Karakterisering av humant gastric carcinoma relaterade metylering av 9 miR CpG-öar och förtryck av deras uttryck in vitro och in vivo

Karakterisering av humant gastric carcinoma relaterade metylering av 9 miR
CpG-öar och förtryck av deras uttryck i och in vivo
abstrakt
Bakgrund
Många Mir
gener är vitro
beläget inom eller runt CpG-öar. Det är oklart om metylering av dessa CpG-öar undertrycker miR
transkription regelbundet. Syftet med denna studie är att karakterisera magcancer (GC) -relaterade metylering av miR
CpG-öar och dess relation med miRNA uttryck.
Metoder
metylering status 9 representant miR sälja CpG-öar i en panel av cellinjer och humana gastriska prover (inklusive 13 normala biopsier, 38 gastrit biopsier, 112 par GC och deras kirurgiska marginal prover) analyserades med bisulfit-DHPLC och sekvensering. Mogna miRNA-nivåer bestämdes med kvantitativ RT-PCR. Relationer mellan miR sälja metylering, transkription, GC utveckling, och kliniskt patologiska egenskaper analyserades statistiskt.
Resultat
metylering frekvensen 5 miR
CpG-öar (MIR-9-1
, MIR-9 -3
, mIR-137
, mIR-34b
, och mIR-210
) gradvis ökat medan andelen metylerat mIR-200b
gradvis minskade under gastric cancer (Ps
< 0,01). Mer miR-9-1
metylering detekterades i 62% -64% av de GC prover och 4% av de normala eller gastrit prover (18/28 kontra 2/48; Odds ratio, 41,4; P
< 0,01). MIR-210
metylering visade hög korrelation med H. pylori
infektion. MIR-375
, miR-203
, och MIR-193b
metylering kan vara värd anpassning till utvecklingen av GC. Metylering av dessa Mir
CpG-öar konsekvent visat sig signifikant minska motsvarande miRNA nivåer som presenteras i humana cellinjer. Det omvända förhållandet observerades också för MIR-9-1
, MIR-9-3
, MIR-137
, och MIR-200b
i mag prover. Bland 112 GC patienter MIR-9-1
metylering var en oberoende gynnsam prediktor för total överlevnad av GC patienter i både univariata och multivariat analys (P Hotel < 0,02).
Slutsatser
Avslutningsvis , förändring av metylering status 6 av 9 testade miR
CpG-öar präglades av gastric cancer. MIR-210
metylering korrelerade med H. pylori
infektion. MIR-9-1
metylering kan vara en GC-specifik händelse. Metylering av miR
CpG-öar kan signifikant nedreglera deras transkription regelbundet.
Bakgrund
miRNA är en riklig klass av små icke-kodande RNA som främst reglerar genuttrycket vid posttranskriptionsnivå. De spelar avgörande roller i förnyelse och differentiering av stamceller och bidra till att upprätthålla cellinjer. Tidigare forskning har visat att i cancer flera av Mir
gener såsom MIR-200b /200A /429
, MIR-21
, MIR-30b
, MIR-30d
, Mir -31
, och MIR-423
uppregleras, medan andra Mir
gener som miR-143 Mössor och MIR-145
är nedregleras [1-3]. Uppgifter tyder på att förändringar i miRNA uttryck förekommer ofta i många cancerformer och dessa variationer antingen bidra till cancer eller spegla utvecklingen och utvecklingen av cancer.
Det finns ett antal vägar som kan påverka mogna miRNA nivåer i celler och vävnader, såsom genamplifiering eller radering, transkriptions uppreglering eller nedreglering, post-transkriptionell bearbetning och miRNA nedbrytning [4-7]. Det är väl känt att en del intragenic miR
gener, såsom miR-218-2
, är koordinerat transkriberas med sina värdgener genom mekanismer för samreglering [8]. Men många mir
gener är extragenisk och en viss andel av intragenic miR
gener såsom miR-9-1
transkriberas i en värdgen oberoende mönster [9]. Eftersom den exakta promotorregionen hos de flesta Mir
gener inte karakteriseras, särskilt när det gäller de extragenisk Mir
gener, de exakta regler hos miR
transkription är långt ifrån klart metylering eller hypermetylering av.
CpG-öar i regionen av transkriptionsutgångs platser (TSS) är allmänt erkänt att undertrycka gentranskription epigenetiskt. Till skillnad från proteinkodande gener som kan sträcker sig över flera CpG-öar, den miR
gener kan vara kortare än en CpG-ö, och i vissa fall, multipel miR
gener (dvs en miR
genkluster) kan vara ligger inom eller flankerar en enda CpG-ö (Ytterligare fil 1: Tabell S1). Aberrant metylering av CpG-öar associerade med miR
gener, såsom let-7a-3
och miR-34a
, observeras ofta i många cancerformer [10, 11]. Det har föreslagits att metylering av CpG-öar som är associerade med MIR
gener (dvs. miR-203
, miR-152
, miR-124-1
, miR-34b /c
mIR-129-2
, mIR-9-1
, mIR-130b
, mIR-124-2
, och mIR-181c
) kan omvänt korrelerar med deras uttrycksnivåer [12-17]. Dock är huruvida transkription av Mir
gener regelbundet påverkas av metylering status Mir
CpG-öar har inte system studerats.
Det är väl känt att onormal metylering eller demetylering av CpG-öar i en liten andel (mindre än 1%) av cellpopulationen kan finkänsligt detekteras i cellulära heterozygota vävnadsprover. Detta demonstrerar fördelen med metyleringsanalys över förändringar av genuttryck på RNA och proteinnivåer som endast kan detekteras när en sådan förändring är närvarande i en stor andel av en cellpopulation i ett prov [18]. Vår bioinformatisk analys visar 50, 9, och 70 av 721 humana Mir
gener i miRbase (Release 14.0) är belägna, respektive, inom, flankerande, och i närheten av CpG-öar (kollektivt vi kommer att hänvisa till dessa som miR
CpG-öar, ytterligare fil 1: Tabell S1). Vår hypotes är att avvikande metylering av Mir
CpG-öar kan uppstå under utveckling och progression av cancer. Därför kan de användas som kandidatgener inte bara för att förutsäga cancer prognos, men också för undersökning av metylering uttryck association in vivo
. Således, CpG-öar 9 sjukdomsrelaterade mir
gener, inklusive fem extragenisk Mir
gener eller genkluster (MIR-9-3
Mir-137
, MIR-200b /200a /429
, mIR-203
, och mIR-375
) och 4 intragenic gener eller genkluster (mIR-9-1
, mIR-34b /c
, mIR-193B /365 -1
, och mIR-210
), valdes som representativa gener i den aktuella studien (Ytterligare fil 1: Tabell S1). Metylering uttryck förening för tre av dessa Mir
gener har inte tidigare fastställts (Ytterligare fil 1: Tabell S2) [12, 14, 19-27]. Vi ursprungligen screenas för magcancer (GC) - eller värdrelaterade avvikande miR
metylering och sedan undersökte metylering uttryck förening in vitro och sälja in vivo
. Associationer mellan kliniskt patologiska egenskaper hos GC patienter och metylering av dessa miR
CpG-öar analyserades också
Metoder
cellinje källor och cellkultur
Källinformation av använda cellinjer som användes i denna studie:. RKO cell linje, som tillhandahålls av Dr. Guoren Deng vid University of California i San Francisco; SW480 och HCT116 tillhandahölls av Dr. Yuanjia Chen vid Peking Union Medical College Hospital, MKN74 och 293 T från Tokyo Medical and Dental University; PC-3 köptes från Cell Bank vid Chinese Academy of Medical Science, HL60 och KG 1 a erhölls från hematologi Institutionen för Peking University första sjukhuset; DU145 erhölls från Hanmi Pharmacy Company; Siha tillhandahölls av Pekings universitet folkets sjukhus. HepG2 tillhandahölls av Dr. Qingyun Zhang, Calu3 och A549 av Dr Zhiqian Zhang, H1299 och AGS av Dr Chengchao Shou, MKN45 av Dr Youyong Lv, och andra cellinjer (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa och GES-1) av Dr Yang Ke, alla vid Pekings universitet cancersjukhus /Institute. Dessa cellinjer odlades vid 37 ° C i 5% CO 2, med användning av olika odlingsmedier. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG 1 a, A549, H1299, GES-1, HepG2, 293 T, DU145, och RKO odlades i 90% RPMI-1640 och 10% FBS. PC-3 och AGS odlades i 90% F-12 och 10% FBS. Calu3, HeLa och Siha odlades i 90% DMEM och 10% FBS. SW480 och HCT116 odlades i 90% DMEM: RPMI-1640 (1: 1). Och 10% FBS
Patienter och vävnadsprover
Kirurgiska primära GC prover och deras parade icke-cancerösa kirurgisk marginal (SM) prover var samlats in från 112 inneliggande patienter (medelålder 59,2 år [intervall, 32-79], 80 män och 32 kvinnor, 78 icke-kardiell GCS och 34 hjärt GC, 40 GC i pTNM steg i ~ II och 59 på steg III ~ IV) vid Pekings universitet Cancer Hospital. Uppföljningsdata för alla patienter samlades i minst fem år. Alla kliniska prover, samt histopatologiska och uppföljning uppgifter för varje fall erhölls enligt godkända institutionens riktlinjer. Gastric biopsier från 13 friska försökspersoner och 38 gastrit öppenvård som samlats in från samma sjukhus användes som icke-cancerpatient kontroller. Före bisulfit modifiering varje patients mag genomiskt DNA-prov analyserades med avseende på närvaro av H. pylori
-specifika 23 S rDNA
genom en PCR-analys såsom beskrivits tidigare [28]. De institutionella prövningsnämnder i Peking University Cancer Hospital och Institutet godkände studien (É1041207), och alla patienter gav skriftligt informerat samtycke.
DNA-extraktion och bisulfit modifiering
cancer cellinje och vävnadsprov genomiskt DNA (1,8 mikrogram) isolerades med användning av fenol /kloroform-extraktion [29]. De ometylerade cytosin rester i DNA-proven omvandlades till uracilrester (blir tymidin rester i PCR-produkter) genom tillsats av 5 M natriumbisulfit [30]. Den Wizard® DNA Clean-Up System Kit (Promega) användes för att rena det bisulfit-behandlade DNA före PCR-amplifiering.
PCR-amplifiering och kvantifiering av miR
CpG-ö metylering genom DHPLC
CpG fria universella primern uppsättningar användes för att förstärka miR
CpG-öar från varmstart PCR-polymeras (Ytterligare fil 1: Figur S1 och ytterligare fil 1: Tabell S3). Sekvenser av CpG-öar inbäddade eller flankerad dessa relaterade Mir
gener användes för att utforma primers. PCR-produkterna analyserades sedan kvantitativt genom DHPLC på WAVE® DNA Fragment Analysis System [31]. Elueringsprofilerna för MIR-9-3
, MIR-200b
, och MIR-203
metylering analyserades med en UV-detektor; andra miR
gen metylering detekterades med posten kolumnen HSX-3500 tillbehör (Transgenomic, Inc., Omaha, USA) och en högkänslig fluorescens (FL) detektor (excitation vid 450 nm, emission vid 520 nm) [32 ]. Metylerade och ometylerade MIR
gen PCR-produkterna separerades genom ett DNASep® analytisk kolonn (Transgenomic) vid motsvarande partiell denatureringstemperaturen (Ytterligare fil 1: Tabell S3 och Figur S2-10). Toppareorna som motsvarar de metylerade och ometylerade PCR-produkter användes för att beräkna andelen metylerat miR
CpG-ö [andelen metylerade kopior = metylering-topp område /totala topparean] som tidigare beskrivits [33]. M.SssI-
metylerat genomiskt DNA från blodprover användes som en positiv kontroll. Figur 1 DHPLC kromatogram och bisulfit sekvensering av 7 miR CpG-öar i representativa cellinjer och gastriska vävnadsprover. Både perifert blod DNA (BLOD) humant och dess M.Sss
I-metylerade produkter (M.BLOOD) användes som kontroller. Alla CpG platser i amplicon varje miR
CpG-ö också anges ovan resultaten av bisulfit sekvensering. Varje rad representerar en klon; varje rosa stapel representerar en metylerad CpG plats. Den motsvarande kromatogram av varje sekvens prov (högra kolumnen) visas (vänster kolumn).
Bisulfit klon-sekvense
Fresh PCR-produkter av miR
CpG-öar amplifierade med de CpG-fria universella primeruppsättningar klonades med pGEM-T Easy kit (Promega, Madison, USA) och sekvenserades med en Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer på SinoGeneMox Company (Beijing, Kina).
Utvinning av RNA och detektion av mogna miRNA nivå med kvantitativa RT-PCR-analyser
Totalt 50 ng RNA extraherades från färska vävnadsprover eller cellinjer med hjälp av TRIzol-reagens (Life Technologies, Carlsbad, USA) enligt tillverkarens protokoll. Motsvarande cDNA-prover syntetiserades med användning av TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) med miR
-specifika stam-ögla invers transkription (RT) primrar (specifik för MIR-375
# RT000564, miR-34b
# RT000427, mIR-137
# RT000593, och mIR-9
# RT000583). RT betingelser som användes var 16 ° C under 30 min ➔ 42 ° C under 30 minuter ➔ 85 ° C under 5 min. De miRNA nivåerna analyserades sedan med användning av en TaqMan Gene Expression Master Mix kit (Life Technologies) med den motsvarande sonden och primers (Life Technologies, miR-375
# TM000564, miR-34b
# TM000427, miR-137
# TM000593, och mIR-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # RT001093 och # TM001093) användes som den interna referensen. PCR-cykelbetingelserna var 95 ° C under 10 min ➔ följt av 40 cykler av 95 ° C under 20 sek ➔ 60 ° C under 1 min. Expressionsnivåer av MIR-200b
och miR-210
bestämdes med användning av en standard polyA RT-PCR-analysen. Sekvenser av RT adapter primer, den universella omvända primern och U6
primer i den vanliga polyA RT-PCR-analys visas i kompletterande fil 1: Tabell S5. RT Betingelserna var 55 ° C under 5 min ➔ följt av 25 ° C under 10 min ➔ 42 ° C under 1 h ➔ och 70 ° C under 5 min. PCR-cykelbetingelserna var 95 ° C for10min ➔ följt av 40 cykler av 95 ° C under 20 sek ➔ och 61 ° C under 1 min.
Statistisk analys
SPSS 16,0 Trend
-test och Pearsons Chi- kvadrat-test användes för att analysera miR
metylering frekvensskillnaden mellan normala biopsier, gastrit lesioner, GC och SM prover. Kruskal-Wallis H
-test och One-Way ANOVA användes för att analysera Mir
metylering andel skillnader mellan normala biopsier, gastrit skador, GC och SM prover. Fishers exakta test, Pearsons Chi-kvadrat-test, och Trend
-test användes för att analysera sambandet mellan miR
metylering positiva värden och kliniskt patologiska egenskaper. Mann-Whitney U
-test och Students t
-test användes för att analysera sambandet mellan andelen metylerade Mir
alleler och kliniskt patologiska funktioner. Kaplan-Meier och Cox-proportional hazards metoder användes för univariata och multivariat analys för att jämföra total överlevnad av GC patienter med skillnader i metylering status miR sälja CpG-öar. Alla statistiska test var tvåsidiga och P Hotel < 0,05 ansågs statistiskt signifikant.
Resultat
Karakterisering av metylering eller demetylering av 6 miR
CpG-öar i samband med utvecklingen av GC
Vi amplifierade bisulfit behandlade mallar av nio representativa miR
CpG-öar med CpG-fria primers och utvecklade 9 DHPLC analyser för att analysera metylering status CpG-öar i PCR-produkter av 4 intragenic Mir
gener (MIR-9-1
, MIR-34b
, MIR-193B
, MIR-210
) och 5 extragenisk Mir
gener (MIR-9-3
, MIR-137
, MIR-200b
, MIR-203 Mössor och mIR-375
), respektive (Figur 1, Ytterligare fil 1: Tabell S3, och övriga fil 1: Bild S1-S10). Dessa DHPLC analyser visade att metyleringen positiv hastighet av 5 miR
CpG-öar (MIR-9-1
, MIR-9-3
, MIR-34b
, MIR-137
, och miR-210
) ökade signifikant samtidigt med svårighetsgraden av sjukliga förändringar i magen. Dessa fynd tyder starkt på att metylering av dessa miR
CpG-öar är relaterad till utvecklingen av GC (trend
-test, MIR-9-1
, P <
0,001; MIR-9- 3
, P <
0,001; mIR-34b
, P =
0,008; mIR-137
, P <
0,001; mIR-210
, P
= 0,001; tabell 1). MIR-9-1
metylering påvisades i 18 av 28 GC (känslighet, 64%), men endast i två av 48 normala eller gastrit biopsier visade metylering (specificitet 96%). Även metylering av MIR-200b
upptäcktes i nästan alla gastric vävnadsprover, andelen metylerat MIR-200b
i normal eller gastrit vävnader (46% ~ 100%) var signifikant högre än i både SM och GC prover (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U-
testet, gastrit biopsier kontra SMS, P =
0,001; tabell 1). Detta tyder på att MIR-200b
demetylering var en GC, patientspecifik händelse. Bisulfit sekvensering av dessa miR
CpG-öar bekräftade uppgifterna från DHPLC analys (Figur 1) .table en metylering status Mir CpG-öar i magslemhinnan prover med olika sjukliga förändringar i GC och icke-cancerkontrollpatienter
miR
CpG-öar
gruppen gastric prover
miR
metylering
Positiv takt
Andel (%) av metylerade miR
i Mir
metylering-positiva prover
positiv ränta (%)
χ 2
-värdet
Trend
-test (P
-värde)
Median
[25% ~ 75%]
Mean
± SD
t /F /χ 2
-värdet
P
-värde
mIR-9-1
Normal
1/13 (7,7)
27,598 Hotel < 0,001 en
NA
NA
gastrit
1/35 (2,9) Review NA
SM
9/28 (32,1)
17 [13-30]
20 ± 4
t
= -3,039
0,005 g
GC
18/28 (64,3) Review 29 [19-40]
32 ± 4
mIR-9-3
Normal
6/13 (46,2) Review 23,389 Hotel < 0,001 en
38 [31-59]
43 ± 6
F
=
1.639 0,189 h
gastrit
15/37 (40,5) Review 43 [36-48]
42 ± 2
SM
26/28 (92,9) Review 38 [26-44]
36 ± 2 Review GC
26/28 (92,9) Review 37 [26-43]
36 ± 2 Review MIR-137
Normal
5/13 (38,5) Review 18,626 Hotel < 0,001 en
10 [4-41]
χ 2
= 8,065
0,045 d
gastrit
24/38 (63,2) Review 19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3g
GC
24/26 (92,3) Review 36 [20-51]
37 ± 4
mIR-34b
vid Normal
6/13 (46,2) Review 6,947
0,008 en
13 [7-19]
χ 2
= 0,658
0,883 d
gastrit
13/36 (36,1) Review 11 [3-20]
SM
22/28 (78,6) Review 11 [4-18]
GC
19/28 (67,9) Review 10 [5-32]
mIR-200b
Normal
13/13 (100) Review 0,486
0,922 f
54 [52-83]
χ 2
= 17,883 Hotel < 0,001 d
gastrit
35/36 (97,2) Review 52 [46-100] e
SM
27/28 (96,4) Review 44 [40-47]
GC
27/28 (96,4) Review 48 [40-53]
miR-210

Normal
2/13 (15,4) Review 11,908
0,001 en
NA
NA
gastrit
13/38 (34,2) Review 7 [ ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81,5) Review 11 [5-22]
GC
16/27 (59,3) Review 9 [4-16]
mIR-193B
Normal
0/13
7,045
0,008 b
NA
NA
gastrit
2/37 (5,4) Review NA
SM
7/28 (25,0) Review 5 [4-14]
GC
4/28 (14,3) Review 5 [2-12]
MIR 203
Normal
5/13 (38,5) Review 5,617
0,018 b
32 [29-75]
χ 2
= 2,957
0,398 d
gastrit
20/38 (52,6) Review 31 [26-36]
SM
21/28 (75,0) Review 34 [30-36]
GC
11/28 (39,3) c
32 [29-35]
miR-375
Normal
0/13
12,266 Hotel < 0,001 b
NA
NA
gastrit
13/38 (34,2) Review 3 [3-4] e
SM
16/28 (57,1) Review 7 [4 -14]
GC
8/28 (28,6) c
17 [8-21]
en Trend
testet, bland Normal, gastrit, SM och GC prov; b, Trend
-test, bland Normal, gastrit, och SM prover; c, Pearsons Chi-kvadrat-test, GC kontra SM: MIR-203
, χ 2
= 7,292, P =
0,007; MIR-375
, χ 2
= 4,667, P =
0,031; d, Kruskal-Wallis H
-test; e, Mann-Whitney U
-test: Gastrit kontra SM, miR-200b
, U
= 230,000, P =
0,001; Gastrit mot GC, MIR-375
, U
= 46,000, P =
0,011; SM kontra GC, MIR-137
, U
= 170.000, P
= 0,009; f, Pearsons Chi-kvadrat-test, bland Normal, gastrit, SM och GC prov; g. Parat t
-test: SM mot GC, MIR-137
, t
= -2,652, P =
0,014; h. Enkelriktad ANOVA; NA inte tillgänglig.
Undantag för MIR-9-1 Mössor och MIR-137
, metylering positiva värden eller delar av metylerat MIR-9-3
, MIR-34b
, mIR-210
, och mIR-200b
i GC liknade de i SM (tabell 1). För att validera om metylering av vissa av dessa Mir
gener är en fälteffekt händer samtidigt i båda cancerösa och icke-cancerösa vävnader i magen på grund av samma exponering för miljöfaktorer, detekterade vi metyleringen data i en annan undergrupp av GC och SM prover från 84 patienter och fann att den positiva hastigheten och andelen metylerat mIR-9-1
i GC var fortfarande betydligt högre än i SM (60,7% mot 32,1%, Pearsons Chi-kvadrat-test, P =
0,001; Logga rank test, P Hotel < 0,001; Ytterligare fil 1: Tabell S4, Subset-2). Den genomsnittliga andelen av metylerad miR-137
var också signifikant högre i GC än SMS (Mean
± SD
, 26 ± 2 mot 38 ± 2, Kopplade t-
test, P <
0,001). Som väntat en signifikant skillnad i positiv hastighet eller andelen metylerat MIR-9-3, var MIR-34b
, MIR-210
, och MIR-200b
inte observerats mellan GC och SM prover. Dessa resultat bekräftar att MIR-9-1 Mössor och MIR-137
metylering var en tumörspecifik händelse och att MIR-9-3
, MIR-34b
, och MIR-210
metylering, liksom mIR-200b
demetylering, var en fälteffekt som inträffade under gastric cancer.
Dessutom
positiv hastighet av mIR-375 metylerat miR-203 Mössor och gradvis ökade från normal till gastrit till SM prover, men minskade avsevärt under GC jämfört med SMS (Pearson Chi-square test, mIR-203
, P =
0,007; mIR-375
, P =
0,031; Bord 1). I undergruppen-2 prover, analyserade vi också miR-375
metylering och fann mer miR-375
metylering i SM än i GC igen (Pearson Chi-square test, P =
0,034, ytterligare fil 1 Tabell S4). Dessa data antyder att MIR-375
(och MIR-203
) metylering inte GC specifika och kan vara en typ av värd anpassning i de icke-maligna vävnader till utvecklingen av GC.
MiR
metylering och H. pylori
infektion
att avgöra om H. pylori
infektion spelar en roll i miR
metylering, såg vi för H. pylori
specifika 23 S rDNA
i gastriska genomiska DNA-prover med PCR och fann att H.pylori
-positiv takten~~POS=HEADCOMP ökade samtidigt med svårighetsgraden av patologiska förändringar [15,4% (2 av 13) av normala gastriska biopsier, 52,6% (20 av 38) av gastrit skador och 69,0% (29 av 42) SM biopsier; trend
-test, P =
0,001] och minskade i GC-prover (18 av 42 = 42,9%; GC kontra SM, Pearson Chi-square test, P
= 0,016, ytterligare fil 1: Bild S11 ). H. pylori
-positiva gastrit /normala och SM prover visade signifikant högre metylering av MIR-210
metylering än H. pylori
-negativa prover (P
= 0,036 och 0,022 respektive Figur 2A och B). Figur 2 Jämförelse av miR metylering i olika magslemhinnan prover med och utan förekomst av H. pylori. (A) Normal eller gastrit biopsier från kontroll öppenvård utan malign sjukdom; (B och C) Kirurgiska marginal och tumörprover från patienter med magsäckscancer, respektive; H. pylori-specifik 23 S rDNA
detekterades genom PCR.
Inversed förhållande mellan miR
metylering av CpG-öar och deras motsvarande expressionsnivåer
För att undersöka sambandet mellan ovanstående aberrant miR
metylering och transkriptionen av motsvarande miR
gen, kvantifieras vi mogna miRNA nivåer av mIR-9-1
, mIR-9-3
, mIR-34b
, mIR-137
, miR-210
, miR-200b
, (och miR-375
), vars metyleringsstatus är relaterad till utvecklingen av GC (och GC värd anpassning), såsom beskrivits ovan, i en uppsättning av humana cellinjer med olika metylering status miR
CpG-öar. Metylering status för varje miR
CpG-ö i dessa cellinjer bestämdes genom DHPLC som visas i kompletterande fil 1: Bild S2-S10. Resultaten av kvantitativa RT-PCR-analyser visade att de testade cellinjer innehållande metylerat miR
alleler mogna miRNA nivåer av alla 6 GC relaterade mir
gener och en värd anpassning miR
genen var betydligt lägre än detekteras i cellinjer innehållande ometylerade Mir
alleler (Figur 3A-G). Figur 3 Sambandet mellan uttryck nivå och metylering status Mir gener i humana cellinjer och gastriska vävnadsprover. (A-G) Den korrelationsanalys mellan metylering andel av miRNA CpG-öar och deras mogna miRNA expressionsnivåer i målet CpG-ö metylerade och ometylerade humana cellinjer; (H-P) Expression av miRNA i 20 parade, färska magkarcinom prover; (U) Mål CpG ö ometylerade cellinjer; (M) Mål CpG ö metylerad cellinjer; (U /M) Mål CpG-ö delvis metylerade cellinjer.
Vi analyserade vidare miRNA nivåer av 20 par färska GC och SM prover och fann en signifikant högre expressionsnivån av miRNA-200b,
miRNA-375, och miRNA-210 i SM än i GC (Parat t
-test: Ps
≤0.030, ytterligare fil 1: Figur S12). Mirna-137 nivåer i SM var även högre än i GC, men var inte statistiskt signifikant (P =
0,059). Uttrycksnivåer miRNA-9 och miRNA-34b liknade mellan SM och GC. Viktigast av allt, var ett omvänt förhållande mellan miR
metylering och motsvarande expressionsnivån observerades för MIR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
, och MIR-200b
i dessa gastric vävnadsprover (Spearmans rangkorrelationsanalys, mIR-9-1
, r
s
= -0,533, P =
0,001; mIR-9-3
r
s
= -0,464, P =
0,004; mIR-137
, r
s
= -0,378, P =
0,019, mIR-200b
, r
s
= -0,409, P =
0,010; figur 3H-K). En svag omvänd metylering uttryck relation konstaterades också för MIR-375
i dessa vävnadsprover (r
s
= 0,287, P =
0,085; figur 3O). Ett sådant förhållande observerades inte för MIR-34b Mössor och MIR-210
(figur 3L, N).
MiR
metylering korrelerad till kliniskt patologiska egenskaper hos GC patienter
att undersöka möjligheten att med användning miR
metylering som en prognos prediktor för GC, bestämde vi förekomsten av metylering av 7 mir
gener och analyserat förhållandet mellan de kliniskt patologiska egenskaper hos GC och motsvarande metylering nivåer av dessa miR
CpG-öar studerade ovan för alla 112 GC patienter (tabell 2 och ytterligare fil 1: Tabell S6). features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive pylori
infektion.

• Förekomst av S100A9-positiva inflammatoriska celler i cancervävnader korrelerar med ett tidigt stadium cancer och en bättre prognos hos patienter med magcancer
• Har överföring av Helicobacter pylori från människor orsakar sjukdomsutbrott i en koloni av Stripe-faced Dunnarts (Sminthopsis macroura)?