Alacsony Helicobacter pylori elsődleges rezisztencia klaritromicin gyomor biopsziás mintáiban emésztési betegek egy város belsejében São Paulo, Brazília

Alacsony Helicobacter pylori elsődleges rezisztencia klaritromicin gyomor biopsziás mintáiban emésztési betegek egy város belsejében São Paulo, Brazília katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa klaritromicin, amoxicillin, és egy szivattyú proton-gátló a leggyakoribb gyógyszerek ajánlott elsővonalbeli hármas terápia pylori katalógusa kezelés, ami eradikáció aránya közel 80%, változó regionálisan, elsősorban azért, mert a sürgősségi esetek és növeli a klaritromicin rezisztens törzsek. Nukleotidhelyettesítések a H. pylori
domén V. 23S rRNS frakció részt vesznek a makrolid rezisztencia és a A2142G és A2143G mutációk vannak túlsúlyban a klinikai izolátum világszerte, beleértve Brazíliában. Mivel H. pylori katalógusa kultúra válogatós, megvizsgáltuk az elsődleges előfordulását H. pylori katalógusa A2142G és A2143G rDNS 23S mutációk segítségével molekuláris megközelítés közvetlenül a gyomor biopszia diszpepsziás beteg egymást követően részt vett a kórház das Clinicas Marilia, São Paulo, Brazília. katalógusa módszerek katalógusa biopszia mintákat nyert 1137 emésztési betegek voltak kitéve a szövettani és a H. pylori katalógusa diagnózis szövettani és PCR. PCR /RFLP vizsgálatot kimutatására használt A2142G és A2143G pontmutációk domén V. H. pylori
23S rDNS társított klaritromicin ellenállás. Keresztül a fejlett vizsgálatban egy 768 bp PCR-fragmentum megfelelő to1728 az 2495 bp-23S rDNS a H. pylori katalógusa korlátozódik a MboII katalógusa az A2142G mutáció és Bsal katalógusa az A2143G mutáció. Előfordulása 23S rDNS A2142G eredményeket két DNS fragmentumokat (418 és 350 bp) és a 23S rDNS A2143G eredményeket három DNS-fragmentumok (108, 310 és 350pb) miatt a konzervatív Bsal katalógusa restrikciós. Katalógusa Eredmények
a PCR módszerrel diagnosztizálni H. pylori katalógusa bemutatott érzékenység, specifikusság és pontossága 77,6%, 79,3% és 78,6% -kal, míg a szövettani, az arany standard módszer a H. pylori
használt diagnosztikai mi rutin. Prevalenciája a H. pylori katalógusa clarithromycinnel rezisztens genotípusok 2,46%, a túlsúlya A2143G 23S rDNS pontmutáció. Katalógusa Következtetések katalógusa A PCR /RFLP vizsgálat volt a gyors és pontos H. pylori katalógusa diagnosztikai és klaritromicin ellenállás meghatározása módszer hasznos rutin klinikai gyakorlatban. Mivel prevalenciája primer rezisztencia, a H. pylori katalógusa klaritromicin miatt A2142G és A2143G mutáció alacsony marad Marilia, a standard klaritromicin tartalmú hármas terápia még mindig érvényes. Katalógusa Kulcsszavak katalógusa Helicobacter pylori katalógusa klaritromicin ellenállás Helicobacter pylori
23S rDNS gyomorbetegségek nukleinsav alapú diagnosztikai alapon
széles körben elfogadott, hogy a Helicobacter pylori katalógusa, egy Gram-negatív microaerophylic baktérium, részt vesz számos klinikai emésztőrendszerben körülmények között, például krónikus gastritis, gyomorfekély és nyombélfekély , gyomorrák és lymphoproliferativ betegségek [1]. A kezelés a H. pylori katalógusa fertőzés eredményez a fekély gyógyulását, és csökkenti a kockázatát gyomorrák és a limfóma [2, 3].
Amint a baktérium H. pylori
észlelt megváltozott gyomor nyálkahártya, a jelzett kezelés áll, egy hármas antibiotikum kezelés, beleértve a methronidazol, klaritromicin, amoxicillin, tinidazol, a tetraciklin és fluorokinolonokra társított szivattyú proton inhibitor, például omeprazol, lanzoprazol vagy pantoprazol [4-6]. H. pylori eradikáció aránya katalógusa számos kombinált szerek és kezelések közel 80% [7-9], változó országonként és régiónként, országokon belül [10]. Számos tényező járul hozzá ez az alacsony arány a H. pylori
gyógyulás beleértve a nem hatékony antibiotikum penetráció a gyomor nyálkahártya, az antibiotikum inaktiválódását a sav szekréció a gyomor [11], hiányzik a beteg [12] és elsősorban a sürgősségi esetek és a növekvő H. pylori katalógusa antibiotikumokkal szemben rezisztens törzsek [13]. Így a regionális H. pylori katalógusa ellenállás ellenőrzés nagyon fontos vizsgálati és kezelési stratégiák.
Brazíliában, az ország kontinentális méreteket, a legtöbb gyakorló klinikusok alkalmazzák a klasszikus hármas rend tagjai klaritromicin, amoxicillin és a protonpumpa-gátló hét napig elsővonalbeli terápia leküzdeni a H. pylori fertőzés katalógusa [5, 14]. Ez a séma bebizonyosodott, hogy legyen hatékony világszerte, főként eredményeként a megjelenése és növekedése a H. pylori katalógusa rezisztens törzsek klaritromicin, ami csökkenti a baktérium kezelés hatékonysága 55% -ról 100% [15-18]. Között brazil helységek, H. pylori katalógusa klaritromicin ellenállást mutat magas előfordulási változó 7-16% a felnőtteknél [19-22], és 27% -ban a gyermekek [23]. Ennek megfelelően, figyelembe véve a klinikai jelentőségét elsődleges H. pylori katalógusa ellenállás klaritromicin, prevalenciája figyelembe kell venni kiválasztása előtt felszámolására rendek [24]. Katalógusa meghatározása H. pylory in vitro katalógusa hajlamot antibiotikumokat is elvégezhető standard technikákkal, mint például az agar-diffúziós, agar hígítási és a húslevest mikrodilúciós módszerek és az E-teszt. Azonban, mivel a lassú növekedés és a különleges követelményeknek a H. pylori katalógusa kultúra, ez a megközelítés nem megbízható használata a legtöbb rutin klinikai laboratóriumok, elsősorban a fejlődő országokban. Ezért, molekuláris vizsgálatok célzási H. pylori
rezisztencia-asszociált gén mutációk közvetlenül a gyomor biopsziás minták rendelkeznek azzal a potenciállal való használatra nagyméretű vizsgálatok [25-29].
A molekuláris mechanizmus részt vesz a clarithromycin rezisztencia áll mutációk szekvenciáját a a H. pylori
domén V. 23S rRNS frakciót, amely részt vesz a peptiltransferase riboszómakötő hely megakadályozza a ligálást a makrolid a rRNS [30]. A fő jellemzett pont mutációk A-tól G-helyzetben 2142 és 2143, A-ról C-2142 [31-33], A-T-vel, 2144 [34], T-ről C-2717 [35], valamint a C-től a 2694 [ ,,,0],36]. Az A2142G és A2143G mutáció domináns klinikai izolátumok világszerte, beleértve a brazíliai [21, 37-40]. Így annak érdekében, hogy végre egy nagyszabású vizsgálat klaritromicin elsődleges rezisztencia közvetlenül biopsziás mintákat 1137 beteg vett részt a kórházban das Clínicas Marilia, a város belsejében São Paulo, Brazília, kifejlesztettünk egy polimeráz láncreakció kapcsolatos korlátozás fragmens hossz polimorfizmus (PCR-RFLP) vizsgálatnak érzékeli a A2142G és A2143G nukleotid szubsztitúció domén V. H. pylori katalógusa 23S rDNS. katalógusa módszerek
betegek katalógusa 1137 felnőtt beteg lakó Marilia város, São Paulo állam Brazília, éves 19-91 éves, aki egymás után keresztülment esophagogastroduodenoscopy (EGD) felső hasi fájdalom vagy diszpepsziás tünetek 2003 februárja keresztül 2006. december gasztroenterológiai ambulancia a Kórház das Clínicas Marilia Medical School vontunk ebben a vizsgálatban. katalógusa endoszkópos és szövettani
EGD úgy végeztük fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) vagy video-endoszkópos (GIF-100) mindkét Olympus, Shinjuku-ku, Tokyo, Japan. Gyomor- vagy nyombélfekély diagnosztikai által definiált endoszkópia és két töredék az antrum összegyűjtöttük, hogy hajtsa végre a gyors ureáz és kórszövettani vizsgálatok. A biopszia használt gyors ureáz tesztet továbbá közölte, hogy DNS kivonás. Az alkalmazott protokoll egyetért a Helsinki Nyilatkozat és hagyta jóvá az illetékes etikai bizottság Humán Kutatás Marilia Medical School, hivatkozási szám alatt 388/01. Az Etikai Bizottság jóváhagyta a kutatási protokollt egy írásos beleegyezést Minden beteg ebbe a vizsgálatba bevont lemondtak az összes gyomor biopsziás vizsgálati mintákat azonos biopszia rutinszerűen alkalmazott ureáz gyorsteszt részeként gasztroenterológiai járóbeteg-ellátásban a Kórház das Clinicas Marilia Medical School és így nem adott beteg beavatkozásra volt szükség a beiratkozás a javasolt tanulmány. Ennek megfelelően lemond az írásos beleegyezési nem érinti hátrányosan a jogait és jólétét a vizsgálatba bevont személyek ebben a kutatásban, valamint a bizalmas beteg személyazonosságát garantált. Katalógusa Szövettan katalógusa One antrális mintának rögzítették formalin oldatban 10% -os, és paraffinba ágyaztuk. A metszeteket Giemsa festett H. pylori katalógusa értékelés és festettünk hematoxilin és eozin értékelésére szövettani elváltozások [41]. Katalógusa polimeráz láncreakció, korlátozás és szekvenálása elemzés katalógusa Ugyanez biopszia használt gyors ureáz teszt benyújtották DNS kivonás a foglalkoztatás a GFX DNS extrakciós kit vásárolt Amersham /Pharmacia Biotech, követve a gyártó utasításait. DNS-t mennyiségileg agaróz gél elektroforézissel használatával Invitrogen, Grand Island, New York, USA, az alacsony tömeg létrán, és 50-100ug teljes DNS-t használjuk a PCR reakciókban az oligonukleotidokkal: Hp23Sr6 értelemben (5 'CACACAGGTAGATGAGATGAGTA3) és Hp23Sr7 antiszensz (CACACAGAACCACCGGATCACTA3 '), amely amplifikált fragmense 768pb megfelelő domén V. H. pylori
23S rDNS (1. ábra). Problémák megoldására széles körű genetikai polimorfizmus pontos PCR kimutatása pylori katalógusa, az oligonukleotid építkezés után végeztük egy összehasonlító elemzést a 23S rDNS-re H. pylori katalógusa és a hozzá kapcsolódó szervezetek rendelkezésre génbank a Megalign Lasergene szoftver . A PCR-körülmények 94 ° C-5 ', majd 40 ciklusban 94 ° C 30 "/60 ° C 30" /72 ° C-30 ", és egy ciklus 72 ° C-7', a teljes térfogat 25 ul, amely 1 × PCR-puffert, 200 jiM dNTP-k, 2,0 mM MgCI 2, 1 uM az egyes oligonukleotid, 1,25 U Taq DNS-Polimeráz Platinum Brazília (Invitrogen). Minden PCR-reakciók egy negatív és egy pozitív kontroll használtunk megfelelő, illetve steril víz és a H. pylori
PCR-pozitív gyomor biopszia. Az amplifikált fragmenseket emésztettük MboII
és Bsal
(New England Biolabs). Ezek az enzimek megkülönböztetésére mutáció a H. pylori katalógusa V domain a 23S rDNS a pozíciót 2142 és 2143, ill. Jelenlétében A2142G mutáció a kapott restrikciós DNS fragmenteket 418 bp és 350 bp és jelenlétében a A2143G mutáció a kapott fragmenteket 108, 310 E 350 bp. Kontrollként a MboII katalógusa emésztés használtuk egy PCR-amplifikált DNS-fragmenst 601 bp megfelelő Leishmania major
kitináz gén, amely tartalmaz egy restrikciós helyet MboII katalógusa. Egy konzervált Bsal
restrikciós helyet a 768 bp PCR-fragmentumot a pozitív kontroll esetében emésztéssel ezen enzim termelő DNS-fragmenseket 108 és 660 bp hiányában A2143G mutációt. A termékek a PCR-reakciók és restrikciós analízis oldani 1,5% -os agaróz gélen, etidium-bromiddal festjük és lefényképezzük UV fény alatt. 23S rDNS 768 bp PCR fragmentumok négy gyomor biopszia (két pozitív és két negatív H. pylori katalógusa szövettani vizsgálat) a klaritromicin érzékeny MboII
és Bsal katalógusa restrikciós mintázatot, és tíz gyomor biopsziás a clarytromycin ellenálló MboII katalógusa (három minta) és Bsal katalógusa (hét minta) restrikciós mintázatú benyújtott szekvenciálások DyeTM Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction kit és ABI-3100 készüléket vásárolt Applied Biosystem, a gyártó utasításai szerint. A nukleotidszekvencia meghatározását végeztük, két példányban, és összehasonlító elemzést végeztünk az alap nukleotid BLAST igazítás [42]. 1. ábra molekuláris diagnosztikája Helicobacter pylori PCR és RLFP kimutatására domain V. 23S rRNS mutációk A2142G és A2143G felelős klaritromicin ellenállás. A. képviselete a H. pylori
23S kódoló gént (Genbank: HPU27270) helyzetét a primerek PCR-hez használt és a A2142 és A2143-re V frakció a 23S rDNS, mérete a nyert fragmenseket restrikciós enzimekkel Bsal és MboII
PCR-fragmentumokat a mutációkat tartalmazó A2142G és A2143G, és a belső Bsal
restrikciós a 768 bp fragmentum, fel van tüntetve. B, C és D. Az agaróz gél etidium-bromiddal megfestjük, amelyek egy PCR diagnosztikai, a restrikciós elemzést a 768pb amplikon az MboII
és Bsal
, ill. 1-10 felelnek meg a különböző emberi biopsziás mintákban; C-, negatív kontroll PCR, az M-100 bp vásárolt Invitrogen. Méretek a DNS-fragmentumok vannak tüntetve a bal vagy a jobb oldalán gél alakja. Katalógusa Statisztikai analízis katalógusa H. pylori katalógusa diagnosztikai teszteket kiszámításával értékeltük érzékenység, specificitás és pontosság foglalkoztató szövettan, mint az arany standard.
Eredmények és megbeszélés katalógusa Ez az első brazil nagyszabású tanulmányt H. pylori katalógusa diagnózis és klaritromicin ellenállást közvetlenül a biopsziás mintákat 1137 egymást követő beteg benyújtott felső gasztroszkópia, több mint négy év alatt, a város a belső São Paulo, Brazília.
Gyomor betegség kimenetele minden beteg bevonásával, ebben a vizsgálatban részt vett a gasztroenterológiai ambulancia Kórház das Clínicas Marilia vizsgálta endoszkópia és szövettani. Endoszkópos leletek peptikus vagy nyombélfekély betegség (PUD) jelen volt a 123 beteg. Különböző fokú krónikus gastritis (CG) figyeltek meg hisztopatológiai 706 olyan beteg és a normál gyomornyálkahártya, a társult vagy nem gastrooesophagealis reflux betegség (GERD) találtak 290 betegeknél. Tizennyolc beteget diagnosztizáltak, adenocarcinoma (15) és MALT lymphoma (3) és kizárták a vizsgálatból. Epidemiológiai elemzés, klinikai eredmények, valamint a H. pylori katalógusa előfordulása ezeket a mintákat a közelmúltban megjelent [43]. Katalógusa kimutatása H. pylori katalógusa végeztünk közvetlenül a biopsziás mintákat három különböző teszt: szövettan, háztartási gyors ureáz teszt és PCR primerekkel Hp23Sr6 /R7, amelyek felerősítik a 768 bp baktérium töredéke a tartomány V. 23S rDNS. Szövettan az aranystandard H. pylori katalógusa diagnosztikai tesztet alkalmazott klinikai rutin, amely együtt szövettani elemzés segítségével eldönteni H. pylori katalógusa eradikációt. A háztartások gyors ureáz teszt azt mutatta, hogy nagyon alacsony pozitív prediktív érték H. pylori okozta gyomor-
betegségek és a magas eltérések képest szövettan; Következésképpen ezek az adatok kizártuk a vizsgálatból (az adatokat nem mutatjuk). A 23S rDNS PCR módszerrel kimutatható H. pylori katalógusa 488 gyomor biopsziás minta, ahol a szövettan pozitív volt 451 biopszia mintákat. Összehasonlító elemzés a PCR assay a Hp23Sr6 /R7 a szövettani vizsgálat érzékenységét, specificitását és pontossága 77,6%, 79,3% és 78,6% volt (1. táblázat). Mivel mindkét teszteket végeztünk egyetlen és a különböző biopszia és a H. pylori
fertőzés bemutatja a fokális jellemző fertőzés [44, 45], pontossága 78,6% elfogadható egy megbízható diagnosztikai tesztet. Meg lehet bizonyítani konzisztenciájú H. pylori katalógusa kimutatás PCR és szövettani alkalmazott CG (53,1%, illetve 52,7% -kal) és a mancs (61,2% és 62,6% -kal) beteg (1. táblázat). PCR kimutatható pylori
12,75% betegeknél normál gyomornyálkahártya míg szövettan pozitív volt csak 0,8% a minták. Ezek az eredmények is magyarázható a sokkal érzékenyebb jellemző a sav nukleinsav alapú módszer. Annak érdekében, hogy a diagnózis a H. pylori katalógusa Egyes szerzők szerint az elemzés a többszörös biopszia [44]. Annak érdekében, hogy erősítse meg a specificitás a PCR fragmentumok kapott amplikonok származó két minta szövettani vizsgálat a H. pylori
pozitív és két minta szövettani vizsgálat a H. pylori
negatív szekvenáltuk. BLASTN elemzése mind a négy biopszia felerősített PCR-fragmentumokat a 23S rDNS H. pylori katalógusa specifikus primerekkel [génbank: KF680642, génbank: KF680643, génbank: KF680644 és génbank: KF680645] kiderült, hogy azonos a 100% a 23S rDNS referens különböző törzsek H. pylori katalógusa. Ennek megfelelően a fejlett PCR assay gyors és pontos, és lehet használni, mint egy gyakorlati módszert kimutatására H.pylori katalógusa infection.Table 1 klinikai kimenetelét és összehasonlítása a H. pylori diagnosztikai módszerek
PUD ( n = 123)
CG (n = 706)
N (n = 290) hotelben
His + Matton törté-
His + Matton His
His + Matton His Matton
T Matton PCR + katalógusa 63 katalógusa 13 katalógusa 76 katalógusa 286 katalógusa 89 katalógusa 375 katalógusa 1 katalógusa 36 katalógusa 37 katalógusa 488 katalógusa PCR katalógusa 14 katalógusa 33 katalógusa 47 katalógusa 86 katalógusa 245 katalógusa 331 katalógusa 1 katalógusa 252 katalógusa 253 katalógusa 631 katalógusa T katalógusa 77 katalógusa 46 katalógusa 123 katalógusa 372 katalógusa 334 katalógusa 706 katalógusa 2

• A differenciálatlan típusú gyomor adenokarcinóma: prognosztikai három szövettani types
• Biztonság és előzetes eredmények a perioperatív kemoterápia és hyperthermiás hasüregbe kemoterápia (HIPEC) magas kockázatú gyomorrák patients