Låg Helicobacter pylori primära motstånd mot klaritromycin i mag biopsiprover från dyspeptiska patienter i en stad i det inre av São Paulo, Brazil

låg Helicobacter pylori primära motstånd mot klaritromycin i mag biopsiprover från dyspeptiska patienter i en stad i det inre av São Paulo, Brasilien Bild Sammanfattning
bakgrund
Klaritromycin, amoxicillin, och en pump protonhämmare är de vanligaste drogerna rekommenderas som förstahandstrippelbehandling för H. pylori
behandling, vilket resulterar i utläkningshastigheten nära 80% varierande regionalt, främst på grund av akuta fall och ökningar av klaritromycin resistenta stammar. Nukleotidsubstitutioner vid H. pylori
domän V i 23S rRNA-fraktionen är involverade i resistensen mot makrolider och A2142G och A2143G mutationer dominerar i kliniska isolat i hela världen inklusive i Brasilien. Som H. pylori
kultur är kräsna, undersökte vi den primära förekomsten av H. pylori
A2142G och A2143G rDNA 23S mutationer med användning av ett molekylärt tillvägagångssätt direkt på gastriska biopsier från dyspeptiska patienter konsekutivt deltog vid Hospital das Clinicas av Marilia, São Paulo, Brasilien.
metoder
biopsiprover som erhållits från 1137 dyspeptiska patienter utsattes för histopatologi och H. pylori
diagnos av histologi och PCR. PCR /RFLP-analys användes för att detektera A2142G och A2143G punktmutationer vid domän V i H. pylori
23S rDNA associerad med klaritromycin motstånd. Genom den utvecklade analysen, en 768 bp PCR-amplikon motsvarande to1728 till 2495 bp av 23S H. pylori
rDNA är begränsad med MboII
för A2142G mutationsdetektion och med Bsal
för A2143G mutationsdetektion. Förekomst av 23S rDNA A2142G resulterar i två DNA-fragment (418 och 350 bp) och av 23S rDNA A2143G resulterar i tre DNA-fragment (108, 310 och 350pb), på grund av en konserverad Bsal
restriktionsställe.
Resultat
PCR-metoden används för att diagnostisera H. pylori
presenterade känslighet, specificitet och noggrannhet 77,6%, 79,3% och 78,6%, jämfört med histologi, guldstandardmetod för H. pylori
diagnos används i vår rutin. Prevalensen av H. pylori hotell med klaritromycin resistenta genotyper var 2,46%, med dominans av A2143G 23S rDNA punktmutation.
Slutsatser
PCR /RFLP-analysen var en snabb och korrekt H. pylori
diagnostik och klaritromycinresistens bestämningsmetoden användbar för rutin. Som förekomsten av primär motstånd av H. pylori
till klaritromycin grund av A2142G och A2143G mutationer förblir låg i Marilia, standard klaritromycin som innehåller trippelbehandling är fortfarande giltig.
Nyckelord
Helicobacter pylori
klaritromycinresistens Helicobacter pylori
23S rDNA magsjukdomar nukleinsyrabaserade diagnostiska bakgrund
Det är allmänt accepterat att Helicobacter pylori
, en gramnegativ mikroaerofylisk bakterie, är involverad i flera kliniska matsmältningskanalen tillstånd såsom kronisk gastrit, magsår och duodenalsår , magsäckscancer och lymfoproliferativa sjukdomar [1]. Behandling av H. pylori
infektion resulterar i sår läkning och till en minskning av risken för gastrisk cancer och lymfom [2, 3].
När bakterien H. pylori
detekteras i förändrad magslemhinna, den angivna behandling består av en trippelantibiotikabehandling, inklusive methronidazol, klaritromycin, amoxicillin, tinidazole, tetracyklin och fluorokinoloner i samband med en pump protonhämmare såsom omeprazol, lansoprazol eller pantoprazol [4-6]. H. pylori
utläkningshastigheten med ett antal kombinerade medel och regimer är nära 80% [7-9], som varierar från land till land och regionalt, inom länder [10]. Flera faktorer bidrar till denna låga hastighet av H. pylori
läkning inklusive ineffektiviteten av antibiotikumet penetration i magslemhinnan, inaktivering av antibiotikumet genom syrautsöndring i magen [11], brist på patientens efterlevnad [12] och huvudsakligen, akutfall och stigande H. pylori
antibiotikaresistenta stammar [13]. Således, är av stor betydelse för test- och behandlingsstrategier regionalt H. pylori
motstånd övervakning.
I Brasilien, ett land med kontinentala dimensioner, majoriteten av praktiserande läkare använder den klassiska trippelregim bestående av klaritromycin, amoxicillin och en protonpumpshämmare i sju dagar som första linjens behandling för att övervinna H. pylori
infektion [5, 14]. Denna regim har visat sig bli ineffektiva i hela världen, främst till följd av uppkomsten och ökningen av H. pylori
stammar som är resistenta mot klaritromycin, vilket minskar bakteriebehandlingseffektiviteten från 55% till 100% [15-18]. Bland brasilianska orter, presenterar H. pylori
klaritromycinresistens hög prevalens, varierande 7-16% hos vuxna [19-22] och 27% hos barn [23]. Följaktligen överväger den kliniska betydelsen av primär H. pylori
motstånd mot klaritromycin, dess förekomst bör övervägas innan man väljer regimer utrotning [24] Fastställande av H. pylory in vitro
känslighet för antibiotika.
Kan utföras genom standardtekniker såsom agar diffusion, agar utspädning och buljong mikrospädningsmetoder och E-test. Men på grund av den långsamma tillväxten och de speciella kraven i H.pylori
kultur, är denna metod inte är tillförlitlig för användning i de flesta rutin kliniska laboratorier, huvudsakligen i utvecklingsländerna. Därför molecular test riktar H. pylori
resistens i samband genmutationer direkt från mag biopsiprover har potential för användning i storskaliga studier [25-29].
Molekylära mekanism som är involverad i klaritromycinresistens består av mutationer i sekvensen för H. pylori
domän V i 23S rRNA-fraktion, som är involverad i peptiltransferase ribosombindningsställe förhindra ligeringen av makroliden till rRNA [30]. De stora karakteriserade punktmutationer är A till G vid positionerna 2142 och 2143, A till C vid 2142 [31-33], A till T vid 2144 [34], T till C vid 2717 [35] och C till A vid 2694 [ ,,,0],36]. De A2142G och A2143G mutationer dominerar i kliniska isolat i världen bland annat i Brasilien [21, 37-40]. Således, för att utföra en storskalig undersökning av klaritromycin primär motstånd direkt från biopsiprover av 1137 patienter deltog på sjukhuset das Clínicas av Marilia, en stad i det inre av São Paulo, Brasilien, har vi utvecklat en polymerase chain reaction samband med begränsning fragment length polymorfism (PCR-RFLP) analys för att detektera A2142G och A2143G nukleotidsubstitutioner vid domän V i H. pylori
23S rDNA.
Metoder
patienter
1137 vuxna patienter som är bosatta i Marilia stad, São Paulo State of Brasilien, i åldern 19 till 91 år, som hade följd genomgått gastroskopi (EGD) för övre delen av buken smärta eller dyspeptiska symtom från februari 2003 till december 2006 på gastroenterologiska polikliniken på sjukhuset das Clinicas av Marília Medical School, rekryterades i denna studie Endoscopy och biopsier.
EGD åstadkoms genom fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) eller video-endoskop (GIF-100) båda från Olympus, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan. Magsår eller tolvfingertarmen diagnostisk definierades av endoskopi och två fragment av antrum samlades för att utföra snabba ureas och histopatologiska tester. Den biopsi används för snabb ureastest hävdade också att DNA-extraktion. Det protokoll som används är i överensstämmelse med Helsingforsdeklarationen och godkändes av den etiska kommittén i mänskliga forsknings från Marilia Medical School, med angivande av referens 388/01. I godkände etisk kommitté forskningsprotokoll ett skriftligt informerat samtycke från varje patient som ingår i denna studie avskrevs som alla gastric biopsiprover som analyserats var samma biopsier som används rutinmässigt för ureassnabbtest som en del av gastroenterologiska politjänst sjukhus das Clinicas av Marilia Medical School och därmed var ingen specifik patienten ingripande behövs för inskrivning i den föreslagna studien. Följaktligen gjorde upphävande av skriftligt informerat samtycke inte påverkas negativt rättigheter och välfärd av de ämnen som ingår i denna forskning, samt sekretessen för patienter identitet sötma histologi.
En antral prov fastställdes i formol lösning vid 10% och inbäddades i paraffin. Sektioner Giemsa färgades för H. pylori
utvärdering och färgades med hematoxilin och eosin för bedömning av histopatologiska förändringar [41].
Polymerase chain reaction, begränsning och sekvensanalys
Samma biopsi används för snabb ureas prov överlämnades till DNA-extraktion med anställning av GFX DNA-extraktion kit köpt från Amersham /Pharmacia Biotech, enligt tillverkarens instruktioner. DNA kvantifierades i agarosgelelektrofores med användning av Invitrogen, Grand Island, New York, USA, låg massa stege och 50-100ug totalt DNA användes i PCR-reaktioner med oligonukleotiderna: Hp23Sr6 mening (5 'CACACAGGTAGATGAGATGAGTA3') och Hp23Sr7 antisens (CACACAGAACCACCGGATCACTA3 '), vilket amplifierade ett fragment av 768pb motsvarar den domän V i H. pylori
23S rDNA (Figur 1). För att övervinna problemen med omfattande genetisk polymorfism för exakt PCR-detektion av H. pylori
var oligonukleotiden konstruktion utförs efter en jämförande analys av 23S rDNA från H. pylori Mössor och besläktade organismer som finns på Genbank på MegAlign Lasergene mjukvara . PCR villkor var 94 ° C 5 'följt av 40 cykler av 94 ° C 30 "/60 ° C 30" /72 ° C 30 ", och en cykel vid 72 ° C 7', med en total volym av 25 ^ il innehållande 1 x PCR-buffert, 200 ^ M dNTP, 2,0 mM MgCl 2, 1 ^ M av varje oligonukleotid, 1,25 U Taq DNA polymeras Platinum Brasilien (Invitrogen). I alla PCR-reaktioner en negativ och en positiv kontroll användes motsvarande, respektive, sterilt vatten och H. pylori
PCR positiva gastriska biopsier. De amplifierade fragmenten digererades med MboII
och Bsal
(New England Biolabs). Dessa enzymer skiljer mutationer i H. pylori
domän V i 23S rDNA vid positionerna 2142 och 2143, respektive. I närvaro av A2142G mutation de resulterande restriktions DNA-fragmenten är av 418 bp och 350 bp och i närvaro av A2143G mutation de resulterande fragmenten är av 108, 310 e 350 bp. Som en kontroll av MboII
digestion vi använde en PCR-amplifierade DNA-fragment om 601 bp motsvarande den Leishmania major
kitinasgen som innehåller ett restriktionsställe för MboII
. En bevarad Bsal
restriktionsställe vid 768 bp PCR-amplikon är den positiva kontrollen för digerering med detta enzym som producerar DNA-fragment av 108 och 660 bp i frånvaro av A2143G mutation. Produkterna från PCR-reaktioner och restriktionsanalys löstes i 1,5% agarosgeler, färgades med etidiumbromid och fotograferades under UV-ljus. 23S rDNA 768 bp PCR-amplikoner från fyra gastriska biopsier (två positiva och två negativa för H. pylori
histologisk test) med klaritromycin känsliga MboII
och Bsal
restriktionsmönster, och från tio gastriska biopsier med clarytromycin resistenta MboII
(tre prover) och Bsal
(sju prov) restriktionsmönstren lämnades till sekvensering med DyeTM Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction kit och en ABI-3100 maskin inköpt från Applied Biosystems, enligt tillverkarens anvisningar. Nukleotidsekvensbestämning utfördes i duplikat och jämförande analys utfördes genom basisk nukleotid BLAST anpassningen [42]. Figur 1 Molekylär diagnos av Helicobacter pylori med PCR och RLFP detektion av domänen V i 23S rRNA-mutationer A2142G och A2143G ansvarig för klaritromycinresistens. A. Representation av H. pylori
23S kodande genen (Genbank: HPU27270), positionen för de primrar som används för PCR och av A2142 och A2143 från fraktion V av 23S rDNA, storlek av fragmenten som erhållits med restriktionsenzymerna Bsal och MboII
i PCR-fragment som innehåller mutation A2142G och A2143G, och intern Bsal
restriktionsstället i 768 bp amplikon, är angivna. B, C och D. agarosgel färgad med etidiumbromid innehållande ett PCR-diagnostisk analys, restriktionsanalys av den 768pb amplikon med MboII
och Bsal
, respektive. 1-10 motsvarar olika humana biopsiprover; C-, negativ kontroll av PCR, M-100 bp stege köpt från Invitrogen. Storlekar av DNA-fragment anges till vänster eller höger om varje gel siffra.
Statistisk analys
H. pylori
diagnostiska test utvärderades genom att beräkna sensitivitet, specificitet och noggrannhet som utnyttjar histologi som guldmyntfoten.
Resultat och diskussion Review, är detta den första brasilianska storskalig studie på H. pylori
diagnos och klaritromycinresistens direkt från biopsiprover av 1137 på varandra följande patienter som inkommit till övre gastroskopi, under en period av fyra år, i en stad i det inre av São Paulo, Brasilien.
Gastric sjukdom resultatet av alla patienter som ingick i denna studie deltog på gastroenterologiska polikliniken sjukhus das Clínicas av Marília undersöktes med endoskopi och histopatologi. Endoskopiska fynd av magsår eller tolvfingertarmen sjukdom (PUD) var närvarande i 123 patienter. Olika grader av kronisk gastrit (CG) observerades genom histopatologi i 706 patienter och normal magslemhinna, associerade eller inte gastroesofageal refluxsjukdom (GERD) hittades i 290 patienter. Arton patienter diagnosen adenocarcinom (15) och MALT lymfom (3) och uteslöts från studien. . Epidemiologisk analys, kliniska resultat och H. pylori
förekomsten av dessa prover publicerades nyligen [43] Upptäckt av H.
pylori
utfördes direkt från biopsiprover från tre olika tester: histologi, ett hushåll snabbt ureastest och PCR med primers Hp23Sr6 /R7 som förstärker en 768 bp bakterie fragment av domänen V 23S rDNA. Histologi är guldmyntfoten H. pylori
diagnostiskt test som används i vår kliniska rutin som tillsammans med histopatologisk analys används för att bestämma H. ​​pylori
eradikering. Hushålls snabb ureastest visade en mycket låg positiv prediktiva värdet för H. pylori
tillhörande magsjukdomar och en hög avvikelse jämfört med histologi; Följaktligen dessa uppgifter uteslöts från studien (data ej visade). 23S rDNA PCR-metoden detekterade H. pylori
i 488 gastric biopsier exemplar där histologi var positivt för 451 biopsier prover. Jämförande analys av PCR-analys utförd med Hp23Sr6 /r7 med histologi visade känslighet, specificitet och noggrannhet 77,6%, 79,3% och 78,6% (tabell 1). Eftersom båda tester utfördes på en enda och annorlunda biopsi och H. pylori
infektion presenterar en fokal karakteristiska för infektion [44, 45], är noggrannheten hos 78,6% acceptabelt för en pålitlig diagnostiskt test. Det kan påvisas genom konsistens av H. pylori
upptäckt av PCR och histologi som används i CG (53,1% och 52,7%, respektive) och PUD (61,2% och 62,6%, respektive) patienter (tabell 1). PCR upptäcks H. pylori
i 12,75% hos patienter med normal magslemhinna medan histologi var positivt för endast 0,8% av proverna. Dessa resultat kan förklaras av den mer känslig egenskap hos den sura nucleic baserade metoden. I syfte att förbättra diagnosen av H.pylori
vissa författare tyder analysen av multipla biopsier [44]. För att bekräfta specificiteten av PCR-fragment som erhållits, amplikoner från två prover med histologisk test för H. pylori
positiva och två prover med histologisk test för H. pylori
negativa sekvenserades. BLASTN analys av alla fyra biopsi förstärkta PCR-fragmenten med 23S rDNA H. pylori
specifika primers [Genbank: KF680642, Genbank: KF680643, Genbank: KF680644 och Genbank: KF680645] avslöjade identiteten på 100% med 23S rDNA referent till olika stammar av H. pylori
. Följaktligen är den utvecklade PCR-analys snabb och korrekt och kan användas som en praktisk metod för detektion av H. pylori
infection.Table 1 Kliniskt utfall och jämförelse av H. pylori diagnostiska metoder
PUD ( n = 123)
CG (n = 706)
N (n = 290) katalog
Hans +
His-
His +
His-
Hans +
His

T
PCR +
63
13
76
286
89
375 1
36
37
488
PCR-
14
33
47
86
245
331 1
252
253
631
T
77
46
123
372
334
706 2
288
290
1119
CG
kronisk gastrit, PUD
magsår, N
normal magslemhinna associerade eller inte gastroesofageal refluxsjukdom (GERD), PCR
polymeraskedjereaktion, His
histologi.
Antibiotikabehandling behandling~~POS=HEADCOMP av gastriska sjukdomar rekommenderas när H. pylori
diagnos är positiv och den klassiska eradikering bakterie består av klaritromycin, amoxicillin och en pump protonhämmare är föreskrivet. Den valda behandlingen lägga fram en hög misslyckande av H. pylori
takt utrotning i områden där resistens mot klaritromycin är högre än 15%, troligen till följd av den utbredda användningen av detta antibiotikum för luftvägsinfektion, särskilt hos barn [9]. Global primär motstånd av H. pylori
till klaritromycin varierar från 1 till 29% [46]. I Brasilien, rapporterade flera studier en klaritromycinresistens förekomsten av 7-16% hos vuxna [19, 20, 22, 47] och 27% hos barn [23]. Således, för att förbättra den empiriska val av H.pylori
associerad terapi sjukdom, undersökte vi den regionala hastighet av H.pylori
klaritromycinresistens genom detektering av den huvudsakliga relaterade punktmutationer, A2142G och A2143G vid domän V i H.pylori
23S rDNA.
Således var alla 488 H. pylori
PCR-positiva prover analyserades genom RFLP av 768 bp PCR-fragmentet som erhölls med primrarna Hp23Sr6 /7 med restriktionsenzymerna MboII
och Bsal
, med upptäcka mutationer A2142G och A2143G på domän V i H. pylori
23S rDNA, respektive (Figur 1). Endast 12 prover (2,46%) visade den muterade restriktionsmönstret, tre (25%) som hyser A2142G mutation, sju (58,3%) A2143G och ett prov (8,7%) visade både rDNA punktmutationer i PCR-23S rDNA 768 bp fragment. Ett prov visade partiell digerering med enzymet MboII
(Figur 1). De punktmutationer A2142G och A2143G för erhållna amplikoner från tre [Genbank: KF680646, Genbank: KF680647 och Genbank: KF680647] och sju [Genbank: 680.649, Genbank: 680.650, Genbank: 680.651, Genbank: 680.652, Genbank: 680.653, Genbank: 680654 och Genbank: 680655] olika biopsier prover, respektive, bekräftades genom sekvensering. Det fanns ingen sammanslutning av klaritromycin H.pylori
motstånd punktmutationer med patienternas ålder eller kön (data visas ej).
Prevalensen av H. pylori
klaritromycinresistens finns i vår region var liknande den som finns i utvecklade länder som Italien och Tyskland [7] och i det sydamerikanska utvecklingsland Paraguay [48]. Dessa resultat bekräftar den höga regionala variationen av H. pylori
antibiotikaresistens och trots ökande klaritromycinresistens över hela världen, i Marilia, var en låg resistans hastighet upprätthålls under en period av fyra år. Dessutom PCR /RFLP var en snabb och noggrann metod för detektion av klaritromycinresistens genom en genmutation direkt i mag biospsy prover och kan användas tillsammans med histologi bestämma förskrivning av klaritromycin som innehåller regim terapi.
H. pylori
23S rRNA domän V A2142G och A2143G punktmutationer är de stora mutationer som finns i H. pylori
kliniska isolat resistenta mot klaritromycin. Vi hittade en högre prevalens av A2143G jämfört med A2142G mutation i våra prover som stämmer överens med de flesta brasilianska studier inklusive stater Minas Gerais, São Paulo och Recife [20, 34, 36]. A2143G men inte A2142G punktmutation visar en synergistisk effekt av klaritromycin och amoxicillin, som har använts tillsammans i första linjens H. pylori
regim [49], förstärker behovet av att undersöka denna klaritromycin 23S rDNA punktmutation före behandling. Ett prov hyste både A2142G och A2143G mutationer vid domän V i H. pylori
23S rDNA som också konstaterades i tre H. pylori
isolat som erhållits från patienter i den brasilianska delstaten Minas Gerais [20]. Dessa resultat tillsammans med förekomsten av partiell nedbrytning av en 768 bp 23S rDNA PCR-fragmentet (figur 1) kan vara ett tecken på magen kolonisering av flera stammar av H. pylori
[50].
I Minas Gerais, Brasilien klaritromycinresistens har ökat från 4,48% 1996 till 19,05% under 2000 [20], troligen på grund av användningen av makrolider i behandlingen av andra infektionssjukdomar. Vi kunde inte hitta någon signifikant skillnad i prover som är resistenta mot klaritromycin enligt studieperioden (data ej visade). Dessa data indikerar att i vår region förskrivning och användning av makrolider inte utförs på en hög nivå. Fler studier behövs för att bekräfta denna hypotes.
Klaritromycinresistens minskar den kliniska effekten av klaritromycin baserade trippelbehandling. Eftersom förekomsten av primär motstånd av H. pylori
till klaritromycin på grund av rDNA 23S A2142G och A2143G nukleotidsubstitutioner är fortsatt låg i Marilia, standard klaritromycin som innehåller trippelbehandling är fortfarande giltig som den mest effektiva empiriska förstahandsbehandling för utrotning för H. pylori
infektion.
slutsatser
den utvecklade PCR-analys riktad mot 23S rDNA-genen av H. pylori
är snabb och exakt och kan användas som en praktisk metod för detektion av H .pylori
infektion direkt på gastric biopsiprover. Vidare kan H. pylori
23S rDNA erhållna PCR-fragmentet användas för att detektera punktmutationer 1728-2495 bp av domän V H.pylori
23S rDNA associerade till klaritromycin motstånd. Förekomsten av primär motstånd av H. pylori
till klaritromycin grund av 23S rDNA A2142G och A2143G nukleotidsubstitutioner är fortsatt låg i Marilia, alltså standard klaritromycin som innehåller trippelbehandling är fortfarande giltig som den mest effektiva empiriska första linjens behandling för utrotning av H. pylori
infektion
Förkortningar
PUD.
magsår
CG:
kronisk gastrit

GERD:
gastroesofageal refluxsjukdom
PCR:
polymeraskedjereaktion
RFLP:
restriction fragment length polymorfism.
förklaringar
Erkännanden
Vi är tacksamma till Dr Adriana Augusta Pimenta de Barros för hennes vård till alla patienter som ingår i studien och Alex Gusmão da Silva för hans bidrag för att genomföra den statistiska analysen. Detta arbete stöddes av Fundação de Amparo en pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), forskningsbidrag 03 /01223-0, 08 /01.394-4; Stipendier Rabl 2008 /01.395-0, GACL 2005 /02.482-6, THH 2003 /03.675-7.
Authors 'ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12876_2013_1025_MOESM1_ESM.pdf Författaroriginalfilen för figur 1 Konkurrerande intressen
Författarna förklarar att de inte har något konkurrerande intresse.
Författarnas bidrag
RBS genomförs behandlingen av proverna, molekylära studier, tolkning av data och deltog i utkastet av manuskriptet. Rabl, GACL och THH utförde molekylära studier och bidrog till förvärv och tolkning av molekylär data; MAS utformade experimenten, bidrog till dataanalys och utarbetade manuskriptet. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Odifferentierad typ adenocarcinom: prognostiska effekterna av tre histologiska typer
• Säkerhet och preliminära resultat av perioperativ kemoterapi och hyper intraperitoneal kemoterapi (HIPEC) för patienter magsäckscancer högrisk