Jellemzése humán gyomorkarcinóma kapcsolatos metiláció 9 miR CpG-szigetek és az elnyomás azok kifejezések in vitro és in vivo körülmények között

Jellemzése humán gyomorrák kapcsolatos metilációs 9 miR
CpG szigetek és elnyomása arckifejezésük in vitro és in vivo katalógusa Matton Abstract katalógusa Háttér
Sok miR katalógusa gének belül található, vagy környékén CpG szigeteken. Nem világos, hogy metiiációs ilyen CpG-szigetek elfojtja miR
transzkripciós rendszeresen. A program célja, tanulmány jellemzésére gyomorrák (GC) val kapcsolatos metilációs miR
CpG-szigetek és kapcsolata a miRNS expressziós. Katalógusa módszerek katalógusa Metiláció státusza 9 képviselő miR
CpG-szigetek egy panel sejtvonalak és humán gyomor mintákat (ideértve a 13 normál biopsziák, 38 gyomorhurut biopsziák, 112 párokat glükokortikoid és azok sebészi szél minta) analizáltuk biszulfit-DHPLC és szekvenálási. Érett miRNS szinteket határoztuk meg kvantitatív RT-PCR-rel. Közötti kapcsolatok miR
metilációs, átírás, GC fejlesztés, klinikopatológiai jellemzők statisztikailag elemezzük. Katalógusa Eredmények katalógusa Metiláció gyakorisága 5 miR
CpG-szigetek (miR-9-1 katalógusa, miR-9 -3 katalógusa, miR-137 katalógusa, miR-34b katalógusa, és a miR-210 katalógusa) fokozatosan nőtt, míg az arány a metilezett miR-200b
fokozatosan csökkent során a gyomor carcinogenesis (Zsolt
< 0,01). Több miR-9-1
metiláció volt kimutatható 62% -64% a GC-minta és 4% a rendes vagy a gastritis mintát (18/28 versus 2/48; esély aránya, 41,4; p
<0,01). miR-210 katalógusa metiláció megmutatta magas korrelációt H. pylori fertőzés katalógusa. miR-375 katalógusa, miR-203 katalógusa, és miR-193b katalógusa metiláció lehet host alkalmazkodás fejlődésének GC. Metilezése ezek miR katalógusa CpG-szigetek következetesen kimutatták, hogy szignifikánsan csökkenti a megfelelő miRNS szintek bemutatott humán sejtvonalakban. Az inverz összefüggést figyelhetünk meg miR-9-1 katalógusa, miR-9-3 katalógusa, miR-137 katalógusa, és miR-200b katalógusa a gyomor mintákat. Közül 112 GC betegek, miR-9-1 katalógusa metiláció volt független kedvező előrejelzője a teljes túlélés GC betegek mind egy- és többváltozós analízis (P katalógusa < 0,02). Következtetések katalógusa katalógusa Összefoglalva , megváltoztatása metilációs állapotát 6 9 tesztelt miR
CpG-szigetek jellemezte a gyomorrák kialakulásában. miR-210 katalógusa metiláció korrelál a H. pylori fertőzés katalógusa. miR-9-1 katalógusa metiláció lehet GC-specifikus esemény. Metilezése miR
CpG-szigetek jelentősen le-szabályozzák a transzkripció rendszeresen.
Alapon
miRNS vannak bőséges osztály a kis nem-kódoló RNS-ek, amelyek főként szabályozzák a génexpressziót a poszt-transzkripciós szinten. Ezek kritikus szerepet játszanak a megújulás és őssejtek differenciálódása, és segít fenntartani sejtvonalban. Korábbi kutatások kimutatták, hogy a rák több a miR
gének, mint a miR-200b /200A /429 katalógusa, miR-21 katalógusa, miR-30b katalógusa, miR-30d katalógusa miR -31 katalógusa, és a miR-423 katalógusa felszaporodnak, míg más miR katalógusa gének, mint a miR-143 és miR katalógusa 145. katalógusa van downregulált [1-3]. A bizonyítékok arra utalnak, hogy a változások miRNS expresszió gyakran előforduló számos rák és ezek a változatok vagy hozzájárulnak a karcinogenezis vagy tükrözi az kialakulásában és progressziójában rákok.
Számos az utak, amelyek hatással lehetnek az érett miRNS szinteket a sejtekben és szövetekben, mint például a génamplifikáció vagy deléció, transzkripciós upreguláció vagy downregulációját, transzkripció utáni feldolgozást, és miRNS degradáció [4-7]. Köztudott, hogy néhány intragenikus miR
gének, mint a miR-218-2 katalógusa, összehangolt, átírva a saját gazda génjei révén társszabályozási mechanizmusok [8]. Azonban sok miR katalógusa gének extragenic és egy bizonyos hányadát intragenikus miR
gének, mint a miR-9-1 katalógusa van átírva a fogadó gén független minta [9]. Mivel a pontos promoter régió a legtöbb miR katalógusa gének nem jellemzi, különös tekintettel a extragenic miR
géneket, a pontos szabályozó mechanizmusok miR katalógusa transzkripció messze világos.
Metilezést vagy hipermetiláció CpG-szigetek térségében induló transzkripció oldalak (TSS) általánosan elismert, hogy elnyomják géntranszkripcióban epigenetikusan. Ellentétben fehérjét kódoló gént, amely span több CpG-szigetek, a miR
gének rövidebb lehet, mint egy CpG-sziget, és bizonyos esetekben több miR
gén (azaz egy miR katalógusa géncsoport) lehet belül található, vagy a kísérő egyetlen CpG-sziget (Plusz fájl 1: táblázat S1). Aberráns metiláció CpG-szigetek társított miR
gének, mint például a let-7a-3
és miR-34a katalógusa, gyakran megfigyelhető számos rák [10, 11]. Azt javasolták, hogy a metilációs CpG-szigetek, amelyek kapcsolatban vannak a miR katalógusa gén (azaz a miR-203 katalógusa, miR-152 katalógusa, miR-124-1 katalógusa, miR-34b /c
, miR-129-2 katalógusa, miR-9-1 katalógusa, miR-130b katalógusa, miR-124-2 katalógusa, és miR-181c katalógusa) lehet fordítottan korrelál a expressziós szintje [12-17]. Azt azonban, hogy vagy nem transzkripcióját miR katalógusa gének rendszeresen befolyásolja a metilációs állapotát miR
CpG-szigetek még nem szisztémásán vizsgálták.
Köztudott, hogy az abnormális metilezést vagy demetilezési CpG-szigetek egy kis arányban (< 1%) a sejtpopuláció is érzékenyen kimutatható celluláris heterozigóta szövetmintákban. Ez azt mutatja, az az előnye, metilációs elemzés felett változások a génexpresszió a RNS és fehérje szinten, hogy csak akkor lehet kimutatni, ha az ilyen változások van jelen nagy arányban egy sejtpopuláció egy mintában [18]. A bioinformatikai elemzés azt mutatja, 50, 9, és 70 721 ember miR katalógusa gének miRbase (Release 14.0) található, illetve a, kísérő, és a közeli CpG-szigetek (együttesen fogunk hivatkozni ezekre a miR katalógusa CpG-szigetek; Kiegészítő fájl 1: táblázat S1). Feltételezésünk szerint aberráns metilációs miR katalógusa CpG-szigetek alatt előfordulhatnak kialakulásában és progressziójában rák. Ezért ezeket lehetne használni géneket nem csak becslés rák prognózis, hanem a vizsgálatot a metiláció-expresszió egyesület in vivo katalógusa. Így CpG-szigetek 9 betegséggel kapcsolatos miR katalógusa gének, köztük 5 extragenic miR katalógusa gének vagy géncsoport (miR-9-3 katalógusa, miR-137 katalógusa, miR-200b /200A /429 katalógusa, miR-203 katalógusa, és a miR-375 katalógusa) és 4 intragenikus gének vagy géncsoport (miR-9-1 katalógusa, miR-34b /c katalógusa, miR-193b /365 -1 katalógusa, és a miR-210 katalógusa) választottak, mint a képviselője a gének a jelen tanulmányban (Plusz fájl 1: táblázat S1). A metiláció-expresszió egyesület 3 ilyen miR katalógusa gének korábban nem alakult (Plusz fájl 1: táblázat S2) [12, 14, 19-27]. Kezdetben szűrni gyomorrák (GC) - vagy fogadó kapcsolódó aberráns miR
metiláció, majd vizsgáltuk a metiláció-expresszió egyesület in vitro és in vivo katalógusa katalógusa. Egyesületek közötti klinikopatológiai jellemzői GC betegek és metilációs ilyen miR
CpG-szigetek is elemezték. Katalógusa Methods katalógusa Cell online forrásból sejttenyészet katalógusa forrása információkat használt sejtvonalak ebben a vizsgálatban alkalmazott: RKO sejt vonal, melyet Dr. Guoren Deng University of California, San Francisco; SW480 és HCT116 biztosította Dr. Chen Yuanjia Peking Unió Medical College Hospital; MKN74 és 293 T által Tokiói Orvosi és Fogorvosi Egyetem; PC-3-tól vásárolták Cell Line Bank a Kínai Tudományos Akadémia Orvostudományi; HL60 és KG1A kaptuk Hematológiai Tanszék pekingi egyetem első Kórház; DU145 kapunk Hanmi Pharmacy Company; Siha adta Peking University Népi Kórház. HepG2 adta Dr. Qingyun Zhang, Calu3 és A549 Dr. zhiqian Zhang, H1299 és AGS Dr. Chengchao Shou, MKN45 Dr. Youyong Lv, és más sejtvonalak (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa és GES-1) Dr. Yang Ke, mind Peking Egyetem Cancer Kórház /Intézet. Ezeket a sejtvonalakat 37 ° C-on, 5% CO 2, különféle táptalaj. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1A, A549, H1299, GES-1, HepG2, 293 T, DU145 és RKO-ben tenyésztettük 90% RPMI-1640 és 10% FBS-t. PC-3 és AGS tenyésztettünk 90% F-12 és 10% FBS-t. Calu3, HeLa és Siha tenyésztettünk 90% DMEM-ben és 10% FBS-t. SW480 és HCT116 tenyésztettünk 90% DMEM: RPMI-1640 (1: 1) és 10% FBS-t.
Betegek és szövetminták
Sebészeti elsődleges GC mintákat és azok párosított nem rákos sebészeti árrés (SM) minta volt begyűjtött 112 fekvő- (átlagéletkor 59,2 év [tartomány, 32-79] 80 hím és 32 nőstény, 78 nem-kardiális GC és 34 kardiológiai GC 40 GC meg pTNM szakaszban I ~ II és 59. szakaszában III ~ IV) pekingi Egyetemen Cancer Kórház. A nyomon követés adatai minden beteg számára összegyűjtöttük legalább öt évig. Minden klinikai mintákban, valamint a hisztopatológiai és követ információt minden egyes esetben kaptuk szerint jóváhagyott intézményi irányelveket. A gyomor biopszia 13 egészséges alanyok és 38 gyomorhurut járóbetegek gyűjtött ugyanabban a kórházban használtak, nem rákos beteg ellenőrzéseket. Mielőtt biszulfit módosítás minden egyes páciens gyomor genomiális DNS-mintát elemeztük a H. pylori jelenlétének katalógusa -specifikus 23 s rDNS
egy PCR assay korábban leírtak szerint [28]. Az etikai bizottság a pekingi egyetem Cancer Kórház és Intézet jóváhagyta a vizsgálatot (É1041207), és minden beteg írásban beleegyezését. Katalógusa DNS kinyerése és biszulfit módosítás katalógusa sejtvonal és szöveti mintát genomi DNS (1,8 ng) alkalmazva izoláljuk fenol /kloroformos extrakcióval [29]. A nem metilált citozint maradványok a DNS-mintákat alakítunk uracil maradékok (egyre timidin maradványok PCR termék) hozzáadásával 5 M nátrium-hidrogén-szulfit [30]. A Wizard® DNS Clean-up rendszer Kit (Promega) alkalmaztunk, hogy megtisztítsa a biszulfit-val kezelt DNS előtt PCR amplifikációt.
PCR-amplifikáció és mennyiségi miR
CpG-szigetre metiláció által DHPLC
CpG-mentes univerzális primert készletek amplifikálására alkalmaztuk miR
CpG-szigetek által melegindító PCR polimeráz (Plusz fájl 1: ábra S1 és további fájl 1: táblázat S3). Szekvenciák CpG-szigetek beágyazott vagy kétoldalt ilyen kapcsolódó miR katalógusa gének tervezésére használt primerek. A PCR-termékeket ezután analizáljuk mennyiségileg által DHPLC a WAVE® DNS fragment analízis rendszer [31]. Elúciós profilokat miR-9-3 katalógusa, miR-200b katalógusa, és a miR-203 katalógusa metiláció elemeztük ultraibolya detektorral; Más miR katalógusa gén metilációs mutattuk az oszlop utáni HSX-3500 tartozék (Transgenomic, Inc., Omaha, USA) és a nagy érzékenységű fluoreszcencia (FL) detektor (gerjesztés 450 nm, emisszió 520 nm) [32 ]. Denaturált és metilálatlanok miR katalógusa gén PCR-termékeket elválasztva DNASep® analitikai oszlop (Transgenomic) a megfelelő részleges denaturálási hőmérséklet (Plusz fájl 1: táblázat S3 és ábra S2-10). A csúcs alatti területek megfelelő metilált és metilálatlan PCR termékeket kiszámításához használt aránya metilezett miR
CpG-szigetre [az aránya a metilezett másolatok = metiláció-csúcsterület /össz csúcsterület] az előzőekben leírtak szerint [33]. M.SssI-
metilezett genomiális DNS-t a vérminta alkalmaztunk pozitív kontrollként. 1. ábra DHPLC kromatogram és biszulfit szekvenálás 7 miR CpG szigetek reprezentatív sejtvonalak és a gyomor szöveti mintákat. Mind a humán perifériás vér DNS (vér) és annak M.Sss
I-metilezett termékek (M.BLOOD) használtunk kontrollként. Minden CpG helyek a fragmentum egyes miR
CpG-sziget is a fent felsorolt ​​eredményeit biszulfit szekvenálás. Minden sor egy klón; Minden rózsaszín sáv egy denaturált CpG hely. A megfelelő kromatogram egyes szekvenált minta (jobb oldali oszlop) látható (bal oldali oszlop).
Bisulfite klón-szekvenálással
Friss PCR-termékek a miR
CpG-szigetek felerősíteni a CpG-mentes univerzális primer készleteket klónozott a pGEM-T Easy készlettel (Promega, Madison, USA), és szekvenáltuk egy Applied Biosystems 3730xl DNS analizátorral SinoGeneMox Company (Peking, Kína).
kitermelése RNS és kimutatására érett miRNS szinten kvantitatív RT-PCR vizsgálatokat
Összesen 50 ng RNS-t kivontuk friss szövet minta vagy sejt vonalak segítségével a TRIzol reagenssel (Life Technologies, Carisbad, USA) alkalmazásával a gyártó protokollja. Megfelelő cDNS mintákat alkalmazásával szintetizáltuk a TaqMan® mikro-RNS reverz transzkripciós készlet (Life Technologies), a miR
-specifikus szár-hurok inverz transzkripció (RT) primereket (specifikus miR-375
# RT000564, miR-34b
# RT000427, miR-137 katalógusa # RT000593 és miR-9 katalógusa # RT000583). Az RT alkalmazott körülmények voltak 16 ° C-on 30 percig ➔ 42 ° C-on 30 percig ➔ 85 ° C-on 5 percig. A miRNS-szinteket ezután analizáltuk TaqMan Gene Expression Master Mix készlet (Life Technologies), a megfelelő próbával és primerek (Life Technologies, miR-375
# TM000564, miR-34b
# TM000427, miR-137
# TM000593 és miR-9 katalógusa # TM000583). U6
(Life Technologies, # RT001093 és # TM001093) használtunk a belső referenciaként. A PCR ciklus körülmények 95 ° C-on 10 percig ➔ majd 40 ciklus: 95 ° C-on 20 másodpercig ➔ 60 ° C-on 1 percig. Expressziós szintjét miR-200b katalógusa és miR-210 katalógusa segítségével határoztuk meg a szokásos poli RT-PCR vizsgálattal. Szekvenciáit az RT adapter primer, az univerzális inverz primer és a U6
primert a rendszeres poliA RT-PCR-assay láthatók Kiegészítő fájl 1: táblázat S5. RT körülmények 55 ° C-on 5 percig ➔ majd 25 ° C-on 10 percig ➔ 42 ° C-on 1 óra hosszat ➔ és 70 ° C-on 5 percig. A PCR ciklus körülmények 95 ° C-for10min ➔ majd 40 ciklus: 95 ° C-on 20 mp-➔ és 61 ° C-on 1 percig.
Statisztikai analízis
SPSS 16.0 Trend
-próba és Pearson Chi négyzet próba segítségével elemeztük a miR katalógusa metiláció frekvencia különbség a normál biopszia, gyomorhurut elváltozások, GC és SM mintákat. Kruskal-Wallis H
-teszt és egyutas ANOVA segítségével elemeztük a miR katalógusa metiláció aránya közötti különbség normális biopszia, gyomorhurut elváltozások, GC, és az SM minták. Fisher-teszt, a Pearson-féle Chi-négyzet próba, és a Trend katalógusa -teszt segítségével elemeztük az egyesület közötti miR
metilációs pozitív arányok és a klinikopatológiai jellemzők. A Mann-Whitney U
tesztben és Student-féle t katalógusa -teszt segítségével elemeztük az egyesület közötti aránya metilezett miR katalógusa allélek és klinikopatológiai jellemzők. Kaplan-Meier és Cox-arányos kockázati módszereket használtak egyváltozós és többváltozós elemzés összehasonlítani teljes túlélése GC betegek különbségek metilációs állapotát miR
CpG szigeteken. Minden statisztikai tesztek kétoldalas, és a P katalógusa < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa eredményei katalógusa jellemzése metilációs vagy demetilációja 6 miR
CpG-szigetek fejlesztéséhez kapcsolódó glükokortikoid katalógusa Mi erősített biszulfittal kezeit sablonok 9 képviselő miR
CpG-szigetek CpG-mentes alapozók és kifejlesztett 9 DHPLC esszék, hogy elemezze a metilációs állapotát CpG szigetek PCR termékek 4 intragenikus miR katalógusa gének (miR-9-1 katalógusa, miR-34b katalógusa, miR-193b katalógusa, miR-210 katalógusa), és 5 extragenic miR katalógusa gének (miR-9-3 katalógusa, miR-137 katalógusa, miR-200b katalógusa, miR-203 és katalógusa miR-375 katalógusa), illetve (1. ábra, kiegészítő fájl 1: táblázat S3, és további fájl 1: ábra S1-S10). Ezek DHPLC vizsgálatok során kiderült, hogy a metilációs pozitív arány 5 miR
CpG-szigetek (miR-9-1 katalógusa, miR-9-3 katalógusa, miR-34b katalógusa, miR-137 katalógusa, és miR-210 katalógusa) szignifikánsan emelkedett egyidejűleg súlyosságával kóros elváltozásokat a gyomorban. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy metiláció ilyen miR
CpG szigeteken fejlesztésével kapcsolatos glükokortikoid (trend
-teszt, miR-9-1 katalógusa, P < katalógusa 0,001 miR-9- 3 katalógusa, P < katalógusa 0,001 miR-34b katalógusa, P = 0,008 katalógusa; miR-137 katalógusa, P < katalógusa 0,001 miR-210 katalógusa, P katalógusa = 0,001; 1. táblázat). miR-9-1
metiláció volt kimutatható 18 28 GC (érzékenység, 64%), de csak a 2. 48 normál vagy gyomorhurut biopsziás minták mutatták metilációs (specificitás, 96%). Bár a metiláció miR-200B
kimutatható volt szinte minden gyomor szövetek minta aránya, a metilezett miR-200B
normál vagy gastritis szövetekben (46% ~ 100%) szignifikánsan nagyobb volt, mint hogy mindkét SM és GC minták (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U-
vizsgálat, gyomorhurut biopsziák versus SMS, P =
0,001; 1. táblázat). Ez arra utal, hogy a miR-200b katalógusa demetilációja volt GC, beteg-specifikus esemény. Biszulfit-szekvenálása ezek miR
CpG-szigetek megerősítette a kapott adatok DHPLC analízis (1. ábra) .table 1 metiiációs státusának miR CpG-szigetek gyomornyálkahártya mintákban különböző patológiás változások a GC és nem-rákos kontroll betegek
miR
CpG-szigetek Matton Group gyomor- minták
miR katalógusa -Methylation Matton pozitív arány Matton aránya (%) az metilezett miR
a miR katalógusa metiláció-pozitív minták
pozitív arány (%) Matton χ katalógusa 2

• Jelenléte S100A9-pozitív gyulladásos sejtek rákos szövetekben korrelál a korai szakaszban a rák és egy jobb prognózis betegeknél gyomorrák
• Esetleg továbbítása Helicobacter pylori emberre okozhat egy betegség kitörése a kolónia Stripe arcú Dunnarts (Sminthopsis macroura)?