Charakterizácia ľudského žalúdka metylácie karcinóm súvisiace s 9 Mir CPG ostrovov a potlačenie ich výrazov in vitro a in vivo

charakterizácia ľudského žalúdka metylácie karcinóm súvisiace 9. mier
CPG ostrovov a potlačenie ich výrazov in vitro
a in vivo
spoločností abstraktné
pozadia
Mnoho Mir
gény sú umiestnené vo vnútri alebo okolo CPG ostrovov. Nie je jasné, či metylácie týchto CPG ostrovov potláča Mir
transkripciu pravidelne. Cieľom tejto štúdie je charakterizovať žalúdočné karcinóm (GC) by preto metylácie mier
CPG ostrovov a jeho vzťah s Mirna výrazom.
Metódy
metylácie stave z 9. reprezentatívneho mier
CPG ostrovov v panel bunkových línií a žalúdočných vzorky ľudského (vrátane 13 normálnych biopsiou, 38 gastritídy biopsia, 112 párov GC a ich vzorky chirurgických marža) bola analyzovaná bisulfitového dHPLC a sekvenovania. Hladiny zrelých miRNA boli stanovené pomocou kvantitatívnej RT-PCR. Vzťahy medzi mir
metylácie, transkripcii, vývoj GC, a klinicko-patologické charakteristiky boli štatisticky analyzované.
Výsledky
Metylácia frekvencie 5 mier
CPG ostrovy (MIR-9-1
, MIR-9 -3
, mier-137
, MIR-34b stroje a Mir-210
) postupne zvyšoval, zatiaľ čo podiel metylovaného MIR-200b
počas žalúdočné karcinogenéze postupne znižoval (Ps
< 0,01). Viac MIR-9-1
metylácie bola zistená u 62% -64% vzoriek GC a 4% normálnych alebo gastritídy vzoriek (18/28 oproti 2/48; pomer šancí, 41,4; P Hotel <0,01). MIR-210
metylácie vykazoval vysokú koreláciu s H. pylori
infekcie. MIR-375
, MIR-203 stroje a Mir-193b
metylácie môže byť hostiteľ adaptácie na vývoj GC. Metylácie týchto Mir
CPG ostrovov bola dôsledne preukázané, že výrazne znížiť primeranej úrovne miRNA uvedené v ľudských bunkových líniách. Inverzný vzťah bol tiež pozorovaný u MIR-9-1
MIR-9-3
, MIR-137 stroje a Mir-200b
v žalúdočných vzoriek. Medzi 112 pacientmi GC, MIR-9-1
metylácie bol nezávislý priaznivý prediktor celkového prežitia pacientov GC ako jednorozmerné a viacrozmerné analýzy (P Hotel < 0,02).
Závery
Na záver , zmena metylačného statusu 6 z 9 testovaný mier
CPG ostrovov bola charakterizovaná v žalúdočnej rakoviny. MIR-210
metylácie koreluje s H. pylori
infekcie. MIR-9-1
metylácie môže byť udalosť, GC-špecifické. Metylácie Mir
CPG ostrovy môžu významne pravidelne down-regulovať ich transkripciu.
Pozadie
miRNA sú hojné trieda malých nekódovacích RNA, ktorá hlavne regulujú génovú expresiu na posttranskripční úrovni. Oni hrajú kľúčovú úlohu pri obnove a diferenciáciu kmeňových buniek a pomáha udržiavať bunkovej línií. Predchádzajúce výskumy ukázali, že v rakovine viac z MIR
génov, ako sú MIR-200b /200A /429
MIR-21
, MIR-30b
, MIR-30d
, MIR
-31 a mier-423
sú up-regulované, zatiaľ čo ostatné Mir
gény, ako je MIR-143 stroje a Mir-145 sa
downregulated [1-3]. Dôkazy naznačujú, že zmeny v expresii miRNA sa často vyskytujú v mnohých nádorov a tieto zmeny buď prispievajú k karcinogenézy alebo odrážať rozvoji a progresii rakoviny.
Existuje celý rad ciest, ktoré môžu mať vplyv na hladinu zrelých miRNA v bunkách a tkanivách, ako je napríklad génovej amplifikácie alebo delécie, transkripčný up-regulácia alebo zníženie expresie, post-transkripčný spracovanie a degradácie miRNA [4-7]. Je dobre známe, že niektoré intragenic MIR
génov, ako sú napríklad Mir-218-2
, sú transkribovaných koordinovane s hostiteľskými génmi prostredníctvom spoločné regulačné mechanizmy [8]. Avšak, mnoho Mir
gény sú extragenic a určitý podiel intragenic MIR
génov, ako sú MIR-9-1
sú transkribovaných v géne nezávislý vzore hostiteľskej [9]. Vzhľadom k tomu, presný promotorová oblasť väčšiny Mir
gény nie sú charakterizované, a to najmä s ohľadom na extragenic Mir
génov, presné regulačné mechanizmy MIR
transkripcie nie sú zďaleka jasné.
Metylácie alebo hypermetylace z CPG ostrovy v oblasti transkripcia začína miest (TSS) je všeobecne uznávaná potláčať génovú transkripciu epigenetické. Na rozdiel od génov kódujúcich proteíny, ktoré sa môžu zahŕňajúce viac ostrovy CPG je mier
gény môžu byť kratšie, než CPG ostrova, a v niektorých prípadoch, roztrúsená Mir
gény (tj Mir
zoskupenie génov) môže byť sa nachádza vo vnútri alebo lemujúce jednu CPG ostrova (ďalší súbor 1: Tabuľka S1). Aberantne metylácie CPG ostrovov spojených s Mir
génov, ako je napríklad let-7a-3 stroje a Mir-34a
, je často pozorované u mnohých druhov rakoviny [10, 11]. Bolo navrhnuté, že metylácia CPG ostrovov, ktoré sú spojené s Mir
génmi (tj MIR-203
, MIR-152
, MIR-124-1
, MIR-34b /c
, mier-129-2
, MIR-9-1
, MIR-130b
, MIR-124-2 stroje a Mir-181c
) by mohlo negatívne koreluje s ich hladiny expresie [12-17]. Avšak, tiež transkripciu Mir
génov je pravidelne ovplyvnená metylačného statusu CPG ostrovy mier
nebola systematicky študované.
Je dobre známe, že abnormálne metylácie alebo demetyláciu CPG ostrovov v malej podiel (menej ako 1%) z bunkovej populácie môžu byť citlivo detekované v bunkových vzoriek heterozygotných tkanív. To ukazuje na výhodu metylačnej analýzu cez zmeny génovej expresie na úrovni RNA a proteínov, ktoré môžu byť detekované iba vtedy, keď je prítomný vo veľkej časti populácie buniek vo vzorke [18] Také zmeny. Naše bioinformatiky analýza ukazuje, 50, 9, a 70 721 ľudských Mir
génov v miRbase (Release 14,0) sa nachádzajú, respektíve vo vnútri, lemovať a neďaleko CPG ostrovov (spoločne sa budeme odkazovať na tieto ako Mir
CPG ostrovy; ďalšie súbor 1: Tabuľka S1). Predpokladáme, že môže dôjsť k aberantne metylácie CPG ostrovov Mir
pri rozvoji a progresii rakoviny. Z tohto dôvodu by mohli byť použité ako kandidátnych génov nielen pre predikciu prognózy rakoviny, ale aj pre vyšetrovanie metylácie-expresie združenia in vivo
. To znamená, CPG ostrovy 9 Mir
génov súvisiacich s chorobou, vrátane 5 extragenic Mir
génov alebo génových klastrov (Mir-9-3
MIR-137
, MIR-200b /200A /429
, mier-203 stroje a Mir-375
) a 4 intragenic gény alebo génové klastre (mir-9-1
, MIR-34b /c
, MIR-193b /365 -1 stroje a Mir-210
), boli vybrané ako reprezentatívne génov v tejto štúdii (ďalší súbor 1: Tabuľka S1). Metylácia expresia združenie pre 3 z týchto Mir
génoch doteraz nebola stanovená (dodatočný súbor 1: Tabuľka S2) [12, 14, 19-27]. Pôvodne sme boli vyšetrení na žalúdočného karcinómu (GC) - alebo hosť-súvisiace úchylné MIR
metylácie a potom vyšetrovala metylácie-výraz združenia in vitro stroje a in vivo
. Asociácia medzi vlastnosťami klinicko pacientov GC a metylácie týchto mier
CPG ostrovy boli tiež analyzované
metódy
zdroje bunkové línie a bunková kultúra
informačný zdroj použitých bunkových línií použitých v tejto štúdii :. RKO buniek linka, za predpokladu, Dr Guoren Deng na University of California San Franciscu; SW480 a HCT116 boli poskytnuté Dr. Chen Yuanjia na Medical College Hospital Peking Únie; MKN74 a 293 T za predpokladu, Tokio lekárov a zubných lekárov University; PC-3 bola zakúpená od bunkové línie Bank na čínskej akadémie lekárskych vied; HL60 a KG1A boli získané z Ústavu hematológie Pekinskej univerzite prvého nemocnice; DU145 bola získaná z Hanmi Farmaceutická Company; SIHA- bola poskytovaná Peking University ľudovej nemocnice. HepG2 bola poskytnutá Dr. Qingyun Zhang, Calu3 a A549 Dr Zhiqian Zhang, H1299 a AGS Dr Chengchao Shou, MKN45 Dr. Youyong LV, a ďalšie bunkové línie (SGC7901, BGC823, MGC803, Hela a GES-1) Dr. Yang Ke, to všetko na Pekinskej univerzite Cancer Hospital /Institute. Tieto bunkové línie boli kultivované pri 37 ° C v 5% CO 2, za použitia rôznych živných pôdach. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1A, A549, H1299, GES-1, HepG2, 293 T, DU145 a RKO boli kultivované v 90% RPMI-1640 a 10% FBS. PC-3 a AGS boli kultivované v 90% F-12 a 10% FBS. Calu3, Hela a siha boli kultivované v 90% DMEM a 10% FBS. SW480 a HCT116 boli kultivované v 90% DMEM: RPMI-1640 (1: 1). A 10% FBS
Pacienti a vzorky tkaniva
Chirurgické vzorky primárnej GC a ich spárované non-rakovinové chirurgických okrajov vzorky (SM) boli zhromaždené z 112 hospitalizovaných pacientov (priemerný vek 59,2 rokov [rozsah, 32 - 79]; 80 mužov a 32 žien, 78 nekardiálna GCS a 34 srdcových GC 40 GCs na pTNM fáze I ~ II a 59 vo fáze III ~ IV) na Peking University Hospital rakoviny. Nadväzujúce dáta pre všetkých pacientov bola odobratá najmenej päť rokov. Všetky klinických vzoriek, rovnako ako histopatologické a následku informácie pre každý jednotlivý prípad boli získané v súlade so schválenými inštitucionálnymi smernicami. Žalúdočné biopsie od 13 zdravých dobrovoľníkov a 38 gastritídy ambulantných pacientov odobratých z rovnakej nemocnice boli použité ako kontroly pacientov bez nádorového ochorenia. Pred bisulfitová modifikácia bola žalúdočné genomická DNA vzorka každého pacienta analyzuje na prítomnosť H. pylori
-specifických 23. S rDNA
podľa testu PCR, ako bolo opísané skôr [28]. Inštitucionálne Review senáty Peking University Hospital Cancer Institute a schválil štúdii (É1041207), a všetci pacienti dal písomný informovaný súhlas.
Extrakciu DNA a bisulfitová modifikácie
Rakovina bunkové línie a vzorku tkaniva genomickej DNA (1,8 ng) bola izolovaná za použitia extrakcie zmesou fenol /chloroform [29]. Tieto nemethylované cytosinové zvyšky vo vzorkách DNA sa prevedú na zvyšky uracilu (stávajú tymidínu rezíduí v produktoch PCR) sa pridá 5 M síranu sodného [30]. Wizard® DNA Clean-Up System Kit (Promega) bol použitý pre čistenie hydrogensiričitanovú upravené DNA pred PCR amplifikácie.
PCR amplifikácie a kvantifikácia Mir
CPG ostrovný metylácie podľa dHPLC
CPG bez univerzálny primer súpravy boli použité na zosilnenie Mir
CPG ostrovov hot-štart PCR polymerázou (ďalší súbor 1: Obrázok S1 a ďalší súbor 1: Tabuľka S3). Sekvencia CPG ostrovov vložených alebo lemované týchto súvisiacich Mir
gény boli použité k návrhu primérov. PCR produkty boli potom kvantitatívne analyzuje dHPLC na Wave fragment DNA Analysis System [31]. Elučné profily MIR-9-3
MIR-200B stroje a Mir-203
metylácie bola analyzovaná s ultrafialovým detektorom; iné Mir
gén metylácie bola detekovaná s kolónou HSX-3500 s príslušenstvom (Transgenomic, Inc., Omaha, USA) a vysokej citlivosti fluorescencie (FL) detektora (excitácia pri 450 nm, emisie pri 520 nm) [32 ]. Methylata a nemethylovaný Mir
génu PCR produkty boli oddelené DNASep® analytickej kolóne (Transgenomic) na zodpovedajúce čiastočné denaturáciu teplote (ďalší súbor 1: Tabuľka S3 a Obr S2-10). Plochy vrcholov zodpovedajúcich metylesterov a nemethylovaných PCR produktov boli použité pre výpočet pomeru metylovaného mier
CPG ostrova [podiel metylovaných kópií = metylácie-píku /celková plocha vrcholu], ako bolo opísané skôr [33]. M.SssI-
methylata genomická DNA z krvných vzoriek bola použitá ako pozitívna kontrola. Obrázok 1 dHPLC chromatogramy a bisulfite sekvenovania 7 Mir CPG ostrovov v reprezentatívnych bunkových línií a vzoriek žalúdočnej tkaniva. Ako periférne DNA z ľudskej krvi (krv) a jeho M.Sss
I-metylovaného produktov (M.BLOOD) boli použité ako kontroly. Všetky CPG miest v amplikónu každej Mir
CPG ostrova sú tiež uvedené nad výsledkami hydrogensiričitanom sekvencovania. Každý riadok reprezentuje jeden klon; ružová každý stĺpec predstavuje methylata CPG miesto. Zodpovedajúce chromatogram každej vzorky sekvenovania (pravý stĺpec) je uvedený (ľavý stĺpec).
HYDROGENSIRIČITANOV klon-sekvenčné
Fresh PCR produkty mier
CPG ostrovy amplifikovanej s CPG-voľne univerzálnych primérov boli klonované s pGEM-T Easy kit (Promega, Madison, USA) a sekvenované s Applied Biosystems 3730xl DNA analyzátora na SinoGeneMox Company (Peking, Čína).
Extrakcia RNA a detekcie hladiny zrelé miRNA s kvantitatívnej RT-PCR
Celkom 50 ng RNA bola extrahovaná zo vzoriek čerstvých tkanív alebo bunkových línií za použitia činidla TRIzolu (Life Technologies, Carlsbad, USA) podľa protokolu výrobcu. Zodpovedajúce vzorky cDNA boli syntetizované s použitím TaqMan microRNA reverznej transkripcie Kit (Life Technologies) s Mir
-specifických kmeňových slučka inverznej transkripcie (RT) priméry (špecifické pre mier-375
# RT000564, MIR-34b
# RT000427, MIR-137
# RT000593 a mier-9
# RT000583). Podmienky RT boli použité 16 ° C počas 30 min ➔ 42 ° C počas 30 min ➔ 85 ° C po dobu 5 min. Hladiny miRNA boli následne analyzované za použitia TaqMan Gene Expression Master Mix kit (Life Technologies) s príslušnou sondou a primery (Life Technologies, MIR-375
# TM000564, MIR-34b
# TM000427, MIR-137
# TM000593 a mier-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # RT001093 a # TM001093) bol použitý ako vnútorná referencia. Cyklovanie PCR podmienky boli 95 ° C počas 10 min ➔ nasledovalo 40 cyklov 95 ° C počas 20 sekúnd ➔ 60 ° C po dobu 1 min. Hladiny expresie MIR-200b stroje a Mir-210
boli stanovené za použitia štandardného testu poly RT-PCR. Sekvencia primeru adaptéra RT, univerzálne inverzný primeru a U6
primeru v pravidelnom teste poly RT-PCR sú uvedené v ďalšej súbor 1: Tabuľka S5. RT podmienky boli 55 ° C počas 5 min ➔ nasleduje 25 ° C počas 10 min ➔ 42 ° C po dobu 1 hodiny ➔ a 70 ° C po dobu 5 min. Cyklovanie PCR podmienky boli 95 ° C for10min ➔ nasledovalo 40 cyklov 95 ° C počas 20 sekúnd a 61 ° ➔ C počas 1 min.
Štatistická analýza
SPSS 16.0 Trend
-test a Pearsonovho Chi- kvadrát test boli použité na analýzu Mir
metylácie frekvenčný rozdiel medzi normálnou biopsiou, gastritídu lézie, GC a SM vzoriek. Kruskal-Wallis H
-test a One-Way ANOVA boli použité na analýzu Mir
metylácie podiel rozdielov medzi normálnymi biopsiou, gastritídu lézie, GC, a vzorky SM. Fisherov presný test, Chi-kvadrát test Pearsona a Trend
-test boli použité na analýzu asociáciu medzi mier
metylácie pozitívne tempo a klinicko-patologické rysy. Mann-Whitneyho U test stroje a Student t-test
boli použité na analýzu súvislosť medzi podielom metylovaných Mir
alel a klinicko-funkcií. Boli použité Kaplan-Meierovej a Cox-pomerného rizika metódy pre jednorozmerné a viacrozmerné analýzy porovnať celkové prežívanie pacientov GC s rozdielmi v metylačného statusu Mir
CPG ostrovy. Všetky štatistické testy boli obojstranné a P Hotel < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.
Výsledky
Charakterizácia metylácie alebo demetylácie 6 mier
CPG ostrovov v súvislosti s rozvojom GC
amplifikovaného sme bisulfitová liečených šablóny 9 reprezentatívnych mier
CPG ostrovov s CPG-voľné primery a vyvinuli 9 dHPLC testy na analýzu metylačného statusu CPG ostrovov v PCR produktoch 4 intragenic Mir
génov (Mir-9-1
, MIR-34b
, MIR-193b
, mier-210
) a 5 extragenic Mir
gény (MIR-9-3
, MIR-137
, MIR-200b
, Mir-203 a
MIR-375
), v danom poradí (obrázok 1, Ďalšie súbor 1: Tabuľka S3, a ďalší súbor 1: obrázok S1-S10). Tieto dHPLC testy odhalili, že metylácie pozitívny sadzba 5 mier
CPG ostrovy (MIR-9-1
, MIR-9-3
, MIR-34b
, MIR-137
a mier-210
) sa významne zvýšila súbežne s závažnosti patologických zmien v žalúdku. Tieto zistenia silne naznačujú, že metylácie z nich mier
CPG ostrovov súvisí s rozvojom GC (trend
-test, MIR-9-1
P <
0,001; MIR-9- 3
, P <
0,001; MIR-34b
P = 0,008
; MIR-137
, P <
0,001; MIR-210
, P
= 0,001; tabuľka 1). MIR-9-1
metylácie bola zistená u 18 z 28 GC (citlivosť, 64%), ale iba u 2 z 48 normálnych alebo gastritída biopsia ukázala, metylácii (špecificitu, 96%). Aj keď metyláciou MIR-200B
bola zistená takmer vo všetkých tkanivách vzoriek žalúdočnej podiel metylovaného MIR-200B
v normálnych tkanivách alebo gastritídy (46% až 100%) bola významne vyššia ako v oboch SM a GC vzorky (41% ~ 47%) (Mann-Whitneyho U-
test, gastritída biopsia oproti SMS, P = 0,001
; tabuľka 1). To naznačuje, že mier-200b
demetylácie bol GC, pacient-špecifické udalosti. Hydrogensiričitan sekvenovania týchto mier
CPG ostrovy potvrdzuje, že údaje získané z analýzy dHPLC (obrázok 1) .Table stav 1 Metylácia Mier CPG ostrovov v žalúdku vzorkách sliznice s rôznymi patologickými zmenami v GC a non-rakovinové kontrolných pacientov
Mir
CPG ostrovy
Skupina žalúdočných vzoriek
mier
-Methylation
kladnú mieru
Podiel (v%) metylovaného MIR
v MIR
metylácie-pozitívnych vzoriek
pozitívna sadzba (%)
χ
2
-hodnota
Trend
-test (P-hodnota
)
Median
[25% ~ 75%]
Mean
± SD
t /F /χ
2
-hodnota
P-hodnota
MIR-9-1
Normal
1/13 (7,7)
27,598 Hotel < 0,001 a
NA
neuvádza sa
Gastritída
1/35 (2,9)
NA
SM
9/28 (32,1)
17 [13-30]
20 ± 4
t
= -3,039
0,005 g
GC
18/28 (64,3)
29 [19-40]
32 ± 4
MIR-9-3
Normal
6/13 (46,2)
23,389 Hotel < 0,001 a
38 [31 až 59]
43 ± 6
F
= 1,639
0.189 h
Gastritída
15/37 (40,5)
43 [36-48]
42 ± 2
SM
26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2
GC
26/28 (92,9)
37 [26-43]
36 ± 2
MIR-137
Normal
5/13 (38,5)
18,626 Hotel < 0,001 a
10 [4-41]
χ
2
= 8,065
0,045 d
Gastritída
24/38 (63,2)
19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3g
GC
24/26 (92,3)
36 [20-51]
37 ± 4
MIR-34b

Normálny
6/13 (46,2)
6,947 0,008
systémom
13 [7-19]
χ
2
= 0,658
0,883 d
Gastritída
13/36 (36,1)
11 [3-20]
SM
22/28 (78,6)
11 [4-18]
GC
19/28 (67,9)
10 [5-32]
mir-200b
Normal
13/13 (100)
0,486 0,922
f
54 [52 až 83]
χ
2
= 17,883 Hotel < 0,001 d
gastritída
35/36 (97,2)
52 [46-100] e
SM
27/28 (96,4)
44 [40-47]
GC
27/28 (96,4)
48 [40-53]
MIR-210
Normálny
2/13 (15,4)
11.908
0,001 a
NA
neuvádza sa
gastritída
13/38 (34,2)
7 [ ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81,5)
11 [5-22]
GC
16/27 (59,3)
9 [4-16]
MIR-193b
Normálny
0/13
7.045
0,008 b
NA
neuvádza sa
Gastritída
2/37 (5,4)
NA
SM
7/28 (25,0)
5 [4-14]
GC
4/28 (14,3)
5 [2-12]
spätných 203
Normal
5/13 (38,5)
5,617 0,018
b
32 [29-75]
χ
2
= 2,957
0,398 d
Gastritída
20/38 (52,6)
31 [26-36]
SM
dvadsať jedna dvadsať osmina (75,0)
34 [30-36]
GC
11/28 (39,3) c
32 [29-35]
MIR-375
Normálny
0/13
12.266 Hotel < 0,001 b
neuvádza sa neuvádza sa
Gastritída
13/38 (34,2) Sims 3 [3-4] e
SM
16/28 (57,1)
7 [4 -14]
GC
8/28 (28,6) 17 [8-21] c stroje a trend
test, medzi Normal, gastritídu, SM a vzorky GC; b Trend
-test, medzi Normal, gastritída, a vzorky SM; c, Pearsonovho Chi-kvadrát test, GC proti SM: Mir-203
, χ
2
= 7,292, p = 0,007
; MIR-375
, χ
2
= 4,667, p = 0,031
; d, Kruskal-Wallis H
-test; e, Mann-Whitney U-test
: gastritídu proti SM, MIR-200b
U
= 230,000, P = 0,001
; Gastritída proti GC, MIR-375
U
= 46,000, p = 0,011
; SM proti GC, MIR-137
U
= 170,000, P
= 0,009; f, Pearsonovho Chi-kvadrát test, medzi normálne, gastritída, SM a GC vzoriek; g. Párový t-test
: SM proti GC, Mir-137
t
= -2.652, p = 0,014
; h. Jednosmerný ANOVA; NA, nie sú k dispozícii.
S výnimkou MIR-9-1 stroje a Mir-137
, metylácie pozitívne sadzby alebo podiely metylovaného MIR-9-3
MIR-34b
MIR-210 stroje a Mir-200b
v GC boli podobné tým v SMS (tabuľka 1). Aby bolo možné overiť, či metylácie niektorých z týchto MIR
génov je oblasť, efekt sa deje súčasne v oboch nádorových a non-rakovinové tkanivá v žalúdku kvôli rovnakému vystavenie faktorom prostredia, sme zistili dáta metylačnej v inej podskupine GC a SM vzorky od 84 pacientov a zistili, že pozitívne tempo a podiel metylovaného Mir-9-1
v GC bol stále výrazne vyššia ako v SMS (60,7% oproti 32,1%; Pearsonovho Chi-kvadrát test, p =
0,001; Sign rank testu, P Hotel &0,001; ďalšie súbor 1: Tabuľka S4, sUBSET-2). Priemerný podiel metylesterov MIR-137
bola tiež významne vyššia ako GC SMS (Mean
± SD
26 ± 2 v porovnaní s 38 ± 2, párový t-
test, p <
0,001). Ako sa dalo očakávať významný rozdiel v pozitívnom sadzby alebo podielu metylovaného Mir-9-3, MIR-34b
, MIR-210 stroje a Mir-200b
nebol pozorovaný medzi GC a vzorky SM. Tieto výsledky potvrdili, že mier-9-1 stroje a Mir-137
metylácie bola udalosť tumor-špecifické a že mier-9-3
, MIR-34b stroje a Mir-210
metylácie, ako aj MIR-200B
demetylácia, bol riadené poľom, ku ktorému došlo v priebehu žalúdočnej rakoviny.
Okrem toho pozitívne miera metylovaného MIR-203 stroje a Mir-375
postupne zvyšovali z normálneho do žalúdka o vzorky SM, ale výrazne GC znížil v porovnaní s SMS (Pearson Chi-kvadrát test, MIR-203
, P = 0,007
; MIR-375
, P = 0,031
, Tabuľka 1). V podskupine-2 vzoriek sme tiež analyzovali MIR-375
metylácie a našiel viac MIR-375
metylácie v SM ako u GC znova (Pearson Chi-kvadrát test, p = 0,034
; Ďalší súbor 1 : Tabuľka S4). Tieto údaje naznačujú, že mier-375
(a mier-203
) metylácie nie je GC-špecifické a môže byť jeden druh prispôsobenie hostiteľa v nenádorových tkanív k rozvoju GC.
MIR
metylácie a H. pylori
infekcie
Ak chcete zistiť, či H. pylori
infekcie hrá úlohu v Mir
metylácie, hľadali sme H. pylori
-specifických 23 s rDNA
v vzoriek žalúdočnej genómovej DNA pomocou PCR a zistilo sa, že H. pylori
-pozitívne rýchlosť súčasne sa zvyšuje s závažnosti patologických zmien [15,4% (2 13) normálne žalúdočné biopsia, 52,6% (20 z 38) gastritída lézie, a 69,0% (29 z 42) SM biopsiu; trend
-test, P = 0,001
] a znížil vo vzorkách GC (18 zo 42 = 42,9%; GCs proti SMS, Pearson Chi-kvadrát test, P
= 0,016; Ďalší súbor 1: Obrázok S11 ). H. pylori
-pozitívnych gastritídu /normálny a SM vzorky vykázali významne vyššie metylácie MIR-210
metylácie ako H. pylori
negatívnych vzoriek (P
= 0,036 a 0,022, v uvedenom poradí; Obrázok 2A a B). Obrázok 2 Porovnanie Mier metylácie v rôznych vzoriek žalúdočnej sliznice s a bez existencie H. pylori. (A) Normálna alebo gastritída biopsia z kontrolných ambulantných pacientov bez nádorového ochorenia; (B a C), chirurgických okrajov a nádorových vzoriek od pacientov s karcinómom žalúdka, v danom poradí; H. pylori špecifické pre 23 S rDNA
bola detekovaná pomocou PCR.
Obrátený vzťah medzi Mir
metylácie CPG ostrovov a zodpovedajúcich hladín expresie
Pre zistenie vzťahu medzi vyššie aberantne Mir
metylácie a transkripcie príslušného génu MIR
sme kvantifikované zrelé hladiny miRNA MIR-9-1
, MIR-9-3
, MIR-34b
, MIR-137
, mier-210
, MIR-200B
, (a mier-375
), ktorého metylácie stav súvisí s rozvojom GC (GC a prispôsobenie hostiteľa), ako je opísané vyššie, v sade ľudských bunkových línií s rôznym metylačného statusu mier
CPG ostrovy. Stav metylácie každej mier
CPG ostrova v týchto bunkových línií bol stanovený dHPLC ako je znázornené na ďalší súbor 1: Obrázok S2-S10. Výsledky kvantitatívnej RT-PCR ukázala, že v testovaných bunkových línií obsahujúcich methyluje Mir
alel zrelé hladiny miRNA všetkého 6 GC súvisiace MIR
génov a jeden hostiteľskej prispôsobenie Mir
gén boli výrazne nižšie ako u detekované v bunkových líniách, ktoré obsahujú nemethylovaný Mir
alely (Obrázok 3A-G). Obrázok 3 vzťah medzi úrovňou expresie a metylačného statusu MIR génov v ľudských bunkových línií a vzoriek žalúdočnej tkaniva. (A-G) Analýza korelácie medzi metylácie podielom miRNA CPG ostrovov a ich zrelých hladiny miRNA expresie v cieľovej CPG ostrova methylata a nemethylované ľudských bunkových línií; (H-P) Expresia miRNA v 20 párových, čerstvých vzorkách karcinómu žalúdka; (U) Target CPG ostrova nemethylovaný bunkové línie; (M) Cieľová CPG ostrova methyluje bunkové línie; ostrov (U /M) Cieľová CPG čiastočne methylata bunkové línie.
sme ďalej analyzovali hladiny miRNA z 20 párov čerstvého GC a vzorky SM a bolo zistené, podstatne vyššiu úroveň expresie miRNA-200b,
miRNA-375, a miRNA-210 v SM ako u GC (párový t-test
: Ps
≤0.030; Ďalší súbor 1: Obrázok S12). Hladiny miRNA-137 v SM boli vyššie ako tie, ktoré v GC, ale nebol štatisticky významný (p = 0,059
). Hladiny expresie miRNA-9 a miRNA-34b boli podobné medzi SMS a GC. A čo je najdôležitejšie, bol pozorovaný inverzný vzťah medzi MIR
metyláciou a primeranú úroveň expresie pre mier-9-1
, MIR-9-3
, MIR-137 stroje a Mir-200B
v týchto vzorkách žalúdočné tkanív (Spearmanův Rank Korelačný analýza, MIR-9-1
r
s
= -0,533, p = 0,001
; MIR-9-3
, r
s
= -0,464, p = 0,004
; MIR-137
, r
s
= -0,378, p =
0,019; MIR-200b
, r
s
= -0,409, p = 0,010
; Obrázok 3 H-K). Slabý inverzný metylácie expresie vzťah bol tiež nájdený pre mier-375
v týchto vzorkách tkaniva (r
s
= 0,287, p = 0,085
; obr 3O). Takýto vzťah nebol pozorovaný MIR-34b stroje a Mir-210
(obr 3L, N).
Mir
metylácie koreluje s klinicko-charakteristík GC pacientov
Ak chcete skúmať možnosť pomocou Mir
metylácii ako prognózu prediktor GC sme zistili prevalenciu metylácie 7 MIR
génov a analyzoval vzťah medzi klinicko vlastností GC a zodpovedajúce úrovne metylácie týchto mier
CPG ostrovy študoval features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive pylori
infekciu. Obrázok S2. Tabuľka S1. Tabuľka S2. Tabuľka S3. Tabuľka S4. Tabuľka S5. Tabuľka S7.

• Prítomnosť S100A9-pozitívnych zápalových buniek v nádorových tkanivách koreluje s rakovinou ranej fáze a lepšie prognózou u pacientov s rakovinou žalúdka
• Vedeli Prenos Helicobacter pylori od ľudí vyvolať prepuknutiu choroby v kolónii Stripe tvárou Dunnarts (Sminthopsis macroura)?