Caratterizzazione di metilazione gastrica umana carcinoma correlati di 9 isole miR CPG e la repressione delle loro espressioni in vitro e in vivo

Caratterizzazione di metilazione gastrica umana carcinoma correlati di 9 miR
Isole CPG e repressione dei loro espressioni in vitro e in vivo

astratta
sfondo
Molti miR
geni sono situato all'interno o intorno alle isole CpG. Non è chiaro se la metilazione di queste isole CpG reprime miR
trascrizione regolarmente. Gli obiettivi di questo studio sono di caratterizzare carcinoma gastrico (GC) metilazione -related di miR
isole CpG e il suo rapporto con miRNA espressione.
Metodi
stato di metilazione di 9 rappresentante miR
isole CpG in un pannello di linee cellulari e campioni gastriche umane (tra cui 13 biopsie normali, 38 biopsie gastrite, 112 paia di GC e loro campioni margine chirurgico) è stato analizzato dal bisolfito-DHPLC e sequenziamento. i livelli di miRNA maturo sono stati determinati con RT-PCR quantitativa. I rapporti tra miR
metilazione, trascrizione, lo sviluppo GC, e le caratteristiche clinico-patologici sono stati analizzati statisticamente.
Risultati
frequenza di metilazione del 5 miR
isole CpG (miR-9-1
, miR-9 -3
, miR-137
, miR-34b
, e miR-210
) gradualmente aumentata, mentre la percentuale di metilato miR-200b
gradualmente diminuita durante la carcinogenesi gastrica (Ps
< 0,01). Più miR-9-1
metilazione è stata rilevata nel 62% -64% dei campioni GC e il 4% dei campioni normali o gastrite (18/28 contro 2/48; Odds ratio, 41,4; P
<0.01). miR-210
metilazione ha mostrato un'alta correlazione con H. pylori
infezione. miR-375
, miR-203
, e
miR-193B metilazione potrebbero essere adattamento ospite allo sviluppo di GC. La metilazione di questi miR
isole CpG è stato costantemente dimostrato di ridurre significativamente i corrispondenti livelli di miRNA presentati in linee cellulari umane. La relazione inversa è stata osservata anche per miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
, e
miR-200b nei campioni gastrici. Tra 112 pazienti GC, miR-9-1
metilazione era un predittore indipendente di sopravvivenza favorevole complessiva dei pazienti GC sia in analisi univariata e multivariata (P
< 0,02).
Conclusioni
In conclusione , alterazione dello stato di metilazione di 6 dei 9 testato miR
isole CpG è stato caratterizzato nella carcinogenesi gastrica. miR-210
metilazione correlata con H. pylori
infezione. miR-9-1
metilazione può essere un evento specifico-GC. La metilazione del miR
isole CpG possono significativamente down-regolare regolarmente la loro trascrizione.
Sfondo
miRNA sono una classe abbondante di piccoli RNA non codificanti che regolano principalmente l'espressione genica a livello post-trascrizionale. Essi svolgono un ruolo critico nel rinnovamento e la differenziazione delle cellule staminali e aiutano a mantenere linee cellulari. Precedenti ricerche hanno dimostrato che nel cancro molti dei miR
geni, come miR-200b /200A /429
, miR-21
, miR-30b
,
miR-30d, miR
-31, e miR-423 quali sono sovraregolati, mentre altri miR
geni, come miR-143 e miR-
145
sono inibiti [1-3]. L'evidenza suggerisce che cambiamenti nell'espressione miRNA si verificano di frequente in molti tumori e queste variazioni sia contribuiscono alla carcinogenesi riflettono lo sviluppo e la progressione dei tumori.
Ci sono una serie di percorsi che possono influenzare i livelli di miRNA maturi in cellule e tessuti, come ad esempio amplificazione del gene o la cancellazione, upregulation trascrizionale o down-regulation, l'elaborazione post-trascrizionale, e miRNA degrado [4-7]. E 'noto che alcuni intragenica miR
geni, come miR-218-2
, sono coordinato trascritto con i loro geni ospitanti attraverso meccanismi di coregolamentazione [8]. Tuttavia, molti miR
geni sono extrageniche e una certa proporzione di intragenica miR geni, come miR-9-1 Quali sono trascritti in un gene indipendente modello ospite
[9]. Perché l'esatto regione del promotore della maggior parte dei miR
geni non sono caratterizzati, soprattutto per quanto riguarda i miR
geni extrageniche, gli esatti meccanismi di regolazione di miR
trascrizione sono tutt'altro che chiare
. Metilazione o ipermetilazione di isole CpG nella regione di trascrizione partendo siti (TSS) è generalmente riconosciuto per reprimere la trascrizione del gene epigeneticamente. A differenza di geni codificanti proteine ​​che possono estendersi su più isole CpG, il miR
geni possono essere più breve di un'isola CpG, e, in alcuni casi, più miR
geni (ad esempio, un miR
gene cluster) può essere situato all'interno o di accompagnamento di una sola isola CpG (sui file 1: Tabella S1). metilazione aberrante di isole CpG associati miR geni, come let-7a-3
e miR-34a
, è frequente in molti tumori [10, 11]. E 'stato suggerito che la metilazione delle isole CpG che sono associati con miR
geni (cioè miR-203
, miR-152
, miR-124-1
, miR-34b /c
, miR-129-2
, miR-9-1
, miR-130b
, miR-124-2
, e miR-181 quater
) potrebbero inversamente correlato con la loro livelli di espressione [12-17]. Tuttavia, anche la trascrizione di miR
geni è regolarmente influenzato dalla stato di metilazione di miR
isole CpG non è stato studiato a livello sistemico.
E 'ben noto che la metilazione anormale o demetilazione di isole CpG in un piccolo proporzione (< 1%) della popolazione cellulare può essere sensibilmente rilevati in campioni di tessuto eterozigoti cellulari. Ciò dimostra il vantaggio di analisi di metilazione alterazioni dell'espressione genica del RNA e livelli di proteine ​​che può essere rilevato solo quando tale modifica è presente in una grande percentuale di una popolazione di cellule in un campione [18]. La nostra analisi bioinformatica mostra 50, 9, e 70 di 721 umani miR
geni nel miRBase (Release 14.0) si trovano, rispettivamente, all'interno, di accompagnamento, e nei pressi di isole CpG (collettivamente si farà riferimento a questi come miR
isole CpG; file aggiuntivo 1: Tabella S1). Noi ipotizziamo che la metilazione aberrante di miR
isole CpG può verificarsi durante lo sviluppo e la progressione dei tumori. Perciò potrebbero essere utilizzati come geni candidati non solo per la previsione della prognosi del cancro, ma anche per l'indagine dell'associazione metilazione-espressione in vivo
. Così, isole CpG di 9 miR
geni correlati alla malattia, di cui 5 extrageniche miR
geni o gruppi di geni (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b /200A /429
, miR-203
, e miR-375
) e 4 geni intragenica o cluster di geni (miR-9-1
, miR-34b /c
, miR-193B /365 -1
, e miR-210
), sono stati selezionati come i geni di rappresentanza in questo studio (sui file 1: Tabella S1). L'associazione metilazione-espressione per 3 di questi miR
geni non è stata stabilita in precedenza (sui file 1: Tabella S2) [12, 14, 19-27]. Abbiamo inizialmente sottoposti a screening per carcinoma gastrico (GC) - o host connessi aberrante miR
metilazione e quindi studiato l'associazione metilazione-espressione in vitro e in vivo

. Le associazioni tra le caratteristiche clinico-patologici di pazienti GC e metilazione di questi miR
isole CpG sono stati analizzati anche
Metodi
fonti linea di cellule e di coltura cellulare
informazioni Fonte di linee cellulari utilizzati in questo studio:. Cell RKO linea, fornito dal Dr. Guoren Deng presso l'Università della California, San Francisco; SW480 e HCT116 sono stati forniti dal Dr. Yuanjia Chen all'ospedale Peking Union Medical College; MKN74 e 293 T fornita da Tokyo Medical and Dental University; PC-3 è stato acquistato dalla linea cellulare Bank presso l'Accademia Cinese delle Scienze Mediche; HL60 e KG1a sono stati ottenuti dal Dipartimento di Ematologia dell'Università di Pechino Primo Ospedale; DU145 è stato ottenuto da Hanmar Pharmacy Company; Siha è stato fornito da Hospital di Pechino Popolare dell'Università. HepG2 è stato fornito dal Dr. Qingyun Zhang, Calu3 e A549 dal Dr. Zhiqian Zhang, H1299 e AGS dal Dr. Chengchao Shou, MKN45 dal Dott Youyong Lv, e altre linee cellulari (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa e GES-1) dal Dr. Yang Ke, il tutto a Peking University Cancer Hospital /Institute. Queste linee cellulari sono state coltivate a 37 ° C in 5% CO 2, utilizzando vari terreni di coltura. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1a, A549, H1299, GES-1, HepG2, 293 T, DU145 e RKO sono state coltivate in 90% RPMI-1640 e il 10% FBS. PC-3 e AGS sono state coltivate in 90% F-12 e il 10% FBS. Calu3, HeLa e Siha sono state coltivate in DMEM 90% e il 10% FBS. SW480 e HCT116 sono state coltivate in 90% DMEM: RPMI-1640 (1: 1). E il 10% FBS
Pazienti e campioni di tessuto
chirurgici campioni GC primaria ei loro campioni appaiati non cancerose margine chirurgico (SM) sono stati raccolti da 112 pazienti ricoverati (età media 59,2 anni [range, 32-79]; 80 maschi e 32 femmine, 78 non cardiaca CGS e 34 CV cardiaci; 40 CV a pTNM stadio I ~ II e 59 in fase III ~ IV) all'Università di Pechino Cancer Hospital. i dati di follow-up per tutti i pazienti sono stati raccolti per almeno cinque anni. Tutti i campioni clinici, così come le informazioni istopatologico e follow-up per ciascun caso sono stati ottenuti secondo le linee guida istituzionali approvate. biopsie gastriche da 13 soggetti sani e 38 pazienti ambulatoriali gastrite prelevati dallo stesso ospedale sono stati utilizzati come controlli non tumorali del paziente. Prima modifica bisolfito campione di DNA genomico gastrica di ogni paziente è stato analizzato per la presenza di H. pylori
SPECIFICI 23 S rDNA
da un saggio PCR come precedentemente descritto [28]. I Institutional Review Boards di Peking University Cancer Hospital e Istituto ha approvato lo studio (.011.041,207 mila), e tutti i pazienti hanno dato consenso informato scritto.
Estrazione del DNA e la modifica bisolfito
linea di cellule del cancro e campione di tessuto DNA genomico (1,8 mg) è stato isolato tramite estrazione con fenolo /cloroformio [29]. I residui di citosina non metilate nei campioni di DNA sono stati convertiti ai residui di uracile (diventando residui timidina in prodotti PCR) con l'aggiunta di 5 M bisolfito di sodio [30]. primer universale Il kit Wizard® DNA Clean-Up System (Promega) è stato utilizzato per purificare il DNA bisolfito trattati prima di amplificazione PCR.
PCR amplificazione e quantificazione del miR
CpG isola metilazione da DHPLC
CpG-gratis set sono stati utilizzati per amplificare miR
CpG isole di hot-start PCR (polymerase sui file 1: Figura S1 e sui file 1: Tabella S3). Sequenze di isole CpG incorporati o fiancheggiate questi connessi miR
geni sono stati usati per disegnare i primer. I prodotti di PCR sono stati poi analizzati quantitativamente DHPLC sul WAVE® DNA Fragment sistema di analisi [31]. profili di eluizione di miR-9-3
,
miR-200b, e miR-203
metilazione è stato analizzato con un rilevatore di raggi ultravioletti; altri miR
metilazione del gene è stato rilevato con la colonna montante HSX-3500 accessori (Transgenomic, Inc., Omaha, USA) e una fluorescenza ad alta sensibilità (FL) rilevatore (eccitazione a 450 nm, emissione a 520 nm) [32 ]. Metilato e non metilato miR
prodotti gene PCR sono stati separati da una colonna analitica DNASep® (Transgenomic) alla temperatura corrispondente parziale denaturazione (file complementare 1: Tabella S3 e Figura S2-10). Le aree dei picchi corrispondenti ai prodotti di PCR metilato e non metilato sono stati usati per calcolare la percentuale di metilato miR
isola CpG [la percentuale di copie denaturato = area /area del picco totale di metilazione di punta] come descritto in precedenza [33]. M.SssI-
metilato DNA genomico da campioni di sangue è stato utilizzato come controllo positivo. Figura 1 cromatogrammi DHPLC e sequenziamento bisolfito di 7 isole CpG miR in linee cellulari rappresentative e campioni di tessuto gastrico. Sia il DNA umano periferico del sangue (sangue) e la sua M.Sss
prodotti I-metilata (M.BLOOD) sono stati utilizzati come controlli. Tutti i siti CpG nel amplicone di ciascun miR
isola CpG sono anche elencate sopra i risultati di sequenziamento bisolfito. Ogni riga rappresenta un clone; ogni barra rosa rappresenta un sito metilato CpG. La corrispondente cromatogramma di ogni campione sequenziato (colonna di destra) è indicato (colonna di sinistra).
Bisolfito clone-sequenziamento
fresca PCR prodotti di miR
isole CpG amplificati con i set di primer universali CpG-free sono stati clonati con il kit pGEM-T Easy (Promega, Madison, USA) e sequenziato con Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer a SinoGeneMox Company (Pechino, Cina).
Estrazione di RNA e la rilevazione del livello di maturità miRNA con saggi RT-PCR quantitativa
l'RNA totale 50 ng è stato estratto da campioni di tessuto fresco o linee cellulari che utilizzano il reagente TRIzol (life Technologies, Carlsbad, Stati Uniti d'America) secondo il protocollo del produttore. I corrispondenti campioni di cDNA sono stati sintetizzati mediante Reverse Transcription Kit TaqMan® MicroRNA (Life Technologies) con miR
SPECIFICI stem-loop inversa trascrizione (RT) primer (specifico per miR-375
# RT000564, miR-34b
# RT000427, miR-137
# RT000593, e miR-9
# RT000583). Le condizioni RT utilizzati erano 16 ° C per 30 min ➔ 42 ° C per 30 min ➔ 85 ° C per 5 min. I livelli di miRNA sono stati poi analizzati utilizzando un TaqMan Gene Expression kit Master Mix (Life Technologies) con la corrispondente sonda e primer (Life Technologies, miR-375
# TM000564, miR-34b
# TM000427, miR-137
# TM000593, e miR-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # RT001093 e # TM001093) è stato utilizzato come riferimento interno. Le condizioni di ciclo di PCR erano 95 ° C per 10 minuti ➔ seguita da 40 cicli di 95 ° C per 20 sec ➔ 60 ° C per 1 min. I livelli di espressione di miR-200b
e miR-210
sono stati determinati usando un test standard di polyA RT-PCR. Sequenze dell'adattatore innesco RT, l'inverso primer universale e l'U6
fondo nel regolare test poliA RT-PCR sono mostrati in file aggiuntive 1: Tabella S5. condizioni RT erano 55 ° C per 5 min ➔ seguito da 25 ° C per 10 min ➔ 42 ° C per 1 ora ➔ e 70 ° C per 5 min. Le condizioni di ciclismo PCR sono stati 95 ° C for10min ➔ seguita da 40 cicli di 95 ° C per 20 sec ➔ e 61 ° C per 1 min. Analisi statistica
SPSS 16.0 Trend
-test e Chi- di Pearson square test sono stati utilizzati per analizzare il miR
differenza di frequenza di metilazione tra biopsie normali, lesioni gastrite, campioni GC e SM. Kruskal-Wallis H
-test e One-Way ANOVA sono stati utilizzati per analizzare il miR
differenze di metilazione del rapporto tra biopsie normali, lesioni gastrite, GC, e campioni SM. Il test di Fisher esatto, test chi-quadro di Pearson, e Trend
-test sono stati utilizzati per analizzare l'associazione tra miR
metilazione tassi positivi e le caratteristiche clinico-patologici. Il Mann-Whitney U-test
e Student di t
-test sono stati utilizzati per analizzare l'associazione tra la percentuale di metilati miR
alleli e le caratteristiche clinico-patologici. metodi di Kaplan-Meier e Cox-proporzionale pericoli sono stati utilizzati per l'analisi univariata e multivariata per confrontare la sopravvivenza complessiva dei pazienti GC con differenze di stato di metilazione di miR
Isole CpG. Tutti i test statistici erano a due code, e P
< 0.05 è stato
considerato statisticamente significativo. Risultati
Caratterizzazione di metilazione o demetilazione del 6 miR
isole CpG legate allo sviluppo di GC
abbiamo amplificato modelli bisolfito trattati di 9 rappresentative miR
isole CpG primer e sviluppato 9 saggi DHPLC per analizzare lo stato di metilazione delle isole CpG in prodotti di PCR su 4 miR
geni intragenica (miR-9-1
, miR-34b
con CpG-liberi, miR-193B
, miR-210
) e 5 miR
geni extrageniche (miR-9-3
, miR-137
,
miR-200b, miR-203 e
miR-375
), rispettivamente (Figura 1, sui file 1: Tabella S3, e sui file 1: Figura S1-S10). Questi test DHPLC hanno rivelato che il tasso positivo di metilazione di 5 miR
isole CpG (miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, e miR-210
) è risultato significativamente aumentato in concomitanza con la gravità dei cambiamenti patologici nello stomaco. Questi risultati suggeriscono che la metilazione di questi miR
isole CpG è legato allo sviluppo di GC (tendenza
-test, miR-9-1
, P <
0.001; miR-9- 3
, P <
0.001; miR-34b
, P = 0,008
; miR-137
, P <
0.001, miR-210
, P
= 0.001; Tabella 1). miR-9-1
metilazione è stato rilevato in 18 di 28 CV (sensibilità, 64%), ma solo in 2 su 48 biopsie normali o gastrite ha mostrato metilazione (specificità, 96%). Anche se è stato rilevato metilazione di
miR-200b in quasi tutti i tessuti campioni gastrici, la percentuale di metilato
miR-200b nei tessuti normali o gastrite (46% ~ 100%) era significativamente più alta rispetto a quella in entrambe SM e GC campioni (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U
test, biopsie gastrite contro SMS, P = 0,001;
Tabella 1). Ciò suggerisce che miR-200b
demetilazione era un GC, evento specifico paziente. sequenziamento bisolfito di questi miR
isole CpG confermato i dati ottenuti dalle analisi DHPLC (Figura 1) .table Stato 1 metilazione di isole CpG miR in campioni di mucosa gastrica con diversi cambiamenti patologici in GC e di controllo dei pazienti non-cancerose
miR isole CpG

gruppo di campioni gastrici
miR
-Methylation
tasso positivo
Percentuale (%) di metilato miR
nel miR
campioni di metilazione-positivi
tasso positivo (%)
χ 2
-value
Trend
-test (P
-value)
mediano
[25% ~ 75%]
media
± SD
t /F /χ 2
-value
P
-value
miR-9-1
normale
1/13 (7.7)
27,598
< 0,001
a NA NA

gastrite
1/35 (2.9)
NA
SM
9/28 (32,1)
17 [13-30]
20 ± 4
t = -3,039

0.005 g
GC
18/28 (64,3)
29 [19-40]
32 ± 4
miR-9-3
normale
6/13 (46,2)
23,389
< 0,001
a 38 [31-59]
43 ± 6
F
= 1.639
0,189 h
gastrite
15/37 (40.5)
43 [36-48]
42 ± 2
SM
26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2
GC
26/28 (92,9)
37 [26-43]
36 ± 2
miR-137
normale
5/13 (38,5)
18,626
< 0,001
a 10 [4-41]
χ 2
= 8,065 0,045
d
gastrite
24/38 (63,2)
19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3g
GC
24/26 (92,3)
36 [20-51]
37 ± 4
miR-34b

normale
6/13 (46,2)
6.947
0.008
a 13 [7-19]
χ 2
= 0,658 0,883 d

Gastrite
13/36 (36,1)
11 [3-20]
SM
22/28 (78,6)
11 [4-18]
GC
19/28 (67,9)
10 [5-32]
miR-200b
normale 13/13 (100)
0,486 0,922
f
54 [52-83]
χ 2
= 17,883
< 0,001 d
gastrite
35/36 (97,2)
52 [46-100] e
SM
27/28 (96,4)
44 [40-47]
GC
27/28 (96,4)
48 [40-53]
miR-210

normale 2/13 (15,4)
11,908
0.001
a NA NA

gastrite
13/38 (34.2)
7 [ ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81.5)
11 [5-22]
GC
16/27 (59,3)
9 [4-16]
miR-193B
normale 0/13
7,045
0.008 b
NA NA

gastrite
2/37 (5.4)
NA
SM
7/28 (25,0)
5 [4-14]
GC
4/28 (14,3)
5 [2-12]
retrovisori 203
normale
5/13 (38,5)
5.617
0.018 b
32 [29-75]
χ 2
= 2.957
0,398 d
gastrite
20/38 (52,6)
31 [26-36]
SM
21/28 (75,0)
34 [30-36]
GC
11/28 (39.3) c
32 [29-35]
miR-375
normale
0/13
12.266
< 0,001 b
NA NA

gastrite
13/38 (34.2)
3 [3-4] e
SM
16/28 (57,1)
7 [4 -14]
GC
8/28 (28,6) c
17 [8-21]
una, Trend
test, tra normale, gastrite, SM e campioni GC; b,
Trend -test, tra Normale, gastrite, e campioni SM; c, test chi-quadro di Pearson, GC contro SM: miR-203
, χ 2
= 7.292, p = 0.007
; miR-375
, χ 2
= 4.667, p = 0,031
; d, Kruskal-Wallis H
-test; e, Mann-Whitney U-test
: Gastrite contro SM,
miR-200b, U
= 230.000, P = 0.001
; Gastrite contro GC, miR-375
, U
= 46.000, P = 0.011
; SM rispetto a GC, miR-137
, U
= 170.000, P = 0,009
; f, test chi-quadro di Pearson, tra normale, gastrite, campioni SM e GC; g. Paired t-test
: SM rispetto a GC, miR-137
, t
= -2,652, p = 0,014
; h. One-way ANOVA; NA, non è disponibile.
Fatta eccezione per miR-9-1
e miR-137
, i tassi positivi di metilazione o proporzioni di metilato miR-9-3
, miR-34b
, miR-210
, e miR-200b
in GC erano simili a quelli in SMS (Tabella 1). Per convalidare se la metilazione di alcuni di questi miR
geni è un effetto di campo avviene simultaneamente in entrambi i tessuti cancerosi e non cancerose nello stomaco dovuto alla stessa esposizione a fattori ambientali, abbiamo rilevato i dati di metilazione in un altro sottoinsieme di GC e SM campioni provenienti da 84 pazienti e scoperto che il tasso positivo e la proporzione di metilato miR-9-1
in GC era ancora significativamente superiore a quello in SMS (60,7% vs 32,1%; test chi-quadro di Pearson, p =
0.001; Iscriviti rank test, P
< 0,001; sui file 1: Tabella S4, Subset-2). La percentuale media del metilato miR-137
è risultata significativamente più alta nel GC di SMS (media ±

SD, 26 ± 2 vs 38 ± 2, in coppia t-
test, P <
0.001). Come ci si aspettava una differenza significativa nel tasso positivo o la percentuale di metilato miR-9-3, miR-34b
, miR-210
, e miR-200b
Non è stata osservata tra il GC e campioni SM. Questi risultati hanno confermato che miR-9-1
e miR-137
metilazione è stato un evento di tumore-specifica e che miR-9-3
, miR-34b
, e miR-210
metilazione, così come miR-200b
demetilazione, era un effetto di campo che si sono verificati durante la carcinogenesi gastrica.
Inoltre, il tasso positivo di metilato miR-203 e miR-
375
gradualmente aumentata da normale a gastrite a campioni SM, ma significativamente diminuita in GC rispetto con SMS (test di Pearson Chi-quadro, miR-203
, P = 0.007
; miR-375
, P = 0,031
; Tabella 1). Nel sottoinsieme-2 campioni, abbiamo anche analizzato miR-375
metilazione e l'abbiamo trovato più miR-375
metilazione in SMS che in GC di nuovo (test di Pearson Chi-quadro, P = 0.034
; sui file 1 : Tabella S4). Questi dati implicano che miR-375
(e miR-203
) metilazione non è GC-specifico e potrebbe essere un tipo di adattamento ospitante, nei tessuti non maligni allo sviluppo di GC.
MiR
metilazione e H. pylori
infezione
per determinare se H. pylori
infezione svolge un ruolo nella miR
metilazione, abbiamo cercato H. pylori
SPECIFICI 23 S rDNA
in gastrici campioni di DNA genomico mediante PCR e ha scoperto che H. pylori
tasso -positivo aumentato in concomitanza con la gravità dei cambiamenti patologici [15,4% (2 su 13) dei normali biopsie gastriche, 52,6% (20 di 38) di lesioni gastrite, e 69,0% (29 su 42) biopsie SM; Andamento
-test, P = 0,001
] e una diminuzione nei campioni GC (18 su 42 = 42,9%; GC rispetto SMS, test di Pearson Chi-quadro, P = 0,016
; sui file 1: Figura S11 ). H. pylori
-positive gastrite /normali e SM campioni hanno mostrato significativamente più alto di metilazione di miR-210
metilazione di H. pylori
campioni -negative (P,
= 0,036 e 0,022 rispettivamente figura 2A e B). Figura 2 Confronto di miR metilazione in vari campioni di mucosa gastrica con e senza presenza di H. pylori. (A) biopsie normali o gastrite da pazienti ambulatoriali di controllo senza malattia maligna; (B e C) e dei margini tumorali chirurgici campioni di pazienti con carcinoma gastrico, rispettivamente; H. pylori-specifiche 23 S rDNA
è stato rilevato mediante PCR.
Rapporto Inversed tra miR
metilazione di isole CpG e dei loro livelli di espressione corrispondenti
per indagare il rapporto tra il sopra aberrante miR
metilazione e la trascrizione del corrispondente miR
gene, abbiamo quantificato i livelli maturi miRNA di miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, miR-210
,
miR-200b, (e miR-375
), il cui stato di metilazione è legato allo sviluppo di GC (e adattamento ospite GC) come descritto in precedenza, in un insieme di linee cellulari umane con diverso stato di metilazione di miR
isole CpG. Lo stato di metilazione di ciascun miR
isola CpG in queste linee cellulari è stata determinata da DHPLC come illustrato nel file aggiuntive 1: Figura S2-S10. I risultati del test RT-PCR quantitativa hanno dimostrato che nelle linee cellulari testate contenenti metilato miR
alleli i maturi livelli di miRNA di tutte le 6 miR
geni GC-correlati e un host adattamento miR
gene erano significativamente più bassi rispetto a quelli rilevato nelle linee cellulari contenenti non metilato miR
alleli (figura 3A-G). Figura 3 La relazione tra livello di espressione e lo stato di metilazione dei geni miR in linee cellulari umane e campioni di tessuto gastrico. (A-G) L'analisi di correlazione tra metilazione proporzione di isole miRNA CPG e le loro mature livelli di espressione miRNA nel target CpG isola linee cellulari umane metilato e non metilato; (H-P) Espressione dei miRNA in 20 coppie, freschi campioni di carcinoma gastrico; (U) Obiettivo CpG isola linee cellulari non metilato; (M) Obiettivo CpG isola metilato linee cellulari; (M /U) Obiettivo CpG isola parzialmente linee cellulari denaturato.
Abbiamo analizzato ulteriormente i livelli di miRNA di 20 coppie di GC fresco e campioni SM e ha trovato un livello di espressione significativamente più alto di miRNA-200b,
miRNA-375, e miRNA-210 in SMS che in GC (paired t-test
: Ps
≤0.030; sui file 1: Figura S12). I livelli di miRNA-137 in SMS sono stati anche superiori a quelli in GC, ma non era statisticamente significativa (p = 0,059
). I livelli di espressione di miRNA-9 e miRNA-34b sono stati simili tra sms e GC. Ancora più importante, una relazione inversa tra miR
metilazione e il corrispondente livello di espressione è stata osservata per miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
, e miR-200b
in questi campioni di tessuto gastrico (Classifica analisi di correlazione di Spearman, miR-9-1
, r
s
= -0,533, P = 0,001
; miR-9-3
, r
s
= -0,464, p = 0.004
; miR-137
, r
s
= -0,378, p =
0,019; miR-200b
, r
s
= -0,409, P = 0,010
; Figura 3H-K). Un rapporto metilazione-debole espressione inversa è stata trovata anche per miR-375
in questi campioni di tessuto (r
s
= 0,287, p = 0,085
; Figura 3O). Tale relazione non è stata osservata per miR-34b
e miR-210
(figura 3L, N).
miR
metilazione correlato alle caratteristiche clinico-patologici dei pazienti GC
Per studiare la possibilità di utilizzando miR
metilazione come predittore di prognosi GC, abbiamo determinato la prevalenza di metilazione di 7 miR
geni e analizzato il rapporto tra le caratteristiche clinico-patologici di GC ed i corrispondenti livelli di metilazione di questi miR
isole CpG studiato sopra per tutti i pazienti 112 GC (Tabella 2 e file aggiuntivo 1: Tabella S6). features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive pylori
infezione. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Figura S6. Figura S12. Tabella S1. Tabella S2. Tabella S3. Tabella S4. Tabella S5. Tabella S6. Tabella S7.

• La presenza di cellule infiammatorie S100A9-positivi nei tessuti tumorali si correla con un cancro della fase iniziale e una migliore prognosi nei pazienti con gastrica cancer
• Ha fatto la trasmissione di Helicobacter pylori da esseri umani causano un focolaio di malattia in una colonia di banda faccia dunnarts (Sminthopsis macroura)?