Karakterisointi ihmisen mahakarsinooman liittyviä metylaatio 9 miR CpG-saarekkeiden ja tukahduttaminen niiden ilmaisuja in vitro ja in vivo

Karakterisointi ihmisen mahakarsinooman liittyviä metyloinnin 9 miR
CpG-saarekkeiden ja tukahduttaminen niiden ilmaisuja in vitro
ja in vivo
tiivistelmä
tausta
Monet miR
geenit sijaitsevat tai noin CpG saarilla. On epäselvää, onko metylaatio näiden CpG-saarekkeiden tukahduttaa miR
transkriptio säännöllisesti. Tavoitteet Tämän tutkimuksen ovat luonnehtimaan mahakarsinoo- (GC) liittyvien metylaatio miR
CpG-saarekkeiden ja sen suhdetta miRNA ilme. Tool Menetelmät
metylaatiostatuksen 9 edustajan miR
CpG saaria paneeli solulinjojen ja ihmisen mahalaukun näytteiden (joista 13 normaalia koepaloja, 38 gastriitti koepaloja, 112 paria GC ja niiden kirurgisiin marginaali näytettä) analysoitiin bisulfiitti-DHPLC ja sekvensointi. Aikuinen miRNA tasot määritettiin kvantitatiivinen RT-PCR. Väliset suhteet miR
metylaatio, transkriptio, GC kehitys, ja kliinis ominaisuudet analysoitiin tilastollisesti.
Tulokset
metylointi taajuudella 5 miR
CpG-saarekkeiden (miR-9-1
, miR-9 -3
, miR-137
, miR-34b
, ja miR-210
) vähitellen kasvanut, kun taas osuus metyloitua miR-200B
vähitellen laski mahasyövän (Ps
< 0,01). Lisää miR-9-1
metylaatio havaittiin 62% -64%: n GC-näytteen ja 4% normaalista tai gastriitti näytteistä (18/28 vs. 2/48; Odds-suhde, 41,4; P
<0,01). miR-210
metylaatio osoitti vahvasti yhteydessä helikobakteeri
infektio. miR-375
, miR-203
, ja miR-193B
metylaatio saattaa olla isäntä sopeutumista kehittämiseen GC. Metylointi näistä miR
CpG-saarekkeiden johdonmukaisesti osoitettu merkittävästi vähentää vastaava miRNA tasot esitetään ihmisen solulinjoissa. Käänteisen suhde havaittiin myös miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
, ja miR-200B
mahalaukun näytteissä. Niistä 112 GC potilaita, miR-9-1
metylaatio oli itsenäinen suotuisa ennustaja eloonjäämisaste GC potilaista molemmissa yhden ja usean analyysi (P
< 0,02).
Johtopäätökset
Johtopäätöksenä , muuttaminen metylaatiostatus 6 9 testattu miR
CpG saarilla on tunnettu mahasyövän. miR-210
metylaatio korreloi helikobakteeri
infektio. miR-9-1
metylaatio saattaa olla GC-erityinen tapahtuma. Metylaation miR
CpG-saarekkeiden voi merkittävästi alas-säädellä transkription säännöllisesti.
Taustaa
miRNA ovat runsas luokka pienet ei-koodaavat RNA: t, jotka pääasiallisesti säädellä geeniekspressiota at transkription jälkeisellä tasolla. Ne kriittisiä rooleja uusimiseen ja erilaistumista kantasoluja ja auttaa ylläpitämään solun suvusta. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että syövän useat miR
geenejä, kuten miR-200B /200A /429
, miR-21
, miR-30b
, miR-30d
, miR -31
, ja miR-423
ovat voimistunut, kun taas muut miR
geenejä, kuten miR-143
ja miR-145
ovat vaimentua [1-3]. On näyttöä siitä, että muutokset miRNA ilmaisu esiintyy usein monissa syövissä ja nämä vaihtelut joko edistävät syövän synnyn tai heijastaa kehittymistä ja etenemistä syöpien.
Olemassa useita polkuja, jotka voivat vaikuttaa kypsä miRNA tasoja soluissa ja kudoksissa, kuten geenimonistuksen tai poisto, transkription säätelyä tai alisäätely, transkription jälkeinen käsittely, ja miRNA hajoaminen [4-7]. On tunnettua, että jotkut geeninsisäiset miR
geenejä, kuten miR-218-2
ovat coordinately transkriptoidaan niiden isäntägeenejä yhteistyön avulla sääntelymekanismeja [8]. Kuitenkin monet miR
geenit ovat extragenic ja tietyn osuuden geeninsisäinen miR
geenejä, kuten miR-9-1
transkriptoidaan isännässä geeni-riippumatonta kuvio [9]. Koska tarkka promoottorialueen useimpien miR
geenejä ei ominaista, erityisesti mitä tulee extragenic miR
geenien tarkka sääntely mekanismeja miR
transkriptio ovat kaikkea muuta kuin selvä.
Metylointi tai hypermetylaatiota CpG alueen saaria transkription aloittamista sivustoja (TSS) on yleisesti tunnustettu tukahduttaa geenin transkriptiota epigeneettiseltä. Toisin kuin proteiinia koodaavan geenejä, jotka voivat ulottua useita CpG-saarekkeiden, MIR
geenit voivat olla lyhyempi kuin CpG-saarekkeen, ja joissakin tapauksissa, on useita miR
geenejä (eli miR
geeniklusterin) voi olla sijaitsevat tai reunustavat yhden CpG-saarekkeen (Additional tiedosto 1: Taulukko S1). Poikkeava metylaatio CpG-saarekkeiden liittyy miR
geenejä, kuten let-7a-3
ja miR-34a
, havaitaan usein monissa syövissä [10, 11]. On ehdotettu, että metylaatio CpG-saarekkeiden, jotka liittyvät miR
geenien (eli miR-203
, miR-152
, miR-124-1
, miR-34b /c
, miR-129-2
, miR-9-1
, miR-130b
, miR-124-2
, ja miR-181C
) saattaa korreloivat käänteisesti niiden ekspressiotasot [12-17]. Kuitenkin, riippumatta siitä, transkription miR
geenien säännöllisesti vaikuttaa metylaatiostatuksen miR
CpG-saarekkeiden ei ole systeemisesti tutkittu.
On hyvin tunnettua, että epänormaali metylointi tai demetylaation CpG-saarekkeiden pienessä osa (< 1%) solupopulaation voidaan herkästi havaita solun heterotsygoottisia kudosnäytteistä. Tämä osoittaa etuna metylointianalyysi yli muutokset geeni-ilmentymisen RNA-tasolla ja proteiinitasolla, joka voidaan havaita vain, kun tällainen muutokset on läsnä suuri osa solupopulaation näytteessä [18]. Meidän bioinformatiikan analyysi osoittaa 50, 9, ja 70 721 ihmisen miR
geenien miRbase (Release 14.0) sijaitsevat vastaavasti sisällä, reunustavat, ja lähellä CpG-saarekkeiden (joihin me puhuvat näistä miR
CpG-saarekkeiden; Additional tiedosto 1: Taulukko S1). Oletamme, että poikkeava metylaatio miR
CpG-saarekkeiden voi esiintyä kehittymistä ja etenemistä syöpiä. Siksi niitä voidaan käyttää kandidaattigeenit paitsi ennustaminen syövän ennuste, vaan myös tutkimus metylaation-ilmaisun yhdistys in vivo
. Siten CpG saaret 9 sairauteen liittyvien miR
geenejä, mukaan lukien 5 extragenic miR
geenejä tai geenien klustereita (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b /200A /429
, miR-203
, ja miR-375
) ja 4 geeninsisäiset geenejä tai geenien klustereita (miR-9-1
, miR-34b /c
, miR-193B /365 -1
, ja miR-210
), valittiin edustajana geenejä esillä olevassa tutkimuksessa (Additional tiedosto 1: Taulukko S1). Metylointi-ilmaisun yhdistys 3 näistä miR
geenejä ei ole aiemmin vahvistettu (Additional tiedosto 1: Taulukko S2) [12, 14, 19-27]. Alussa seulottiin mahakarsinoo- (GC) - tai isäntä liittyvät poikkeavaan miR
metylaatio ja sitten tutkittiin metylointi-ilmaisun yhdistys in vitro
ja in vivo
. Associations välillä kliinis-GC potilaiden ja metylaatio näiden miR
CpG-saarekkeiden analysoitiin myös. Tool Menetelmät
Cell verkkolähteet ja soluviljelmissä
Lähde tietoa käytettyjen solulinjojen tässä tutkimuksessa käytetyt: RKO cell rivi, Dr. Guoren Deng Kalifornian yliopistossa San Franciscossa; SW480 ja HCT116 saatiin Dr. Yuanjia Chen Pekingin unionin Medical College Hospital; MKN74 ja 293 T tarjoamia Tokyo Lääketieteen ja hammaslääketieteen University; PC-3 ostettiin Cell Line pankin Kiinan Academy of Medical Science; HL60 ja KG1A saatiin Hematologia Department of Pekingin yliopiston ensimmäinen sairaala; DU145 saatiin Hanmi Pharmacy Company; Siha tarjosi Pekingin yliopiston Kansan sairaalassa. HepG2 saatiin tohtori Qingyun Zhang, Calu3 ja A549 Dr. Zhiqian Zhang, H1299 ja AGS Dr. Chengchao Shou, MKN45 tri Youyong Lv, ja muut solulinjat (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa ja GES-1) Dr. Yang Ke, kaikki Pekingin yliopiston Cancer sairaala /Institute. Nämä solulinjat viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO 2, käyttäen erilaisia ​​elatusaineita. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1A, A549, H1299, GES-1, HepG2, 293 T, DU145, ja RKO viljeltiin 90% RPMI-1640 ja 10% FBS. PC-3 ja AGS viljeltiin 90% F-12 ja 10% FBS. Calu3, HeLa ja Siha viljeltiin 90% DMEM ja 10% FBS: ää. SW480 ja HCT116-soluja viljeltiin 90% DMEM: RPMI-1640 (1: 1) ja 10% FBS: ää.
Potilaat ja kudosnäytteiden
Kirurginen ensisijainen GC näytteiden ja niiden pariksi ei-syöpä kirurgiset marginaali (SM) näytteet olivat kerätään 112 inpatients (keski-ikä 59,2 vuotta [alue, 32-79], 80 urosta ja 32 naarasta, 78 ei-sydänperäinen GC ja 34 sydämen GC; 40 GC at pTNM vaiheen I ~ II ja 59 vaiheessa III ~ IV) Pekingin yliopiston Cancer sairaala. Seuranta tiedot kaikista potilaista kerättiin vähintään viiden vuoden ajan. Kaikki kliiniset näytteet, sekä histopatologinen ja followup tiedot kulloinkin on saatu mukaan hyväksyttyjen vakiintuneiden ohjeiden. Mahalaukun koepalat 13 terveillä koehenkilöillä ja 38 gastriitti avohoidossa kerätään samassa sairaalassa käytettiin ei-syöpäpotilaan valvontaa. Ennen bisulfiittimodifikaatio kunkin potilaan mahalaukun genomista DNA-näytettä analysoitiin läsnäolo H. pylori
erityisiä 23 S rDNA
PCR-analyysilla, kuten aiemmin on kuvattu [28]. Institutionaalinen Review Boards Pekingin yliopiston Cancer sairaalan ja Institute hyväksyi tutkimuksen (É1041207), ja kaikki potilaat antoivat tietoon suostumus.
DNA: n eristämistä ja bisulfiittimodifikaatio
tasyöpäsolulinja ja kudosnäyte genomista DNA (1,8 ug) eristettiin käyttämällä fenoli /kloroformi-uutolla [29]. Metyloitumattomalla sytosiinijäännöksiä DNA-näytteet muunnetaan urasiilitähteisiin (tulossa tymidiiniä jäämät PCR-tuotteet), lisäämällä 5 M natriumbisulfiittia [30]. Wizard® DNA Clean-Up System Kit (Promega) käytettiin puhdistamiseksi ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta ennen PCR-monistusta.
PCR-monistus ja kvantifiointi miR
CpG-saarekkeen metylaation DHPLC
CpG-free yleispohjamaaliksi sarjaa käytettiin monistamaan miR
CpG-saarekkeiden kuuma käynnistys PCR polymeraasia (Additional tiedosto 1: Kuva S1 ja Additional tiedosto 1: Taulukko S3). Sekvenssit CpG-saarekkeiden upotettuja tai reunustavat nämä liittyvät miR
-geenejä käytettiin suunnittelemaan alukkeita. PCR-tuotteet analysoitiin sitten kvantitatiivisesti DHPLC on Wave® DNA-fragmentin Analysis System [31]. Eluutioprofiileja Mir-9-3
, miR-200b
, ja miR-203
metylaatio analysoitiin ultravioletti detektori muut miR
geenin metylaatio havaittiin post pylväs HSX-3500 lisälaite (Transgenomic, Inc., Omaha, USA) ja korkea-herkkyys fluoresenssin (FL) ilmaisin (viritys 450 nm, emissio 520 nm) [32 ]. Metyloitu ja metyloitumaton miR
-geenin PCR-tuotteet erotetaan DNASep® analyyttiseen kolonniin (Transgenomic) on vastaava osittainen denaturointi lämpötilassa (Additional tiedosto 1: Taulukko S3 ja kuvio S2-10). Piikkien pinta, joka vastaa metyloidut ja metyloitumattomat PCR-tuotteet, joita käytetään laskettaessa osuus metyloitu miR
CpG-saarekkeen [osuus metyloitua kopioiden = metylaatio-piikin pinta-ala /piikin kokonaisalasta], kuten aikaisemmin on kuvattu [33]. M.SssI-
metyloitua genomista DNA: ta verinäytteistä käytettiin positiivisena kontrollina. Kuva 1 DHPLC kromatogrammit ja bisulfiitti sekvensointi 7 miR CpG saaria edustavaa solulinjoissa ja mahalaukun kudosnäytteitä. Sekä ihmisen perifeerisen veren DNA: n (Blood) ja sen M.Sss
I-metyloidut tuotteet (M.BLOOD) käytettiin kontrolleina. Kaikki CpG sivustoja amplikonin kunkin miR
CpG-saarekkeen myös lueteltu edellä tulokset bisulfiitin sekvensointi. Kukin rivi edustaa yhtä klooni; jokainen vaaleanpunainen palkki edustaa metyloitu CpG-sivuston. Vastaava kromatogrammi kutakin sekvensoitiin näytteen (oikea palsta) näkyy (vasen sarake).
Bisulfiittimodifiointi klooni-sekvensointi
Fresh PCR-tuotteiden miR
CpG-saarekkeiden monistettiin CpG-vapaa yleispohjamaaliksi sarjaa kloonattiin kanssa pGEM-T Easy kit (Promega, Madison, USA) ja sekvensoitiin Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer klo SinoGeneMox Company (Peking, Kiina).
RNA: n ja havaitseminen kypsä miRNA tason kvantitatiivinen RT-PCR-määritykset
Yhteensä 50 ng RNA uutettiin tuoreista kudosnäytteistä tai solulinjoja käyttäen TRIzol reagenssia (Life Technologies, Carlsbad, USA) valmistajan protokollan. Vastaava cDNA näytteitä syntetisoitiin käyttäen TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies), jossa miR
erityisiä varsi-silmukka käänteisen transkription (RT) alukkeita (spesifinen miR-375
# RT000564, miR-34b
# RT000427, miR-137
# RT000593, ja miR-9
# RT000583). RT käytetyt olosuhteet olivat 16 ° C: ssa 30 min ➔ 42 ° C: ssa 30 min ➔ 85 ° C: ssa 5 min. Mirna tasot analysoitiin sitten käyttäen TaqMan Gene Expression Master Mix Kit (Life Technologies) kanssa, joka vastaa koettimen ja alukkeita (Life Technologies, miR-375
# TM000564, miR-34b
# TM000427, miR-137
# TM000593 ja miR-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # RT001093 ja # TM001093) käytettiin sisäisenä viitteenä. PCR-syklien olivat 95 ° C: ssa 10 min ➔ seurasi 40 sykliä 95 ° C 20 sek ➔ 60 ° C: ssa 1 min. Ekspressiotasot miR-200b
ja miR-210
määritettiin käyttämällä standardia polyA RT-PCR-määritystä. Sekvenssit RT sovittimen pohjamaali, universaali käänteinen pohja- ja U6
pohjamaali säännölliseen polyA RT-PCR-määritys on esitetty Additional tiedosto 1: Taulukko S5. RT-olosuhteet olivat 55 ° C 5 min ➔ seurasi 25 ° C: ssa 10 min ➔ 42 ° C: ssa 1 tunnin ajan ➔ ja 70 ° C: ssa 5 min. PCR-syklien olivat 95 ° C: ssa for10min ➔ seurasi 40 sykliä 95 ° C 20 sek ➔ ja 61 ° C 1 min.
Tilastollinen analyysi
SPSS 16.0 Trend
-testin ja Pearsonin Chi neliö testiä käytettiin analysoimaan miR
metylaatio taajuus ero normaalin koepaloja, gastriitti vaurioita, GC ja SM näytteitä. Kruskal-Wallisin H
-testin ja One-Way ANOVA käytettiin analysoimaan miR
metylaatio suhteessa eroja normaalin koepaloja, gastriitti vaurioita, GC, ja SM näytteitä. Fisherin testiä, Pearsonin Chi-square testi, ja Trend
-testi käytettiin analysoimaan yhdistyksen välillä miR
metylaatio positiivisten ja kliinis. Mann-Whitneyn U
-testin ja Studentin t
-testiä käytettiin analysoitaessa yhdistyksen välinen osuus metyloitua miR
alleelit ja kliinis. Kaplan-Meier ja Cox-suhteellisten riskien menetelmiä käytettiin yhden ja usean analyysi verrata eloonjäämisaste GC potilaalla on eroja metylaatiostatuksen miR
CpG-saarekkeiden. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia, ja P
< 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.
Tulokset
karakterisointi metylaatio tai demetylaation 6 miR
CpG-saarekkeiden kehittämiseen liittyvät GC
Me monistettiin ui bisulfiittikäsiteltyä malleja 9 edustavan miR
CpG-saarekkeiden CpG--free-alukkeita ja kehitetään 9 DHPLC määrityksissä analysoida metylaatiostatuksen, että CpG-saarekkeiden PCR-tuotteiden 4 geeninsisäinen miR
geenejä (miR-9-1
, miR-34b
, miR-193B
, miR-210
) ja 5 extragenic miR
geenejä (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b
, miR-203
ja miR-375
), vastaavasti (kuvio 1, Additional tiedosto 1: Taulukko S3, ja Additional tiedosto 1: Kuva S1-S10). Nämä DHPLC analyysit paljastivat, että metylaatio positiivinen nopeudella 5 miR
CpG-saarekkeiden (miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, ja miR-210
) on merkittävästi lisääntynyt samanaikaisesti vakavuuden patologisia muutoksia vatsassa. Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että metylaatio näistä miR
CpG-saarekkeiden liittyy kehittämiseen GC (suuntaus
-testi, miR-9-1
, P <
0,001, miR-9- 3
, P <
0,001, miR-34b
, P =
0,008; miR-137
, P <
0,001, miR-210
, P
= 0,001; taulukko 1). miR-9-1
metylaatio havaittiin 18 28 GC (herkkyys, 64%), mutta vain 2 48 normaali tai gastriitti koepaloja osoitti metylaatio (spesifisyys, 96%). Vaikka metylaatio miR-200b
havaittiin lähes kaikissa mahalaukun kudosnäytteistä, osuus metyloitu miR-200b
normaaleissa tai gastriitti kudoksissa (46% ~ 100%), oli merkittävästi suurempi kuin sekä SM ja GC näytteet (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U
testi, gastriitti koepaloja versus SM, P =
0,001; taulukko 1). Tämä viittaa siihen, että miR-200b
demetylaation oli GC, potilaan tietyn tapahtuman. Bisulfiitti sekvensointi näiden miR
CpG-saarekkeiden vahvisti saadut tiedot DHPLC-analyysi (kuvio 1) .table 1 metylointi tila miR CpG-saarekkeiden mahalaukun limakalvon näytteitä eri patologisia muutoksia GC ja ei-syöpä verrokeilla
miR
CpG-saarekkeiden
Group mahalaukun näytteiden
miR
-Methylation
positiivinen korko
osuus (%) on metyloidut miR
MIR
metylointi-positiivista näytettä
positiivinen aste (%)
χ
2
-arvo
Trend
-testi (P
-arvo)
mediaani
[25% ~ 75%]
Mean
± SD
t /F /χ
2
-arvo
P
-arvo
miR-9-1
Normaali
1/13 (7,7)
27,598
< 0,001
NA
NA
gastriitti
1/35 (2,9)
NA
SM
9/28 (32,1)
17 [13-30]
20 ± 4
t
= -3,039
0,005 g
GC
18/28 (64,3)
29 [19-40]
32 ± 4
miR-9-3
Normaali
6/13 (46,2) B 23,389
< 0,001
38 [31-59]
43 ± 6
F
= 1,639
0,189 h
gastriitti
15/37 (40,5)
43 [36-48]
42 ± 2
SM
26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2
GC
26/28 (92,9)
37 [26-43]
36 ± 2
miR-137
Normaali
5/13 (38,5) B 18,626
< 0,001
10 [4-41]
χ
2
= 8,065
0,045 d
gastriitti
24/38 (63,2)
19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3 g
GC
24/26 (92,3)
36 [20-51]
37 ± 4
miR-34b

Normaali
6/13 (46,2) B 6.947
0,008
13 [7-19]
χ
2
= 0,658
0,883 d
gastriitti
13/36 (36,1)
11 [3-20]
SM
22/28 (78,6)
11 [4-18]
GC
19/28 (67,9)
10 [5-32]
miR-200B
Normaali
13/13 (100) B 0,486
0,922 f
54 [52-83]
χ
2
= 17,883
< 0,001 d
gastriitti
35/36 (97,2)
52 [46-100] e
SM
27/28 (96,4)
44 [40-47]
GC
27/28 (96,4)
48 [40-53]
miR-210

Normaali
2/13 (15,4) B 11,908
0,001
NA
NA
gastriitti
13/38 (34,2) B 7 [ ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81,5)
11 [5-22]
GC
16/27 (59,3) B 9 [4-16]
miR-193B
Normaali
0/13
7,045
0,008 b
NA
NA
gastriitti
2/37 (5,4) b NA
SM
7/28 (25,0) B 5 [4-14]
GC
4/28 (14,3) B 5 [2-12]
asennuspalveli- 203
Normaali
5/13 (38,5) b 5,617
0,018 b
32 [29-75]
χ
2
= 2,957
0,398 d
gastriitti
20/38 (52,6)
31 [26-36]
SM
21/28 (75,0)
34 [30-36]
GC
11/28 (39,3) c
32 [29-35]
miR-375
Normaali
0/13
12,266
< 0,001 b
NA
NA
gastriitti
13/38 (34,2) B 3 [3-4] e
SM
16/28 (57,1) B 7 [4 -14]
GC
8/28 (28,6) c
17 [8-21]
a, Trend
testi, joukossa Normaali, gastriitti, SM ja GC näytteitä; b, Trend
-testi, joukossa Normaali, gastriitti, ja SM näytteitä; c, Pearsonin Chi-square testi, GC vs. SM: miR-203
, χ
2
= 7,292, P =
0,007; miR-375
, χ
2
= 4,667, P =
0,031; d, Kruskal-Wallisin H
-testi; e, Mann-Whitney U
-testi: Gastriitti vs. SM, miR-200b
, U
= 230.000, P =
0,001; Gastriitti vs. GC, miR-375
, U
= 46.000, P =
0,011; SM vs. GC, miR-137
, U
= 170,000, P
= 0,009; f, Pearsonin Chi-square testi, joukossa Normaali, gastriitti, SM ja GC näytteitä; g. Parilliset t
-testi: SM versus GC, miR-137
, t
= -2,652, P =
0,014; h. Yksisuuntainen ANOVA; NA, ei ole saatavilla.
Paitsi miR-9-1
ja miR-137
, metylointi positiivinen hintoja tai osuudet metyloitu miR-9-3
, miR-34b
, miR-210
, ja miR-200B
in GC olivat samanlaiset kuin SM (taulukko 1). Validoida jos metylaatio jotkut näistä miR
geenit on kentällä vaikutus tapahtuu samanaikaisesti sekä syöpä- ja ei-syöpäsolujen kudosten vatsassa johtuu samasta altistumista ympäristön tekijät, olemme havainneet metylointi data toisessa alaryhmässä GC ja SM näytteitä 84 potilaista ja totesi, että positiivinen nopeus ja osuus metyloitu miR-9-1
in GC oli vielä huomattavasti korkeampi kuin SM (60,7% vs. 32,1%; Pearsonin khiin neliö -testi, P =
0,001; Sign rank testi, P
< 0,001; Additional tiedosto 1: Taulukko S4, Subset-2). Keskimääräinen osuus metyloitua miR-137
oli myös merkitsevästi suurempi GC kuin SM (Mean
± SD
, 26 ± 2 versus 38 ± 2, Parilliset t-
testi, P <
0,001). Kuten odotettua merkittävää eroa positiivisten määrä tai osuus metyloitua miR-9-3, miR-34b
, miR-210
, ja miR-200B
ei havaittu välillä GC ja SM näytteitä. Nämä tulokset vahvistivat, että miR-9-1
ja miR-137
metylaatio oli kasvain-spesifisen tapahtuman, ja että miR-9-3
, miR-34b
, ja miR-210
metylaatio, sekä miR-200B
demetylaation, oli kentällä vaikutus, joka tapahtui mahasyövän.
Lisäksi positiivinen määrä metyloitu miR-203
ja miR-375
asteittain normaalitilasta gastriitti SM näytteitä, mutta laskivat merkittävästi vuonna GC verrattuna SM (Pearson Chi-square test, miR-203
, P =
0,007; miR-375
, P =
0,031; Pöytä 1). Vuonna Subset-2 näytettä, analysoimme myös miR-375
metylaatio ja löysi lisää miR-375
metylaatio SMS kuin GC uudelleen (Pearson Chi-square testi, P =
0,034; Additional tiedosto 1 Taulukko S4). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-375
(ja miR-203
) metylaatio ei GC-spesifisiä ja ne voivat olla yksi sellainen isäntä sopeutumista ei-pahanlaatuisten kudosten kehittämiseen GC.
MiR
metylaatio ja H. pylori
infektio
Voit selvittää helikobakteeri
infektio on rooli miR
metylaatio, etsimme helikobakteeri
erityisiä 23 S rDNA
mahalaukun genomisista DNA-näytteistä PCR ja totesi, että H. pylori
positiivisia nousi samanaikaisesti vakavuuteen patologisten muutosten [15,4% (2 13) normaalin mahalaukun koepaloja, 52,6% (20 38) gastriitti vaurioita, ja 69,0% (29 42) SM koepaloja; suuntaus
-testi, P =
0,001] ja laski GC näytteistä (18 42 = 42,9%; GC vs. SM, Pearson Chi-square test, P
= 0,016; Additional tiedosto 1: Kuva S11 ). Helikobakteeri
positiivisten gastriitti /normaali ja SM näytteet osoittivat merkittävästi korkeampia metylaation miR-210
metylaatio kuin H. pylori
-negatiivinen näytteet (P
= 0,036 ja 0,022, vastaavasti, kuvio 2A ja B). Kuvio 2 vertailu miR metylaation eri mahan limakalvoa näytteitä ja niillä ei ole helikobakteeri. (A) Normaali tai gastriitti koepalat ohjaus avohoidossa ilman pahanlaatuinen sairaus; (B ja C) Kirurginen marginaali ja kasvaimen näytteitä potilaista, joilla on mahalaukun karsinooma, vastaavasti; H. pylori-spesifinen 23 S rDNA
havaittiin PCR: llä.
Käänteistä suhdetta miR
metylaation CpG-saarekkeiden ja niiden vastaavia ekspressiotasot
tutkimiseksi välisen suhteen edellä poikkeava miR
metylaatio ja transkription vastaavan miR
geenin, me määrällisesti kypsä miRNA tasot miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, miR-210
, miR-200b
, (ja miR-375
), jonka metylaatiostatus liittyy kehittämiseen GC (ja GC isäntä sopeutumista), kuten edellä on kuvattu, joukko ihmisen solulinjat, joilla on eri metylaatiostatuksen miR
CpG-saarekkeiden. Metylaatiostatuksen Kunkin miR
CpG-saarekkeen näissä solulinjoissa määritettiin DHPLC kuten on kuvattu Muihin tiedosto 1: Kuva S2-S10. Kvantitatiivisen RT-PCR-määritykset osoittivat, että testatut solulinjat sisältävät metyloitua miR
alleelit kypsä miRNA tasot kaikki 6 GC liittyvät miR
geenejä ja yksi vastaanottava sopeutumista miR
geenin olivat merkittävästi alhaisemmat kuin havaittu solulinjoissa, jotka sisältävät metyloimattomia miR
alleelit (kuvio 3A-G). Kuvio 3 suhde ekspressiotaso ja metylaatiostatuksen miR geenien ihmisen solulinjoissa ja mahalaukun kudosnäytteistä. (A-G) korrelaatio analyysi välinen metylaatio osuus miRNA CpG-saarekkeiden ja niiden kypsä miRNA ekspressiotasot kohde CpG-saarekkeen metyloitu ja metyloitumaton ihmisen solulinjoissa; (H-P) ilmentäminen miRNA 20 pariksi, tuore mahasyöpä näytteitä; (U) Target-CpG-saarekkeen metyloitumattomia solulinjoissa; (M) Target-CpG-saarekkeen metyloitu solulinjoissa; (U /M) Target-CpG-saarekkeen osittain metyloitu solulinjoissa.
Olemme edelleen analysoineet miRNA tasot 20 paria tuoreita GC ja SM näytteitä ja löysivät merkittävästi korkeampi ilmentymistaso miRNA-200b,
miRNA-375, ja miRNA-210 SM kuin GC (Pariksi t
-testi: Ps
≤0.030; Additional tiedosto 1: Kuva S12). Mirna-137 pitoisuuksia SM olivat myös korkeammat kuin GC, mutta ei ollut tilastollisesti merkitsevä (P =
0,059). Ilmaisu tasot miRNA-9 ja miRNA-34b oli samanlainen tekstiviestit ja GC. Tärkeintä on, käänteinen suhde miR
metylaation ja vastaava ekspressiotaso havaittiin miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
, ja miR-200b
näissä mahalaukun kudosnäytteistä (Spearmanin Rank Correlation analyysi, miR-9-1
, r
s
= -0,533, P =
0,001; miR-9-3
, r
s
= -0,464, P =
0,004; miR-137
, r
s
= -0,378, p =
0,019, miR-200B
, r
s
= -0,409, P =
0.010, kuvio 3H-K). Heikko käänteinen metylointi-ilmentymisen suhteen havaittiin myös miR-375
näissä kudosnäytteistä (r
s
= 0,287, P =
0,085; Kuva 3O). Tällaisen suhteen ei havaittu miR-34b
ja miR-210
(kuvio 3L, N).
MiR
metylaatio korreloi kliinis ominaisuuksien GC potilaiden
Tutkia mahdollisuutta käyttäen miR
Metylointia ennusteen ennustaja GC, määritimme esiintyvyys metylaation 7 miR
geenien ja analysoidaan suhdetta kliinis-GC ja vastaava metylaatiotasoilla näiden miR
CpG-saarekkeiden tutkittu yllä kaikkia 112 GC potilasta (taulukko 2 ja Additional tiedosto 1: Taulukko S6). features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive pylori
infektio.

• Läsnäolo S100A9-positiivisten tulehdussolujen syöpäkudoksiin korreloi varhaisessa vaiheessa syöpä ja parempaan ennusteeseen potilailla, joilla on mahalaukun cancer
• Onko siirto Helicobacter pylori ihmiseen aiheuttavat TAUTIPESÄKKEISTÄ pesäke raita-edessään Dunnarts (Sminthopsis macroura)?