttrykket nivåer av referansen genet β-Actin
fra de tilsvarende uttrykk nivåer av BCL2
, BAX Hotell og P53
i hver prøve. Den normaliserte genuttrykket i de behandlede AGS celler ble analysert i forhold til sine matchende ubehandlet celler, som fungerte som kalibrator prøver (ΔΔCT).
Western blot undersøkelser
Femti mikrogram total protein fra AGS cellelinjen ble separert på en 10% Trisglycine SDS polyakrylamidgel og overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, California, USA). Blottet ble undersøkt med mus monoklonale antistoffer inkludert anti-cac1 plakater (GeneTex, Irvine, California, USA, 1: 1500), anti-β-Actin plakater (Santa Cruz, CA, USA; 1: 5000), anti-P53 plakater (Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), anti-BCL2 plakater (Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), og anti-BAX plakater (Santa Cruz, CA , USA; 1: 2000). Antistoffbinding ble påvist ved hjelp av Gel Blot Imaging Systems (Syngene G: BOX, Cambridge, UK). Henhold til produsentens protokoll
Statistiske analyser
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 programvare (http: //www -01. ibm. com /software /analytics /SPSS /). Hver analyse ble utført minst tre ganger. Dataene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik, og enveis ANOVA-testen (to-sidig) ble utført for å bestemme signifikans av forskjeller i multiple sammenligninger. Resultatene ble ansett for å være statistisk signifikant ved P
. ≪ 0,05
Resultater
Differensial uttrykk for cac1
i magekreft og slimhinnecellelinjer
cac1
mRNA uttrykk ble evaluert med sanntids RT-PCR i tre cellelinjer. Selvfølgelig ble cac1
uttrykt i hvert av de undersøkte cellelinjer (figur 1A). Men AGS og MGC803 cellelinjer viste høyere cac1
mRNA enn GES-en cellelinje (1,0000 ± 0,0000 og 0,9507 ± 0,0176 versus
0,4340 ± 0,0414, P
< 0,05). I tillegg cac1
protein uttrykk i vestlige blot undersøkelser viste det samme skiftende trend som cac1
mRNA (figur 1A). Figur 1 cac1 ekspresjon i humane magekreft og slimhinnecellelinjer. (A) Real-time revers transkripsjon (RT) -PCR og western blot analyse av cac1
uttrykk i AGS, MGC803 og GES-1 cellelinjer (* representerer P
< 0,05 mellom GES-en cellelinje og andre cellelinjer). (B) cac1
ekspresjon ble effektivt deprimert av 60nm cac1
-siRNA i AGS-cellelinjen på mRNA og proteinnivå (* betegner P
< 0,05 mellom kontrollgruppen og den cac1
-siRNA gruppe).
Endogen uttrykk for cac1
ble brakt til taushet av RNAi teknikk
Transient transfeksjon av AGS celler med cac1
-siRNA oligo (60nm) utformet mot cac1
sekvens effektivt hemmet uttrykk for cac1
. Cac1
mRNA uttrykk ble undersøkt ved real-time RT-PCR. Som ventet ble mRNA nivået av cac1
betydelig redusert i cac1
-siRNA gruppe (1,0000 ± 0,0000 versus
0,3583 ± 0,0244, P
< 0,05), men viste ingen signifikant forskjell mellom kontroll og NC-siRNA grupper (1,0000 ± 0,0000 versus
0,9597 ± 0,0407, P
> 0,05) (Figur 1b). I mellomtiden, cac1 protein uttrykk ble også deprimert etter siRNA behandling i vestlige blot undersøkelser (Figur 1b).
Cac1
lyddemping hemmer celledeling i AGS cellelinje
For å undersøke hvilken rolle cac1
spiller i regulering av celleproliferasjon ble AGS celler adressert av transient transfeksjon med cac1
-siRNA av tre ulike doser (30nm, 60nm og 90nm) utsatt for MTT analyse. I løpet av fire dager, cac1
stanse oppviste en tydelig hemmende virkning på celleformering i henhold til forskjellige doser av cac1
-siRNA (figur 2). Optisk tetthet (OD) av kontrollgruppen, NC-siRNA-gruppen og 30nm cac1
-siRNA gruppe viste ingen signifikant forskjell med hverandre (P
> 0,05), men var høyere enn de i 60nm og 90 nM cac1
-siRNA grupper (P
< 0,05). Interessant, celler behandlet med 60nm og 90 nM cac1
-siRNA viste nesten identiske ODS fra begynnelsen til slutten (P
> 0,05). Figur 2 Cellevekst ble hemmet følgende cac1 lyddemping. AGS celler ble transient transfektert med null, NC-siRNA og tre konsentrasjoner av cac1
-siRNA for fire dager, henholdsvis. Vekstrater av celler ble bestemt ved MTT-analyser.
Cell syklus analyse
Sammenlignet med kontrollgruppen, andelen av celler behandlet med cac1
-siRNA økte med 28% eller så i G1 /G0 fasen (45.33 % ± 0,82% versus
73,23% ± 3,04%, P
< 0,05), og redusert med ca 36% i S-fasen (41.07% ± 1,07% versus
5,40% ± 5,83%, P
< 0,05), med ingen signifikant endring i G2 /M fase (13.61% ± 0,46% versus
21,37% ± 2,88%, P
> 0,05) (figur 3). Disse resultatene indikerer at cac1
kan fremme cellesyklusprogresjon av AGS-celler via G1 /S overgang. Figur 3 knockdown av CAC1- indusert G1 cellesyklus arrest i AGS cellelinje. Cellesyklusanalyse av AGS celler behandlet med eller uten cac1
-spesifikk siRNA ved strømningscytometri. Andelen av celler ble markert forhøyet i G1 fase mens redusert i S-fasen ved behandling med cac1
-siRNA (* betegner P
< 0,05 mellom kontrollgruppen og den cac1
-siRNA gruppe).
knockdown av cac1
forbedrer cisplatin-indusert apoptose Bedrifter den AGS celler ble delt inn i fire forsøksgrupper: kontrollgruppen, den cisplatin behandlede pasienter (10 mm) gruppe, den cisplatin pluss NCsiRNA gruppe, og cisplatin pluss cac1
-siRNA (60nm) gruppe. Sammenlignet med kontrollgruppen, ble andelene av tidlig /sen apoptose forbedret med cisplatin behandling, men i høyere grad med cisplatin pluss cac1
-siRNA (2,01% ± 0,78% versus
8,87% ± 3,65% versus
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25% versus
3,89% ± 0,15% versus
10,01% ± 0,09%, P
< 0,05) (Figur 4A og 4B), som tilkjennegitt at knockdown av cac1
dramatisk akselerert cisplatin-indusert apoptose. Figur 4 cac1 lyddemping forbedret cisplatin-indusert apoptose i AGS cellelinje. (A) Effektene av cisplatin alene og i kombinasjon med NC-siRNA /cac1
-siRNA på tidlig og sent apoptose av AGS celler (* representerer P
< 0,05 mellom kontrollgruppen og behandlede grupper; #represents P
< 0,05 mellom cisplatin (CDDP) gruppe og andre behandlede grupper). (B) apoptose mønstre av AGS celler ble analysert ved flowcytometri.
Expression profiler av apoptose relaterte gener
Den mRNA nivåer av cac1
, BCL2
, BAX Hotell og P53
ble undersøkt ved QRT-PCR. Inkubasjon av AGS celler med 10 mm cisplatin og /eller 60nm cac1
-siRNA for 24 timer gjorde produsere interessante mRNA-profiler (figur 5A). Under cisplatin behandling, cac1
mRNA uttrykk øker kraftig, men falt til et lavt nivå når cac1
-siRNA ble tilsatt samtidig (1,0000 ± 0,0000 versus
2,1578 ± 0,2222 versus
0,3967 ± 0,0078, P
< 0,05). Sammenlignet med kontrollgruppen, BCL2
mRNA-kopier viste en 30% reduksjon av cisplatin-gruppen, men falt med omkring 60% i den cisplatin pluss cac1
-siRNA gruppe (1,0000 ± 0,0000 0,7090 ± versus
0,0210 versus
0,4030 ± 0,0171, P
< 0,05). Omvendt, P53 Hotell og BAX
transkripsjonsnivåer av behandlede gruppene ble vesentlig forbedret. Sammenlignet med kontrollgruppen, P53
uttrykket fått nesten en dobling i cisplatin alene gruppen, i tillegg til en fem-dobling i cisplatin pluss cac1
-siRNA gruppe (1,0000 ± 0,0000 versus
3,0187 ± 0,1738 versus
5,9957 ± 0,3926, P
< 0,05); den BAX
mRNA nivåer hadde nesten en to- og firedoblet forstørrelse (1,0000 ± 0,0000 versus
3,0237 ± 0,2581 versus
4,9897 ± 0,2923, P
< 0,05), henholdsvis. Figur 5 Expression profiler av apoptose relaterte gener i respons til cisplatin alene eller med cac1 -siRNA behandlinger. (A) Real-time revers transkripsjon (RT) -PCR analyse av cac1
, P53
, BAX Hotell og BCL2
mRNA uttrykk i AGS celler (* representerer P
< 0,05 mellom cac1
-siRNA gruppe og behandlede grupper; #represents P
< 0,05 mellom cisplatin (CDDP) gruppe og andre behandlede grupper). (B) Western blotting-analyse av cac1
, P53
, BCL2 Hotell og BAX
uttrykk i AGS celler.
Da vestlige blot tester ble utført for å påvise protein nivåer av disse genene etter cac1
knockdown. Parallelt med de nevnte mRNA endringer, ble BAX Hotell og P53
markert oppregulert mens BCL2
ble nedregulert på proteinnivå (figur 5B).
Diskusjon
ubiquitin-proteasome system spiller en sentral rolle i å opprettholde balansen mellom normal vekst og ukontrollert spredning ved å kontrollere mengde av et stort utvalg av cellulære proteiner [6]. Den Cullin familie av ubiquitin ligaser, tradisjonelt sammensatt av CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5
og 7
, representerer den største klassen av ringtypen E3 ligaser (CRL) [6]. Uten iboende katalytisk aktivitet, cullins tjene som stillasene som letter montering av multimæriske E3 ligase komplekser og overføre ubiquitin fra E2-konjugering enzym til underlaget. Cullin-mediert nedbrytning substrat dikterer et bredt utvalg av cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering og apoptose. Når cellereguleringsmekanismer av Cullin støter feil eller forstyrrelser, vil akkumulering av oncoproteiner eller overdreven nedbrytning av tumor-suppressorer uunngåelig forekomme, noe som kan fremkalle celler i malign transformasjon og tumorigenesis [6]. Spesielt cullin1
, den mest karakterisert medlem av familien Cullin, ble påvist å være nært forbundet med gastrisk karsinogenese, og dets overekspresjon spår dårlige prognosen for pasienter med gastrisk karsinom [6, 7].
Den ekspresjonsprofiler av kreftrelaterte gener i en del reflektere deres biologiske funksjoner i patogenesen av kreft. Å være et nytt medlem av Cullin familien, har cac1
uttrykk mønstre blitt grundig undersøkt i en tidligere studie [5]. Ved å bruke cDNA-bibliotek analyse, ble cac1
uttrykk som finnes i normal mage, tynntarm, tykktarm, lever, lunge, nyre, muskel, hjerte, brystkjertel, livmor, hjerne, milt, lymfeknute, med høye nivåer i tykktarmen og melkekjertler [5]. Western blot tester i tillegg oppdaget at cac1
protein i en rekke normale og kreftcellelinjer [5]. Med hensyn til vår studie, AGS og MGC803 mage kreft cellelinjer hadde høyere cac1
uttrykk enn GES-en mage mucosal cellelinje, noe som tyder på at cac1
kan spille en aktiv rolle i magekreftutvikling.
Gene stanse av RNA interferens er en kraftig metode for å analysere gen-funksjon [8]. Her har vi lykkes transfektert NCsiRNA og tre konsentrasjoner av cac1
-siRNA i AGS celler. MTT analyser viste at potensialet i AGS celler spredning ble potent hemmet av 60nm og 90 nM cac1
-siRNA i samme grad, men klarte ikke å bli påvirket av 30nm cac1
-siRNA eller NC-siRNA. Det var tydelig at cac1
kan positivt påvirke celledeling i magekreft, som var i samsvar med tidligere studier på HeLa cellelinjen [5]. I MTT eksamener, HeLa celler som uttrykker Flag-cac1
gikk høyere spredning evne enn de mock transfekterte kontrollcellene, og cellene behandlet med cac1
-siRNA viste signifikant hemmet vekst [5]. Hva mer, analyser real-time RT-PCR og Western blot bekreftet at uttrykket av cac1
ble efficaciously blokkert av 60nm cac1
-siRNA. Til sammen ble 60 nm funnet å være den mest egnede eksperimentelle dose for RNAi i etterfølgende undersøkelser.
Som en generell regel, er avhengig normal celleproliferasjon på ordnet og effektiv cellesyklusprosess som sikrer duplisering og overføring av genetisk informasjon fra en celle generasjon til den neste. Med andre ord, deregulering av celleproliferasjon alltid ligger i en unormal cellesyklus. Under cac1
-silencing forhold, strømningscytometri i vår studie viste forhøyet andel av celler i G1 /G0 fase og en redusert hastighet av celler i S-fasen. I hovedsak cac1
knockdown indusert G1 cellesyklus arrest i AGS celler, som var i samsvar med resultatene fra HeLa cellelinjen [5]. Cac1
var også i stand til å binde seg til CDK2 Hotell og stimulere sin kinase aktivitet på G1 /S fase overgang uten stor grad endre uttrykk for cyclinA
, cyclinE
, cyclinD1
, CDK2
RB
, PTEN
, og så videre [5]. Det er antatt at cac1
depresjon svekker aktiviteten av CDK2
og avbryter G1-S-overgangen.
Apoptose er en av de grunnleggende biologiske fenomener, karakterisert ved en rekke av transformasjoner i cellemorfologi [9]. Videre apoptose i samspill med celleproliferasjonen utgjør en avgjørende balanserende mekanisme som styrer et stort antall fysiologiske prosedyrer som for eksempel vev homeostase og normal utvikling [9]. Under patologiske tilfeller avvikende apoptose bidrar vanligvis mye til initiering og progresjon av kreft [10-12] og selv påvirke følsomheten av kreftceller til terapeutiske intervensjoner [13].
Utvetydig aktivitet cac1
i cellesyklus regulering hevet muligheten for at det vil si mer eller mindre, er involvert i prosessen med apoptose. I denne studien, var andelen av tidlig /sen apoptotiske celler økte med cisplatin behandling, men økt enda mer så når cac1
uttrykk Samtidig ble hemmet av RNAi. Det vil si, apoptotiske indekser av cisplatin pluss cac1
-siRNA gruppen fått en betydelig økning sammenlignet med de av de tidligere tre grupper med intakt cac1
. Kumulative data antyder at cac1
kan svekke anti-kreft effekt av cisplatin ved å motvirke cisplatin-indusert apoptose.
Regulering av apoptose, men er avhengig av et nettverk av anti- og proapoptotiske molekyler, slik som BCL2
familie [14]. BCL2 product: (B-celle CLL /lymfom 2) er et proto-onkogen som ligger i den kromosomale regionen 18q21.3, som koder for et antiapoptotic 26-kDa-protein inneholdende fire BH-domener (BH1 ~ BH4)) [15]. Det kan hindre frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene, således lertid aktivering av kaspaser og endelig begrenser apoptose [16]. Ifølge tidlige studier, overekspresjon av BCL2
driver celler mot malign transformasjon [17] og spår prognosen i mange kreftformer [18-22]. Spesielt i magekreft, hyppig uttrykk for BCL2
genet alltid skjedd i ondartet vev [23-25]. Høye uttrykk nivåer av BCL2
genet, men korrelerte med mindre aggresjon av magekreft [26], hadde mye å gjøre med narkotika motstand av kreftceller [27].
BAX product: (BCL2
tilknyttede X-protein) genet er lokalisert i det humane kromosomale region 19q13.3-q13.4 [28]. Dets 21-kDa som koder for protein, særlig tjener som et proapoptotiske medlem av BCL2
familien. BAX
protein består av tre BH domener (BH1, BH2, og BH3) og deler mye av homologi med BCL2
protein. Faktisk, til BAX
protein fungerer som en suppressor av BCL2
akselerere apoptotisk celledød, ved å danne BAX Twitter /BCL2
komplekser eller ved å konkurrere med andre BCL2
mål [29]. Overekspresjon av BAX-genet
hadde en negativ virkning på celleveksten i human magekreft, på grunn av induksjon av apoptose, og til forbedring av celle kjemosensitivitet [30]. Tvert imot, undertrykkelse av BAX
genekspresjonen indusert tumordannelse i mage epithelia [23].
Cisplatin er en form for kjemoterapeutisk middel er mye brukt i faste maligniteter, inkludert magekreft. Det er generelt akseptert at dens primære cytotoksiske effekt er DNA-skade og påfølgende induksjon av apoptose [31], slik at variasjoner av apoptose-assosierte gener i cisplatin behandlede celler penetratingly speile de mekanismer som ligger til grunn for cisplatin-indusert apoptose. Som for vår studie, ble cac1
uttrykk oppregulert ved cisplatin behandling, men ble markert nedregulert av siRNA behandling til tross for tidligere cisplatin. Videre underliggende økningen av cisplatin-indusert apoptose som følger cac1
lyddemping er samtidige genuttrykk endringer inkludert oppregulering av P53 Hotell og BAX
samt nedregulering av BCL2.
Disse effektene tyder på at cac1
styrker cisplatin-indusert apoptose ved å modulere uttrykk for BCL2
, BAX Hotell og P53
.
Som nevnt tidligere, BCL2
er tilsynelatende ligger ved konvergens av et par apoptotiske baner, og forholdet mellom BCL2
til BAX
proteinet ser ut til å være den endelige determinant av hvorvidt en celle kommer inn i gjennomføringsfasen [31]. Faktisk er det den BCL2
/BAX
-forholdet som bestemmer følsomheten av celler til apoptotisk stimuli [32, 33]. I prosessen med cisplatin-indusert apoptose, cac1
kan beskytte AGS celler fra apoptose ved å endre BCL2 Twitter /BAX
ratio, for cac1
lyddemping brakt ut en markant økning av BAX
og en reduksjon av BCL2
, som bidro til forekomsten av celle apoptose.
Interessant nok var P53
genet i AGS cellene oppregulert med cisplatin behandling, særlig med synkron undertrykkelse av cac1
. Det er velkjent at P53
spiller en viktig rolle i forvaltningen av cellesyklus og apoptose. DNA skade som følge av cisplatin kan stimulere uttrykk for P53
protein som resulterer i både uttrykk for nedstrøms P21
protein og G1 cellesyklus arrest [34]. Hvis konfrontert med uopprettelig skade på DNA, P53
protein utløser programmert celledød [31]. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Nytten av intranasal Ketamin og Midazolam å utføre mage aspirates hos barn: en dobbeltblind, placebokontrollert, å randomisert study
• Sammenslutninger av en PTPN11 G /A polymorfisme på intron 3 med Helicobacter pyloriseropositivity, gastrisk atrofi og magekreft i Japanese