Low Helicobacter pylori resistência primária à claritromicina em amostras de biópsia gástrica de pacientes com dispepsia de uma cidade no interior de São Paulo, Brazil

baixo Helicobacter pylori resistência primária à claritromicina em amostras de biópsia gástrica de pacientes com dispepsia de uma cidade no interior de São Paulo, Brasil da arte abstracta
Fundo
claritromicina, amoxicilina, e um inibidor da bomba de protões são as drogas mais comuns recomendado como primeira linha terapêutica tripla para H.pylori
tratamento, o que resulta em taxas de erradicação perto de 80% , variando regionalmente, principalmente devido aos casos de emergência e aumentos de estirpes resistentes claritromicina. substituições de nucleótidos no domínio da H. pylori
V da fracção 23S ARNr estão envolvidos na resistência bacteriana aos macrólidos e os A2142G e A2143G mutações são predominantes em todo o mundo, incluindo isolados clínicos no Brasil. Como H. pylori
cultura é exigente, foi investigada a ocorrência primária de H. pylori
A2142G e mutações A2143G rDNA 23S usando uma abordagem molecular diretamente sobre biópsias gástricas de pacientes com dispepsia consecutivamente atendidos no Hospital das Clínicas de Marília, São Paulo, Brasil.
Métodos
espécimes de biópsia obtidos de 1137 pacientes com dispepsia, foram submetidos a exame histopatológico e H. pylori
diagnóstico por histologia e PCR. ensaio /RFLP PCR foi utilizado para detectar e A2142G ponto A2143G mutações no domínio V da H. pylori
23S ADNr associada com a resistência à claritromicina. Através do ensaio desenvolvido, a 768 bp PCR amplicon correspondente to1728 de 2495 pb do 23S H. pylori
rDNA é restrito com MboII Compra de detecção da mutação A2142G e com BSAI Compra de detecção da mutação A2143G. Ocorrência de 23S rDNA A2142G resultados em dois fragmentos de ADN (418 e 350 pb) e de 23S rDNA A2143G resulta em três fragmentos de DNA (108, 310 e 350pb), devido a um BSAI
sítio de restrição conservada.
Resultados
o método de PCR utilizado para diagnosticar H. pylori
apresentou sensibilidade, especificidade e acurácia de 77,6%, 79,3% e 78,6%, respectivamente, em relação à histologia, o método padrão ouro para o H. pylori
diagnóstico utilizados na nossa rotina. Prevalência de H.pylori
com genótipos resistentes claritromicina foi 2,46%, com predomínio de mutação pontual A2143G 23S rDNA.
Conclusões
O ensaio de PCR /RFLP foi um rápido e preciso H.pylori
método de determinação da resistência de diagnóstico e claritromicina útil para a prática de rotina. Como prevalência da resistência primária de H.pylori
à claritromicina devido a A2142G e mutações A2143G permanece baixa em Marília, a claritromicina padrão contendo terapia tripla ainda é válido.
Palavras-chave
Helicobacter pylori
Claritromicina resistência Helicobacter pylori
doenças 23S rDNA de ácido gástrico Nucleic com base fundo de diagnóstico da é amplamente aceito que a Helicobacter pylori
, uma bactéria Gram bactéria microaerofílica negativo, está envolvida em várias condições do trato digestivo clínicos, tais como gastrite crônica, péptica e úlceras duodenais , câncer de estômago e distúrbios linfoproliferativos [1]. O tratamento de H. pylori
infecção resulta em cura da úlcera e na redução do risco de cancro gástrico e linfoma [2, 3].
Uma vez que o H. pylori
bactéria é detectada na mucosa gástrica alterada, indicado o tratamento consiste num regime de antibiótico triplo incluindo methronidazol, claritromicina, amoxicilina, tinidazol, tetraciclina e fluoroquinolonas associados com um inibidor da bomba de protões tais como o omeprazol, o lansoprazol ou pantoprazol [4-6]. H. pylori
taxas de erradicação com um número de agentes e regimes combinados estão perto de 80% [7-9], variando de país para país e regional, dentro dos países [10]. Vários factores contribuem para esta baixa taxa de H. pylori
cura, incluindo a ineficiência do antibiótico penetração na mucosa gástrica, a inactivação do antibiótico por a secreção ácida do estômago [11], a falta de adesão dos pacientes [12] e, principalmente, os casos de emergência e crescentes H. pylori
cepas resistentes a antibióticos [13]. Assim, regional H. pylori
vigilância da resistência é de grande importância para as estratégias de teste e tratamento.
No Brasil, um país de dimensões continentais, a maioria dos médicos que praticam a empregar o regime triplo clássica composta de claritromicina, amoxicilina e uma prótons inibidor da bomba durante sete dias, como terapia de primeira linha para superar H. pylori
infecção [5, 14]. Este regime foi provada a tornar-se ineficiente em todo o mundo, principalmente como resultado do aparecimento e crescimento de H. pylori
estirpes resistentes a claritromicina, o que reduz a eficiência do tratamento de bactéria a partir de 55% a 100% [15-18]. Entre localidades brasileiras, H. pylori
resistência à claritromicina apresenta alta prevalência, variando de 7-16% em adultos [19-22] e 27% em crianças [23]. Assim, considerando a importância clínica da H. pylori
resistência primária à claritromicina, a sua prevalência devem ser considerados antes de escolher regimes de erradicação [24].
Determinação do H. pylori in vitro
susceptibilidade aos antibióticos pode ser realizada por meio de técnicas padrão tais como a difusão de agar, métodos de diluição e de microdiluição em placa de agar e o e-test. No entanto, por causa do crescimento lento e as exigências particulares de H.pylori
cultura, esta abordagem não é confiável para uso na maioria dos laboratórios clínicos de rotina, principalmente nos países em desenvolvimento. Por isso, testes moleculares de segmentação H. pylori
resistência associadas mutações do gene directamente a partir de amostras de biópsias gástricas têm potencial para utilização em estudos de grande escala [25-29].
O mecanismo molecular envolvido na resistência a claritromicina consiste em mutações no sequência de domínio do H. pylori
V da fracção 23S que está envolvido no local de ligação ao ribossoma peptiltransferase impedindo a ligação do macrólido para o rRNA [30]. Os principais mutações pontuais são caracterizados A a G nas posições 2142 e 2143, de A para C 2142 [31-33], A a T em 2144 [34], de T para C 2717 [35] e C para A em 2694 [ ,,,0],36]. Os A2142G e A2143G mutações são predominantes em isolados clínicos em todo o mundo inclusive no Brasil [21, 37-40]. Assim, a fim de realizar uma investigação em larga escala de resistência primária claritromicina diretamente de amostras de biópsia de 1137 pacientes atendidos no Hospital das Clínicas de Marília, uma cidade no interior de São Paulo, Brasil, foi desenvolvida uma reação em cadeia da polimerase associado à restrição fragmento de polimorfismo de comprimento (PCR-RFLP) para detectar as substituições A2142G e nucleótidos A2143G no domínio V do H. pylori
23S rDNA.
Métodos
pacientes
1.137 pacientes adultos residentes na cidade de Marília, Estado de São Paulo do Brasil, com idades entre 19 a 91 anos, que tinha esofagogastroduodenoscopia submetidos consecutivamente (EGD) para a dor abdominal superior ou sintomas de dispepsia de fevereiro de 2003 a dezembro de 2006 no ambulatório de Gastroenterologia do Hospital das clínicas de Marília Faculdade de Medicina, foram inscritos neste estudo.
Endoscopia e biópsias
A EGD foi realizada por fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) ou vídeo-endoscópio (GIF-100) ambos da Olympus, Shinjuku-ku, Tóquio, Japão. úlcera gástrica ou duodenal diagnóstico foi definido por endoscopia e dois fragmentos do antro foram recolhidas para se realizar o rápido da urease e testes histopatológicos. A biópsia utilizada para o teste rápido da urease foi ainda submetido a extração de DNA. O protocolo utilizado está de acordo com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Faculdade de Medicina de Marília, com a referência 388/01. No Comitê de Ética aprovou o protocolo de pesquisa um termo de consentimento informado de cada paciente incluído neste estudo foi dispensado como todas as amostras de biópsia gástrica analisados ​​foram os mesmos biópsias utilizados rotineiramente para o teste rápido da urease, como parte do serviço de gastroenterologia ambulatório do Hospital das Clínicas de Marília Medical School e, portanto, nenhuma intervenção específica do paciente era necessário para a inscrição neste estudo proposto. Por conseguinte, a renúncia do consentimento informado por escrito não afetou negativamente os direitos e bem-estar dos indivíduos incluídos nesta pesquisa, bem como a confidencialidade da identidade pacientes foi garantido.
Histologia
Um espécime antrais foi fixado em solução de formol a 10% e embebidos em parafina. Os cortes foram coloração Giemsa para avaliação H. pylori Comprar e foram coradas com hematoxilina e eosina para avaliação das alterações histopatológicas [41]. Reação em cadeia da polimerase
, restrição e análise de sequenciação
O mesmo biópsia utilizada para a rápida urease ensaio foi submetida a extracção do ADN com o emprego do kit de extracção de ADN GFX comprado de Amersham /Pharmacia Biotech, seguindo as instruções do fabricante. O ADN foi quantificado em electroforese em gel de agarose utilizando a Invitrogen, Grand Island, Nova Iorque, EUA, de baixa massa escada e 50-100ug de ADN total foram utilizados nas reacções de PCR com os oligonucleótidos: Hp23Sr6 sentido (5 'CACACAGGTAGATGAGATGAGTA3') e anti-sentido Hp23Sr7 (CACACAGAACCACCGGATCACTA3 '), que amplificou um fragmento de 768pb correspondente ao domínio V do H. pylori
23S ADNr (Figura 1). Para superar os problemas de grande polimorfismo genético para detecção de DNA precisa do H.pylori
, a construção oligonucleotídeo foi realizada após uma análise comparativa do 23S rDNA de H. pylori Comprar e organismos disponíveis no Genebank em software MegAlign Lasergene . condição de PCR foi de 94 ° C 5 'seguido por 40 ciclos de 94 ° C, 30 "/60 ° C 30" /72 ° C 30 "e um ciclo a 72 ° C 7', com um volume total de 25 ul contendo 1 × tampão de PCR, 200 uM dNTP, MgCl 2,0 mM 2, 1 jiM de cada oligonucleótido, 1,25 U de Taq DNA polimerase Platinum Brasil (Invitrogen). Em todas as reacções de PCR um negativo e um controlo positivo foram utilizados correspondente a, respectivamente, de água estéril e biópsias gástricas positivos a H. pylori
PCR. Os fragmentos amplificados foram digeridos com MboII
e BSAI
(New England Biolabs). Estas enzimas distinguir mutações no domínio da H. pylori
V do 23S rDNA nas posições 2142 e 2143, respectivamente. Na presença da mutação A2142G os fragmentos de ADN resultantes são restrição de 418 pb e 350 pb, e na presença de mutação A2143G os fragmentos resultantes são de 108, 310 e 350 pb. Como um controlo de MboII
a digestão utilizou-se um fragmento de ADN amplificado por PCR de 601 pb, correspondente ao gene da quitinase grande
Leishmania que contém um local de restrição para
MboII. Um BSAI conservada
local de restrição no 768 pb fragmento amplificado pela PCR é o controlo positivo para a digestão com esta enzima que produz fragmentos de ADN de 108 e 660 pb na ausência de mutação A2143G. Os produtos de PCR e análise de restrição reacções foram resolvidos em géis de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio e fotografado sob luz UV. 23S rDNA 768 amplicons bp PCR de quatro biópsias gástricas (dois positivos e dois negativos para H. pylori
teste histológico) com MboII sensíveis claritromicina
e BSAI
padrão de restrição e, a partir de dez biópsias gástricas com MboII resistentes clarytromycin
(três amostras) e BSAI
(sete amostras) padrões de restrição foram submetidos a sequenciação com DyeTM Terminator ciclo v3.0 Sequencing kit de Reacção Pronto e uma máquina ABI-3100 comprado de Applied Biosystem, de acordo com as instruções do fabricante. Determinação da sequência de nucleótidos foi realizada em duplicado e análise comparativa foi feita por alinhamento de nucleótidos BLAST de base [42]. A Figura 1 diagnóstico molecular de Helicobacter pylori por PCR e RLFP detecção do domínio V do rRNA 23S mutações A2142G e A2143G responsável pela resistência à claritromicina. A. Representação da H. pylori
23S de codificação de genes (Genbank: HPU27270), a posição dos iniciadores utilizados para a PCR e do A2142 e A2143 da fracção V de 23S ADNr, o tamanho dos fragmentos obtidos com enzimas de restrição BSAI e MboII
em fragmentos de PCR contendo as mutações A2142G e A2143G e BSAI interna
sítio de restrição do fragmento amplificado 768 bp, são indicados. gel B, C e D. de agarose corado com brometo de etídio contendo uma análise de diagnóstico PCR, análise de restrição do amplicon 768pb com MboII Comprar e BSAI
, respectivamente. 1-10 correspondem às diferentes amostras de biópsia humana; C-, controlo negativo de PCR, H-100 bp ladder adquirido de Invitrogen. Os tamanhos dos fragmentos de DNA são indicados à esquerda ou à direita de cada figura gel. Análise
Estatística
H. pylori
testes de diagnóstico foram avaliadas por meio do cálculo da sensibilidade, especificidade e acurácia histologia utilizando como padrão-ouro.
resultados e discussão
Este é o primeiro estudo brasileiro de grande escala em H. pylori
diagnóstico e resistência à claritromicina diretamente de amostras de biópsia de 1137 pacientes consecutivos submetidos a gastroscopia superior, ao longo de um período de quatro anos, em uma cidade interior de São Paulo, Brasil.
evolução da doença gástrica de todos os pacientes incluídos no estudo, atendidos no ambulatório de Gastroenterologia do Hospital das Clínicas de Marília foi investigada por endoscopia e histopatologia. achados endoscópicos de úlcera péptica ou duodenal (PUD) estava presente em 123 pacientes. Diferentes graus de gastrite crônica (CG) foram observados por exame histopatológico em 706 pacientes e mucosa gástrica normal, associada ou não à doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) foi encontrado em 290 pacientes. Dezoito pacientes foram diagnosticados como portadores de adenocarcinoma (15) e linfoma MALT (3) e foram excluídos do estudo. . Análise epidemiológica, evolução clínica e H. pylori prevalência
destas amostras foram recentemente publicados [43]
Detecção de H. pylori
foi realizada directamente a partir de amostras de biópsia por três testes diferentes: histologia, uma casa rápida teste da urease e da PCR com os iniciadores Hp23Sr6 /R7, que amplificam um fragmento de 768 pb bactéria do domínio V do ADNr 23S. Histologia é teste de diagnóstico do padrão ouro H.pylori
empregada em nossa rotina clínica que, juntamente com a análise histopatológica é usado para decidir por H. pylori
terapia de erradicação. O teste rápido da urease doméstico apresentou um valor preditivo positivo muito baixo para H. pylori
associada doenças gástricas e uma alta discrepância quando comparada à histologia; Em consequência, estes dados foram excluídos do estudo (dados não mostrados). O método 23S rDNA PCR detectou H. pylori
em 488 biópsias gástricas espécimes onde histologia foi positivo para 451 amostras de biópsias. Análise comparativa do ensaio de PCR realizada com o Hp23Sr6 /r7 com a histologia mostrou sensibilidade, especificidade e precisão de 77,6%, 79,3% e 78,6%, respectivamente (Tabela 1). Como ambos os testes foram realizados em uma única e diferente biópsia e infecção por H. pylori
apresenta uma característica focal da infecção [44, 45], a precisão de 78,6% é aceitável para um ensaio de diagnóstico digno de confiança. Pode ser demonstrado pela consistência da H. pylori
detecção por PCR e histologia empregues em GC (53,1% e 52,7%, respectivamente) e DPU (61,2% e 62,6%, respectivamente) pacientes (Tabela 1). PCR detectou H.pylori
em 12,75% em pacientes com mucosa gástrica normal, enquanto a histologia foi positivo para apenas 0,8% das amostras. Estes resultados podem ser explicados pela característica mais sensível do método com base de ácido nucleico. A fim de melhorar o diagnóstico de H. pylori
alguns autores sugerem que a análise de múltiplas biópsias [44]. A fim de confirmar a especificidade dos fragmentos de PCR obtidos a partir de produtos de amplificação, duas amostras com o teste histológico para H. pylori
amostras positivas e duas com o teste histológico para H. pylori
negativo foram sequenciados. análise BLASTN de todos os quatro biópsia amplificados fragmentos de PCR com primers específicos do 23S rDNA de H. pylori
[Genbank: KF680642, Genbank: KF680643, Genbank: KF680644 e Genbank: KF680645] identidade revelada de 100% com o referente 23S rDNA para diferentes cepas de H. pylori
. Por conseguinte, o ensaio de PCR desenvolvido é rápida e precisa e pode ser utilizado como um método prático para a detecção de H. pylori
infection.Table 1 Os resultados clínicos e comparação de H. pylori métodos de diagnóstico
DPU ( n = 123)
CG (n = 706)
N (n = 290)

His +
His
His +
His
His +
His

T
PCR +
63
13
76
286
89
375
1 | 36
37
488
PCR-
14
33
47
86
245
331
1 | 252
253
631
T
77
46
123
372
334
706 Página 2
288
290
1119
CG
gastrite crônica, PUD
úlcera péptica, N
mucosa gástrica normal, associada ou não a doença do refluxo gastroesofágico (DRGE), PCR
reação em cadeia da polimerase, Sua
histologia. tratamento
Antibiótico de doenças gástricas é recomendado quando H. pylori
diagnóstico é positivo ea terapia de erradicação clássico bactéria composta de claritromicina, amoxicilina e um inibidor de bomba de próton é prescrito. A terapia escolhida apresentar um elevado falha de H. pylori
taxa de erradicação, em áreas onde a resistência a claritromicina é mais elevada do que 15%, provavelmente em resposta à utilização generalizada deste antibiótico para infecção do tracto respiratório, especialmente em crianças [9]. resistência primária global de H. pylori
a gamas de claritromicina de 1 a 29% [46]. No Brasil, vários estudos relataram uma prevalência claritromicina resistência de 7-16% em adultos [19, 20, 22, 47] e 27% em crianças [23]. Assim, a fim de melhorar a escolha empírica de H. pylori
terapia de doença associada, investigou-se a taxa regional de claritromicina H. pylori
resistência através da detecção de mutações pontuais a grande relacionados, A2142G e A2143G no domínio V de o H. pylori
23S ADNr.
Assim, todas as amostras positivas para H. pylori
488 de PCR foram analisados ​​por RFLP do fragmento de PCR de 768 pb obtido com os iniciadores Hp23Sr6 /7 com as enzimas de restrição MboII
e BSAI
, com detectar mutações A2142G e A2143G no domínio V do H. pylori
23S rDNA, respectivamente (Figura 1). Apenas 12 amostras (2,46%) mostrou o padrão de restrição mutagenizado, três (25%) que alberga a mutação A2142G, sete (58,3%) A2143G e uma amostra (8,7%) apresentaram ambas as mutações pontuais nas rDNA 23S PCR rDNA fragmento de 768 pb. Uma amostra mostrou a digestão parcial com a enzima MboII
(Figura 1). As mutações pontuais A2142G e A2143G dos amplicons obtidos a partir de três [Genbank: KF680646, Genbank: KF680647 e Genbank: KF680647] e sete [Genbank: 680.649, Genbank: 680.650, Genbank: 680.651, Genbank: 680.652, Genbank: 680.653, Genbank: 680654 e no Genbank: 680655] diferentes amostras de biópsias, respectivamente, foram confirmados por sequenciação. Não houve associação de claritromicina H.pylori
mutações pontuais resistência com a idade ou sexo (dados não mostrados) dos pacientes.
A prevalência de H. pylori
claritromicina resistência encontrada na nossa região foi semelhante ao encontrado em países desenvolvidos como a Itália ea Alemanha [7] e do país em desenvolvimento do Sul americana Paraguai [48]. Estes resultados confirmam a variabilidade regional, alta de H.pylori
resistência aos antibióticos e apesar de aumentar a resistência à claritromicina em todo o mundo, em Marília, uma taxa baixa resistência foi mantida durante o período de quatro anos. Além disso, a PCR /RFLP era um método rápido e preciso para a detecção de resistência à claritromicina através de uma mutação do gene directamente em amostras biospsy gástrico e podem ser utilizados em conjunto com a histologia para decidir para a prescrição de terapia regime contendo claritromicina.
H. pylori
23S domínio V A2142G e A2143G mutações pontuais são as principais mutações encontradas em H. pylori
isolados clínicos resistentes à claritromicina. Encontramos uma maior prevalência de A2143G em comparação com mutação A2142G em nossas amostras que está de acordo com a maioria dos estudos brasileiros, incluindo os Estados de Minas Gerais, São Paulo e Recife [20, 34, 36]. A2143G mas não mutação pontual A2142G mostra um efeito sinérgico de claritromicina e amoxicilina, que têm sido utilizados em conjunto na primeira linha H. pylori
regime [49], o que reforça a necessidade de investigar esta claritromicina mutação pontual 23S ADNr antes do tratamento. Uma amostra abrigava ambas as mutações A2142G e A2143G no domínio V do H. pylori
23S rDNA, que também foi encontrado em três H.pylori
isolados obtidos de pacientes do Estado de Minas Gerais [20]. Estes resultados, juntamente com a ocorrência de digestão parcial de um fragmento de 768 pb 23S rDNA PCR (Figura 1) pode ser indicativo da colonização do estômago de múltiplas estirpes de H.pylori
[50].
Em Minas Gerais, Brasil, claritromicina resistência aumentou de 4,48% em 1996 e 19,05% em 2000 [20], provavelmente devido ao uso de macrólidos para o tratamento de outras doenças infecciosas. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa em amostras resistentes a claritromicina de acordo com o período do estudo (dados não mostrados). Estes dados indicam que, na nossa região de prescrição e a utilização de macrolidos não é realizada numa escala elevada. Mais estudos são necessários para confirmar esta hipótese.
Resistência à claritromicina reduz a eficácia clínica da terapia tripla baseada em claritromicina. No entanto, como prevalência da resistência primária de H.pylori
à claritromicina devido às A2142G e nucleótidos A2143G substituições rDNA 23S permanece baixa em Marília, a claritromicina padrão contendo terapia tripla ainda é válida como a terapêutica empírica mais eficaz de erradicação de primeira linha para infecção por H. pylori
.
Conclusões
o ensaio de PCR desenvolveu-alvo para o gene 23S rDNA de H. pylori
é rápida e precisa e pode ser utilizado como um método prático para a detecção de H infecção .pylori
diretamente em amostras de biópsia gástrica. Além disso, o H. pylori
fragmento de 23S rDNA PCR obtido pode ser utilizado para detectar mutações pontuais 1.728-2.495 pb do domínio V H. pylori
23S ADNr associado à resistência à claritromicina. Prevalência da resistência primária de H.pylori
à claritromicina devido a 23S rDNA A2142G e nucleótidos A2143G substituições permanece baixa em Marília, assim, a claritromicina padrão contendo terapia tripla ainda é válida como a terapia de erradicação mais eficaz empírica de primeira linha para H. pylori
infecção
abreviações
PUD:.
úlcera péptica
CG:
gastrite crônica

GERD:
doença do refluxo gastroesofágico
PCR:
reação em cadeia da polimerase
RFLP:
polimorfismo de fragmento de restrição.
Declarações
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Adriana Augusta Pimenta de Barros para ela o cuidado de todos os pacientes incluídos no estudo e Alex Gusmão da Silva por sua contribuição para a realização da análise estatística. Este trabalho foi financiado pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Bolsas de Investigação 03 /01223-0, 08 /01394-4; Bolsas RABL 2008 /01395-0, GACL 2005 /02482-6, THH 2003 /03675-7.
Autores 'original apresentada arquivos para imagens
Abaixo estão os links para os autores' arquivos submetidos original para imagens. 12876_2013_1025_MOESM1_ESM.pdf Autores 'arquivo original para a figura 1 Conflito de interesses
Os autores declaram que não têm interesse competindo.
Autores' contribuições
RBS realizaram o processamento das amostras, estudos moleculares, interpretação de dados e participou com o projecto do manuscrito. RABL, GACL e THH efectuou os estudos moleculares e contribuiu para a aquisição e interpretação de dados molecular; MAS projetou os experimentos, contribuiu para a análise de dados e elaborou o manuscrito. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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