Faible Helicobacter pylori résistance primaire à la clarithromycine dans les échantillons de biopsie gastrique de patients dyspeptiques d'une ville à l'intérieur de São Paulo, Brésil

Faible Helicobacter pylori résistance primaire à la clarithromycine dans les échantillons de biopsie gastrique de patients dyspeptiques d'une ville à l'intérieur de São Paulo, Abstrait
fond du Brésil
clarithromycine, amoxicilline, et un inhibiteur de la pompe à protons sont les médicaments les plus courants recommandé en première ligne triple thérapie pour H.pylori de le traitement, ce qui entraîne des taux d'éradication près de 80%, variant au niveau régional, principalement en raison des cas d'urgence et des augmentations de souches résistantes clarithromycine. substitutions nucléotidiques au domaine V du H. pylori de la fraction 23S ARNr sont impliqués dans la résistance aux macrolides et les A2142G et A2143G mutations sont prédominantes dans les isolats cliniques dans le monde entier, y compris au Brésil. Comme H. pylori culture
est fastidieuse, nous avons étudié l'apparition primaire de A2142G de H. pylori et A2143G ADNr 23S mutations en utilisant une approche moléculaire directement sur les biopsies gastriques des patients dyspeptiques consécutivement assisté à l'Hôpital das Clinicas de Marilia, São Paulo, Brésil.
Méthodes
biopsies obtenues à partir de 1137 patients dyspeptiques, ont été soumis à l'histopathologie et H. pylori diagnostic
par histologie et PCR. PCR dosage /RFLP a été utilisé pour détecter A2142G et du point de A2143G mutations au domaine V de la bactérie H. pylori 23S ADNr
associée à la résistance clarithromycine. Grâce à l'analyse développée, un amplicon PCR 768 pb correspondant to1728 à 2495 pb de la 23S H. pylori
ADNr est limitée avec MboII
pour la détection de la mutation A2142G et Bsal
pour la détection de la mutation A2143G. Occurrence des résultats de A2142G 23S ADNr en deux fragments d'ADN (418 et 350 pb) et des résultats de A2143G 23S ADNr en trois fragments d'ADN (108, 310 et 350pb), en raison d'un site de restriction
Bsal conservée.: Résultats
la méthode PCR utilisée pour diagnostiquer H. pylori
présenté la sensibilité, la spécificité et la précision de 77,6%, 79,3% et 78,6%, respectivement, par rapport à l'histologie, la méthode standard d'or pour H. pylori
diagnostic utilisé dans notre routine. Prévalence de H.pylori
avec des génotypes résistants à la clarithromycine était 2,46%, avec une prédominance de A2143G 23S ADNr mutation ponctuelle. Conclusions de
Le /RFLP PCR était un H.pylori
rapide et précis méthode de diagnostic et la clarithromycine détermination de la résistance utile pour la pratique de routine. La prévalence de la résistance primaire de H. pylori
à la clarithromycine en raison de A2142G et des mutations A2143G reste faible dans Marilia, la clarithromycine standard contenant une triple thérapie est toujours valide.
Mots-clés
Helicobacter pylori
clarithromycine résistance Helicobacter les maladies 23S ADNr gastriques de pylori acides nucléiques Contexte diagnostic
Il est largement admis que Helicobacter pylori
, une bactérie microaerophylic Gram négatif, est impliqué dans plusieurs affections des voies digestives cliniques telles que la gastrite chronique, ulcères peptiques et duodénaux , le cancer gastrique et troubles lymphoprolifératifs [1]. Le traitement de H. pylori de résultats d'infection dans la cicatrisation des ulcères et une réduction du risque de cancer gastrique et le lymphome [2, 3]. Une fois que la
H. pylori bactérie
est détectée dans la muqueuse gastrique altérée, le traitement indiqué est constitué d'un traitement antibiotique triple comprenant methronidazol, la clarithromycine, l'amoxicilline, le tinidazole, la tetracycline et les fluoroquinolones sont associés avec un inhibiteur de pompe à protons tels que l'oméprazole, le lansoprazole ou le pantoprazole [4-6]. H. pylori de taux d'éradication avec un certain nombre d'agents combinés et les régimes sont près de 80% [7-9], variant d'un pays à l'échelle régionale et, dans les pays [10]. Plusieurs facteurs contribuent à ce taux de guérison de H. pylori, y compris l'inefficacité de la pénétration des antibiotiques dans la muqueuse gastrique, l'inactivation de l'antibiotique par la sécrétion acide de l'estomac [11], l'absence de l'observance du patient [12] faible et principalement, les cas d'urgence et l'augmentation des souches résistantes aux antibiotiques
H. pylori [13]. Ainsi, la surveillance de la résistance de H. pylori régionale est d'une grande importance pour les stratégies de test et de traitement.
Au Brésil, un pays aux dimensions continentales, la majorité des cliniciens praticiens emploient la trithérapie classique composée de clarithromycine, amoxicilline et un inhibiteur de la pompe à protons pendant sept jours comme traitement de première ligne pour surmonter l'infection de H. pylori [5, 14]. Ce schéma a été prouvé pour devenir inefficace dans le monde entier, principalement en raison de l'apparition et de l'augmentation des souches de H. pylori résistant à la clarithromycine, ce qui réduit l'efficacité de 55% de traitement de bactérie à 100% [15-18]. Parmi les localités brésiliennes, H. pylori de résistance à la clarithromycine présente une prévalence élevée, variant de 7 à 16% chez les adultes [19-22] et 27% chez les enfants [23]. En conséquence, compte tenu de l'importance clinique de la résistance primaire H. pylori
à la clarithromycine, sa prévalence devrait être envisagée avant de choisir les schémas d'éradication [24]. Es Détermination de H. pylory in vitro
sensibilité aux antibiotiques peut être effectuée par des techniques classiques telles que la diffusion de la gélose, les méthodes de dilution d'agar-agar et le bouillon microdilution et le E-test. Toutefois, en raison de la croissance lente et les exigences particulières de la culture H.pylori de cette approche est pas fiable pour une utilisation dans la plupart des laboratoires cliniques de routine, principalement dans les pays en développement. Par conséquent, les tests moléculaires ciblant la résistance associée aux mutations du gène de H. pylori directement à partir de biopsies gastriques ont le potentiel pour une utilisation dans des études à grande échelle [25-29].
Le mécanisme moléculaire impliqué dans la résistance clarithromycine se compose de mutations dans le séquence du domaine V de la bactérie H. pylori de la fraction 23S ARNr qui est impliquée dans le site de liaison ribosomique peptiltransferase empêchant la ligature du macrolide à l'ARNr [30]. Les grandes mutations ponctuelles caractérisées sont A à G aux positions 2142 et 2143, A à C à 2142 [31-33], A à T au 2144 [34], T à C à 2717 [35] et C à A à 2694 [ ,,,0],36]. Les A2142G et A2143G mutations sont prédominantes dans les isolats cliniques dans le monde entier, y compris au Brésil [21, 37-40]. Ainsi, afin d'effectuer une enquête à grande échelle de résistance primaire clarithromycine directement à partir de biopsies de 1137 patients ont participé à l'Hôpital das Clínicas de Marilia, une ville à l'intérieur de São Paulo, au Brésil, nous avons développé une réaction en chaîne par polymérase associée à la restriction longueur des fragments polymorphisme (PCR-RFLP) pour détecter les A2142G et A2143G nucléotidiques substitutions au domaine V de 23S ADNr de H. pylori
. Méthodes
1137 patients adultes de résident de patients dans Marilia ville, État de São Paulo du Brésil, âgés de 19 à 91 ans, qui avait esophagogastroduodenoscopy consécutivement subi (EGD) pour la douleur abdominale supérieure ou symptômes dyspeptiques de Février 2003 à Décembre 2006 à la clinique gastro-entérologie ambulatoire des Hospital das Clinicas de l'école de médecine Marília, étaient inscrits dans cette étude d'endoscopie et des biopsies de.
Le EGD a été accompli par fibroendoscope (GIF-XP20, GIF-XQ20) ou vidéo-endoscope (GIF-100) à la fois de l'Olympe, Shinjuku-ku, Tokyo, Japon. ulcère gastrique ou duodénal de diagnostic a été défini par l'endoscopie et deux fragments du sinus maxillaire ont été collectés pour effectuer l'uréase rapide et des tests histopathologiques. La biopsie utilisée pour le test rapide à l'uréase a encore été soumis à l'extraction d'ADN. Le protocole utilisé est en accord avec la Déclaration d'Helsinki et a été approuvé par le Comité d'éthique en recherche chez l'humain de l'école de médecine Marilia, sous le numéro de référence 388/01. Dans le comité d'éthique a approuvé le protocole de recherche d'un consentement éclairé de chaque patient inclus dans cette étude a été levée que tous les échantillons de biopsie gastrique analysés étaient les mêmes biopsies utilisées en routine pour l'uréase test rapide dans le cadre du service gastro-entérologie ambulatoire de l'Hospital das Clinicas de Marilia Medical School et donc, aucune intervention spécifique au patient était nécessaire pour l'inscription dans cette étude proposée. En conséquence, la renonciation au consentement éclairé n'a pas porté atteinte aux droits et le bien-être des sujets inclus dans cette recherche, ainsi que la confidentialité de l'identité des patients a été garantie de. Histologie
Un spécimen antraux a été fixé dans une solution de formol à 10% et inclus dans de la paraffine. Les sections ont été colorées au Giemsa pour H. pylori
évaluation et ont été colorées avec l'hématoxyline et de l'éosine pour l'évaluation des modifications histopathologiques [41].
Réaction en chaîne par polymérase, une restriction et une analyse de séquençage The même biopsie utilisée pour l'uréase rapide test a été soumis à une extraction d'ADN avec l'emploi du kit d'extraction d'ADN GFx acheté chez Amersham /Pharmacia Biotech, suivant les instructions du fabricant. L'ADN a été quantifié en électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant le Invitrogen, Grand Island, New York, États-Unis, à faible échelle de masse et 50-100ug de l'ADN total ont été utilisés dans les réactions de PCR avec les oligonucléotides: Hp23Sr6 sens (5 'CACACAGGTAGATGAGATGAGTA3') et Hp23Sr7 antisens (CACACAGAACCACCGGATCACTA3 ') qui amplifie un fragment de 768pb correspondant au domaine V de la bactérie H. pylori
23S ADNr (figure 1). Pour surmonter les problèmes de vaste polymorphisme génétique pour la détection PCR précise de H.pylori
, la construction d'oligonucléotides a été réalisée après une analyse comparative de la 23S ADNr de H.pylori
et organismes connexes disponibles à Genebank sur le logiciel MegAlign Lasergene . état de PCR était de 94 ° C, 5 ', suivi par 40 cycles de 94 ° C 30 "60 ° C /30" /72 ° C 30 "et un cycle à 72 ° C 7', avec un volume total de 25 pi contenant 1 × un tampon de PCR, 200 uM dNTP, 2,0 mM MgCl 2, 1 uM de chaque oligonucleotide, 1,25 U Taq DNA polymérase Platinum Brésil (Invitrogen). Dans toutes les réactions PCR négatif et un contrôle positif ont été utilisés correspondant à, respectivement, de l'eau stérile et des biopsies gastriques positives H. pylori
PCR. Les fragments amplifiés ont été digérés avec MboII
et Bsal
(New England Biolabs). Ces enzymes distinguent des mutations dans le domaine V du H. pylori du 23S ADNr au niveau des positions 2142 et 2143, respectivement. En présence de la mutation A2142G les fragments d'ADN de restriction qui en résultent sont de 418 pb et 350 pb, et en présence de la mutation A2143G les fragments résultants sont de 108, 310 e 350 pb. En tant que témoin de la digestion de MboII nous avons utilisé un fragment amplifié par PCR d'ADN de 601 pb correspondant au gène majeur
chitinase Leishmania qui contient un site de restriction pour MboII
. Le site de restriction d'un conservée Bsal à l'amplicon de PCR 768 pb est le témoin positif pour la digestion avec cette enzyme produisant des fragments d'ADN de 108 et 660 pb, en l'absence de la mutation A2143G. Les produits de PCR des réactions et des analyses de restriction ont été résolus dans 1,5% des gels d'agarose, colorés avec du bromure d'éthidium et photographié sous lumière UV. 23S ADNr 768 amplicons pb PCR de quatre biopsies gastriques (deux positifs et deux négatifs pour H. pylori
test histologique) avec MboII sensibles clarithromycine
et le motif de restriction de Bsal, et à partir de dix biopsies gastriques avec MboII résistants à la clarytromycin
(trois échantillons) et (sept échantillons) les motifs de restriction de BsaI ont été soumis à un séquençage avec DyeTM Terminator Sequencing cycle v3.0 kit Ready Reaction et une machine ABI-3100 acheté chez Applied Biosystems, selon les instructions du fabricant. détermination de la séquence nucléotidique a été réalisée en double et une analyse comparative a été réalisée par un alignement nucléotidique BLAST de base [42]. Figure 1 Diagnostic moléculaire de Helicobacter pylori par la détection par PCR et RLFP du domaine V des mutations 23S A2142G et A2143G responsable de la résistance à la clarithromycine. A. Représentation de 23S de H. pylori gène codant (Genbank: HPU27270), la position des amorces utilisées pour la PCR et de l'A2142 et A2143 de la fraction V de la 23S ADNr, la taille des fragments obtenus avec les enzymes de restriction Bsal et MboII
dans des fragments de PCR contenant les mutations A2142G et A2143G et interne Bsal de site de l'amplicon de 768 pb de restriction, sont indiquées. Gel B, C et D. agarose coloré avec du bromure d'éthidium contenant une analyse diagnostique par PCR, l'analyse de restriction de l'amplicon 768pb avec MboII hôtels et Bsal
, respectivement. 1-10 correspondent à différents échantillons de biopsie humaine; C-, contrôle négatif de la PCR, M-100 pb échelle acheté chez Invitrogen. Tailles des fragments d'ADN sont indiqués sur la gauche ou la droite de chaque figure de gel.
Analyse statistique
H. pylori
tests de diagnostic ont été évalués en calculant la sensibilité, la spécificité et la précision histologie en utilisant comme l'étalon-or.
Résultats et discussion
Ceci est la première étude brésilienne à grande échelle sur H. pylori
diagnostic et résistance à la clarithromycine directement à partir de biopsies de 1137 patients consécutifs soumis à une gastroscopie supérieure, sur une période de quatre ans, dans une ville l'intérieur de São Paulo, Brésil.
gastrique issue de la maladie de tous les patients inscrits dans cette étude ont assisté à la clinique gastro-entérologie ambulatoire de l'Hôpital das Clínicas de Marília a été étudiée par endoscopie et l'histopathologie. trouvailles endoscopiques de la maladie de l'ulcère peptique ou duodénal (PUD) était présent dans 123 patients. Différents degrés de gastrite chronique (CG) ont été observées par histopathologie dans 706 patients et de la muqueuse gastrique normale, associée ou non à la maladie de reflux gastro-œsophagien (RGO) a été trouvée dans 290 patients. Dix-huit patients ont été diagnostiqués comme ayant un adénocarcinome (15) et lymphome du MALT (3) et ont été exclus de l'étude. . L'analyse épidémiologique, les résultats cliniques et H. pylori
prévalence de ces échantillons ont été récemment publiée [43] de détection de H. pylori
a été effectuée directement à partir des échantillons de biopsie par trois tests différents: histologie, un ménage rapide test de l'uréase et la PCR avec les amorces Hp23Sr6 /r7 qui amplifient un fragment d'une bactérie 768 pb du domaine V de l'ADNr 23S. L'histologie est le test de diagnostic standard d'or H.pylori
employé dans notre routine clinique qui, avec l'analyse histopathologique est utilisé pour décider H. pylori de la thérapie d'éradication. Le test ménage uréase rapide a montré une valeur prédictive positive très faible pour H. pylori Associées maladies gastriques et une grande différence par rapport à l'histologie; Par conséquent, ces données ont été exclus de l'étude (données non présentées). La méthode 23S ADNr PCR détectée H. pylori
dans 488 biopsies gastriques spécimens où histologie a été positif pour 451 biopsies échantillons. Analyse comparative du test PCR réalisée avec le Hp23Sr6 /r7 avec histologie a montré une sensibilité, la spécificité et la précision de 77,6%, 79,3% et 78,6%, respectivement (tableau 1). Comme les deux tests ont été effectués sur une biopsie unique et différent et H. pylori
infection présente une caractéristique focale de l'infection [44, 45], la précision de 78,6% est acceptable pour un test de diagnostic fiable. Il peut être démontré par la consistance de la détection du H.pylori par PCR et histologie utilisé dans CG (53,1% et 52,7%, respectivement) et de l'ulcère gastroduodénal (61,2% et 62,6%, respectivement) les patients (tableau 1). PCR détectée H.pylori
à 12,75% chez les patients avec une muqueuse gastrique normale tandis que l'histologie a été positif pour seulement 0,8% des échantillons. Ces résultats peuvent être expliqués par la caractéristique plus sensible de la méthode à base d'acide nucléique. Afin d'améliorer le diagnostic de H.pylori
certains auteurs suggèrent l'analyse de biopsies multiples [44]. Afin de confirmer la spécificité des fragments PCR obtenus, amplicons à partir de deux échantillons avec un test histologique pour les échantillons positifs et deux de H. pylori avec le test histologique pour H. pylori
négatifs ont été séquencés. analyse BLASTN de tous les fragments PCR amplifiés quatre biopsies avec des amorces spécifiques de la 23S ADNr H. pylori [Genbank: KF680642, Genbank: KF680643, Genbank: KF680644 et Genbank: KF680645] identité révélée de 100% avec le référent 23S ADNr à différents souches de H. pylori
. Par conséquent, le test de PCR développé est rapide et précise et peut être utilisé comme une méthode pratique pour la détection de infection.Table 1 Les résultats cliniques de H. pylori et la comparaison de H. pylori méthodes diagnostiques
PUD ( n = 123)
CG (n = 706)
N (n = 290)

Son +
His-
Son +
His-
Son +
His-

T
PCR +
63
13
76
286
89
375 1
36
37
488
PCR-
14
33
47
86
245
331 1
252
253
631
T
77
46
123
372
334
706 2
288
290
1119
gastrite chronique de CG, PUD de la maladie de l'ulcère gastro-duodénal, N muqueuse gastrique normale associée ou non à la maladie de reflux gastro-œsophagien (RGO), PCR
réaction en chaîne par polymérase, Son
histologie.
traitement antibiotique des maladies gastriques est recommandé lorsque le diagnostic de H. pylori est positif et le traitement d'éradication classique bactérie composée de clarithromycine, amoxicilline et un inhibiteur de la pompe à protons est prescrit. La thérapie choisie présente un échec élevé du taux d'éradication de H. pylori dans les zones où la résistance à la clarithromycine est supérieure à 15%, probablement en réponse à l'utilisation généralisée de cet antibiotique pour une infection des voies respiratoires, en particulier chez les enfants [9]. résistance primaire globale de H. pylori
aux gammes clarithromycine de 1 à 29% [46]. Au Brésil, plusieurs études ont rapporté une prévalence clarithromycine de résistance de 7-16% chez les adultes [19, 20, 22, 47] et 27% chez les enfants [23]. Ainsi, afin d'améliorer le choix empirique de maladie associée à la thérapie de H.pylori, nous avons étudié le taux régional de résistance à la clarithromycine de H.pylori grâce à la détection de mutations ponctuelles liées majeur, A2142G et A2143G au domaine V de 23S ADNr de la bactérie H. pylori.
Ainsi, tous les 488 échantillons positifs H.pylori
PCR ont été analysés par RFLP du fragment de PCR de 768 pb obtenu avec des amorces Hp23Sr6 /7 avec les enzymes de restriction MboII
et Bsal
, avec détection des mutations A2142G et A2143G au domaine V de 23S ADNr de H. pylori, respectivement (figure 1). Seuls 12 échantillons (2,46%) ont montré le motif de restriction muté, trois (25%) hébergeant A2142G mutation, sept (58,3%) A2143G et un échantillon (8,7%) ont montré les deux points ADNr 23S mutations dans les PCR ADNr fragment 768 pb. Un échantillon a montré une digestion partielle avec l'enzyme MboII
(figure 1). Les mutations ponctuelles A2142G et A2143G des amplicons obtenus à partir de trois [Genbank: KF680646 Genbank: KF680647 et GenBank: KF680647] et sept [GenBank: 680649, Genbank: 680650, Genbank: 680651, Genbank: 680652, Genbank: 680653, Genbank: et GenBank 680654: 680655] différents échantillons des biopsies, respectivement, ont été confirmées par séquençage. Il n'y avait pas d'association de clarithromycine points de résistance des mutations de H. pylori avec l'âge ou le sexe (données non présentées) des patients.
La prévalence de H. pylori
clarithromycine résistance trouvée dans notre région a été similaire à celle trouvée dans les pays développés comme l'Italie et l'Allemagne [7] et dans le pays en développement Amérique du Sud Paraguay [48]. Ces résultats confirment la variabilité régionale élevé de résistance aux antibiotiques de H. pylori et malgré la résistance croissante de la clarithromycine dans le monde entier, en Marilia, un faible taux de résistance a été maintenue au cours de la période de quatre ans. En outre, la PCR /RFLP est un procédé rapide et précis pour la détection de la résistance à la clarithromycine par une mutation du gène directement dans des échantillons de biospsy gastriques et peut être utilisé conjointement avec l'histologie pour décider de la prescription de clarithromycine contenant de la thérapie schéma thérapeutique.
H. 23S ARNr domaine V A2142G et A2143G points de mutations de pylori sont les principales mutations trouvées dans H. pylori
isolats cliniques résistants à la clarithromycine. Nous avons trouvé une prévalence plus élevée de A2143G par rapport à la mutation A2142G dans nos échantillons qui est en accord avec la majorité des études brésiliennes, y compris les Etats de Minas Gerais, São Paulo et Recife [20, 34, 36]. A2143G mais pas A2142G mutation ponctuelle montre un effet synergique de la clarithromycine et l'amoxicilline, qui ont été utilisés ensemble dans la première ligne H. pylori
régime [49], ce qui renforce la nécessité d'enquêter sur cette clarithromycine 23S ADNr mutation ponctuelle avant le traitement. Un échantillon abritait les deux A2142G et A2143G mutations dans le domaine V de 23S ADNr de H. pylori qui a également été trouvé dans trois H.pylori
isolats obtenus à partir de patients de l'Etat brésilien de Minas Gerais [20]. Ces résultats ainsi que l'apparition de la digestion partielle d'un fragment 768 pb 23S ADNr PCR (Figure 1) peut être indicative de la colonisation de l'estomac de plusieurs souches de H. pylori
[50].
Dans le Minas Gerais, au Brésil, résistance à la clarithromycine est passé de 4,48% en 1996 à 19,05% en 2000 [20], probablement en raison de l'utilisation de macrolides dans le traitement d'autres maladies infectieuses. On n'a pas trouvé de différence significative dans les échantillons résistant à la clarithromycine, selon la période de l'étude (données non présentées). Ces données indiquent que dans notre région la prescription et l'utilisation des macrolides ne sont pas effectués sur une échelle élevée. D'autres études sont nécessaires pour confirmer cette hypothèse.
Résistance à la clarithromycine réduit l'efficacité clinique de triple thérapie à base de clarithromycine. Cependant, la prévalence de la résistance primaire de H. pylori
à la clarithromycine en raison des ADNr 23S A2142G et A2143G nucléotidiques substitutions reste faible dans Marilia, la clarithromycine standard contenant une triple thérapie est toujours valide comme traitement le plus efficace de première ligne empirique éradication pour H. pylori
infection.
Conclusions
le test PCR développé ciblée du gène 23S ADNr de H. pylori
est rapide et précise et peut être utilisé comme une méthode pratique pour la détection de H .pylori de l'infection directement sur des échantillons de biopsie gastrique. En outre, le fragment de PCR 23S ADNr de la bactérie H. pylori obtenu peut être utilisé pour détecter des mutations ponctuelles 1728-2495 pb du domaine V H. pylori 23S ADNr
associée à la résistance à la clarithromycine. La prévalence de la résistance primaire de H. pylori
à la clarithromycine en raison de 23S ADNr A2142G et A2143G nucléotidiques substitutions reste faible dans Marilia, ainsi la clarithromycine standard contenant une triple thérapie est toujours valide comme traitement de première intention d'éradication la plus efficace empirique pour H. pylori de l'infection
abréviations
PUD:.
maladie ulcéreuse peptique
CG: gastrite chronique

RGO:
maladie de reflux gastro-œsophagien
PCR:
réaction en chaîne par polymérase
RFLP:
Restriction fragment Length Polymorphism.
Déclarations de REMERCIEMENTS
Nous sommes reconnaissants au Dr Adriana Augusta Pimenta de Barros pour ses soins à tous les patients inclus dans l'étude et à Alex Gusmão da Silva pour sa contribution dans la réalisation de l'analyse statistique. Ce travail a été soutenu par la Fundação de Amparo un Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Subventions de recherche 03 /01223-0, 08 /01394-4; Bourses RABL 2008 /01395-0, GACL 2005 /02482-6, THH 2003 /03675-7.
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Voici les liens vers les auteurs originaux soumis les fichiers pour les images. 12876_2013_1025_MOESM1_ESM.pdf Auteurs fichier d'origine pour la figure 1 Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt concurrent.
Auteurs des contributions
RBS effectué le traitement des échantillons, des études moléculaires, interprétation des données et participé au projet du manuscrit. RABL, GACL et THH effectué les études moléculaires et ont contribué à l'acquisition et l'interprétation des données moléculaires; MAS a conçu les expériences, a contribué à l'analyse des données et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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