Caracterización de metilación relacionados con carcinoma gástrico humano de 9 islas CpG MIR y la represión de sus expresiones in vitro e in vivo

caracterización de metilación relacionados con carcinoma gástrico humano, de 9 de miR
islas CpG y la represión de sus expresiones in vitro y
in vivo
Resumen Antecedentes
¿Cuántas miR
genes se encuentran dentro o alrededor de las islas CpG. No está claro si la metilación de estas islas CpG reprime la transcripción de miR
con regularidad. Los objetivos de este estudio es caracterizar el carcinoma gástrico (CG) -relacionado metilación de las islas CpG
MIR y su relación con la expresión de los genes miARN.
Métodos
estado de metilación de 9 representante de miR
Islas CpG en una panel de líneas celulares y muestras gástricas humanas (incluyendo 13 biopsias normales, 38 biopsias gastritis, 112 pares de GCs y sus muestras de márgenes quirúrgicos) se analizó por bisulfito-DHPLC y secuenciación. los niveles de miARN maduro se determinaron con RT-PCR cuantitativa. Las relaciones entre el miR
metilación, la transcripción, el desarrollo de GC, y las características clínico-patológicas se analizaron estadísticamente.
Resultados
frecuencia de metilación de 5 MIR
islas CpG (miR-9-1
, miR-9 -3
, miR-137
, miR-34b
, y miR-210
) aumentaron gradualmente mientras que la proporción de metilado de miR-200b
disminuyó gradualmente durante la carcinogénesis gástrica (Sal
< 0,01). se ha detectado más de miR-9-1
metilación en el 62% -64% de las muestras de GC y el 4% de las muestras normales o gastritis (18/28 frente a 2/48; odds ratio, 41,4; P <
; 0,01). miR-210
metilación mostró alta correlación con la infección por H. pylori
. miR-375
, miR-203
, y miR-193b
metilación podría ser la adaptación de acogida para el desarrollo de los GC. La metilación de estos miR
islas CpG se demostró consistentemente para disminuir significativamente los niveles de miRNA correspondientes que se presentan en líneas celulares humanas. La relación inversa también se observó para el miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
, y
miR-200b en las muestras gástricas. Entre 112 pacientes con cáncer gástrico, el miR-9-1
metilación fue un predictor independiente favorable de la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico, tanto en el análisis univariante y multivariante (P Hotel < 0,02).
Conclusiones En conclusión
, alteración del estado de metilación del 6 de 9 a prueba MIR
islas CpG se caracterizó en la carcinogénesis gástrica. miR-210
metilación correlacionado con la infección por H. pylori
. miR-9-1
metilación puede ser un evento GC-específica. La metilación de las islas CpG de miR
pueden regular a la baja significativamente su transcripción con regularidad.
Antecedentes
miARN son una clase abundante de pequeños ARN no codificantes que regulan principalmente la expresión génica a nivel post-transcripcional. Desempeñan un papel fundamental en la renovación y la diferenciación de las células madre y ayudan a mantener los linajes de células. Investigaciones anteriores han demostrado que en el cáncer de varios de los genes, como el miR-200b MIR /200a /429
, miR-21
, miR-30b
, miR-30d
, miR
-31
, y miR-423 ¿Cuáles son regulados por incremento, mientras que otros miR
genes como el miR-143 y miR-
145 ¿Cuáles son regulados a la baja [1-3]. La evidencia sugiere que los cambios en la expresión de los genes miARN se producen con frecuencia en muchos tipos de cáncer y estas variaciones o bien contribuyen a la carcinogénesis o reflejan el desarrollo y progresión de cánceres.
Hay un número de vías que pueden afectar los niveles de miARN maduros en células y tejidos, tales como amplificación o supresión de genes, la regulación positiva de la transcripción o la regulación a la baja, el procesamiento post-transcripcional, y la degradación de los genes miARN [4-7]. Es bien sabido que algunos de miR intragenic
genes, como miR-218-2
, se transcribe de forma coordinada con los genes del huésped a través de mecanismos de corregulación [8]. Sin embargo, muchos de miR
genes son extragenic y una cierta proporción de intragenic MIR
genes, como miR-9-1 ¿Cuáles son transcritas en un patrón de genes independientes del huésped [9]. Debido a que la región promotora exacta de la mayoría de miR
genes no se caracterizan, especialmente en relación con el MIR
genes extragenic, los mecanismos regulatorios exactos de la transcripción de miR
están lejos de ser clara.
Metilación o hipermetilación de islas CpG en la región de transcripción sitios de partida (TSS) es generalmente reconocido para reprimir la transcripción del gen epigenético. A diferencia de los genes codificantes de proteínas que pueden abarcar múltiples islas CpG, el MIR
genes pueden ser más corta que una isla CpG, y en algunos casos, múltiples MIR
genes (es decir, un MIR
grupo de genes) puede ser ubicada dentro o flanqueando una sola isla CpG (archivo adicional 1: Tabla S1). metilación aberrante de islas CpG asociadas con el miR
genes, como let-7a-3
y miR-34a
, se observa con frecuencia en muchos tipos de cáncer [10, 11]. Se ha sugerido que la metilación de las islas CpG que se asocian con miR
genes (es decir, el miR-203
, miR-152
, miR-124-1
, miR-34b /c
, miR-129-2
, miR-9-1
, miR-130b
, miR-124-2
, y miR-181c
) podrían correlacionan inversamente con su los niveles de expresión [12-17]. Sin embargo, si la transcripción de los genes miR
se ve afectada regularmente por el estado de metilación de las islas CpG
MIR no se ha estudiado de forma sistémica.
Es bien conocido que la metilación anormal o desmetilación de las islas CpG en una pequeña proporción (< 1%) de la población de células se pueden detectar con sensibilidad en muestras de tejido heterocigotos celulares. Esto demuestra la ventaja del análisis de la metilación sobre las alteraciones de la expresión génica en el ARN y los niveles de proteína que sólo se puede detectar cuando está presente en una gran proporción de una población de células en una muestra [18] a tales cambios. Nuestro análisis bioinformático muestra 50, 9, y 70 de 721 miR
genes humanos en el miRBase (Release 14.0) están situados, respectivamente, dentro, flanqueando, y cerca de las islas CpG (colectivamente nos referiremos a estos como el miR
islas CpG; archivo adicional 1: Tabla S1). Se postula que la metilación aberrante de miR
islas CpG se puede producir durante el desarrollo y la progresión de los cánceres. Por lo tanto, podrían ser utilizados como genes candidatos no sólo para la predicción de pronóstico del cáncer, sino también para la investigación de la asociación metilación expresión in vivo
. Por lo tanto, las islas CpG de 9 miR
genes relacionados con enfermedades, incluyendo 5 extragenic miR
genes o grupos de genes (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b /200a /429
, miR-203
, y miR-375
) y 4 genes o grupos de genes intragenic (miR-9-1
, miR-34b /c
, miR-193b /365 -1
, y miR-210
), fueron seleccionados como los genes de representación en el presente estudio (archivo adicional 1: Tabla S1). La asociación metilación-expresión de miR 3 de ellas
genes no se ha establecido previamente (archivo adicional 1: Cuadro S2) [12, 14, 19-27]. Nosotros inicialmente seleccionados para el carcinoma gástrico (CG) - o aberrante de miR relacionados con el huésped
metilación y luego investigó la asociación metilación-expresión in vitro e in vivo

. Las asociaciones entre las características clínico de pacientes con cáncer gástrico y la metilación de estas MIR
También se analizaron las islas CpG
Métodos
fuentes de línea celular y cultivo celular
información Fuente de líneas celulares usados ​​utilizados en este estudio:. Celular RKO línea, proporcionada por el Dr. Guoren Deng en la Universidad de California en San Francisco; SW480 y HCT116 fueron proporcionados por el Dr. Chen Yuanjia en el Hospital Peking Union Medical College; MKN74 y 293 T proporcionada por Tokio Universidad de Medicina y Odontología; PC-3 se adquirió de la Línea Celular Banco de la Academia China de Ciencias Médicas; HL60 y KG1a se obtuvieron del Departamento de Pekín Primer Hospital de la Universidad de Hematología; DU145 se obtuvo de Hanmi Pharmacy Company; Siha fue proporcionada por Pekín Hospital Popular de la Universidad. HepG2 se proporcionó por el Dr. Qingyun Zhang, Calu3 y A549 por el Dr. Zhiqian Zhang, H1299 y AGS por el Dr. Chengchao Shou, MKN45 por el Dr. Youyong Lv, y otras líneas celulares (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa y GES-1) por el Dr. Yang Ke, todos a la Universidad de Pekín hospital Cancer /Instituto. Estas líneas celulares se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO 2, utilizando diversos medios de cultivo. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1a, A549, H1299, GES-1, HepG2, 293 T, Du145, y RKO se cultivaron en 90% de RPMI-1640 y 10% de FBS. PC-3 y AGS se cultivaron en 90% F-12 y 10% de FBS. Calu3, HeLa y Siha se cultivaron en DMEM 90% y 10% de FBS. SW480 y HCT116 se cultivaron en 90% de DMEM: RPMI-1640 (1: 1). Y 10% de FBS
Pacientes y muestras de tejido
muestras GC primaria quirúrgicos y sus pares de muestras no cancerosas margen quirúrgico (SM) eran recogidos de 112 pacientes (edad media de 59,2 años [rango, 32-79]; 80 varones y 32 mujeres; 78 GCs no cardiaco y 34 GC cardíacos; 40 GC en pTNM etapa I ~ II y 59 en la fase III ~ IV) en el hospital de cáncer de la Universidad de Pekín. Se recogieron los datos de seguimiento para todos los pacientes durante al menos cinco años. Todas las muestras clínicas, así como información histopatológico y seguimiento para cada caso se obtuvieron de acuerdo con las directrices institucionales aprobadas. biopsias gástricas de 13 sujetos sanos y 38 pacientes ambulatorios gastritis recogidos del mismo hospital se utilizaron como controles de pacientes sin cáncer. Antes de modificación con bisulfito se analizó gástrico muestra de ADN genómico de cada paciente para la presencia de H. pylori
específico de 23 S rDNA
por un ensayo de PCR como se describe anteriormente [28]. Las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Pekín Hospital del Cáncer y el Instituto aprobó el estudio (É1041207), y todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito.
Extracción de ADN y la modificación con bisulfito
línea celular de cáncer y ADN genómico muestra de tejido (1,8 g) se aisló utilizando extracción con fenol /cloroformo [29]. Los residuos de citosina no metiladas en las muestras de ADN se convierten en residuos de uracilo (convirtiéndose en residuos de timidina en los productos de PCR) mediante la adición de bisulfito de sodio 5 M [30]. cebador universal se utilizó el kit de ADN Wizard Sistema Clean-Up (Promega) para purificar el ADN tratado con bisulfito antes de la amplificación por PCR.
PCR de amplificación y cuantificación de MIR
la isla CpG metilación por DHPLC
CpG libre conjuntos se utilizaron para amplificar el miR
islas CpG por PCR de arranque en caliente de la polimerasa (archivo adicional 1: Figura S1 y archivo adicional 1: Tabla S3). Las secuencias de las islas CpG incorporados o flanqueadas estos miR relacionadas
genes se utilizaron para diseñar los cebadores. Los productos de PCR se analizaron a continuación cuantitativamente por DHPLC en el ADN Sistema de análisis de fragmentos WAVE® [31]. Los perfiles de elución de miR-9-3
, miR-200b
, y miR-203
metilación se analizó con un detector ultravioleta; otro de miR
metilación de genes se detectó con la columna de la poste HSX-3500 Accesorio (Transgenomic, Inc., Omaha, EE.UU.) y una fluorescencia de alta sensibilidad (FL) detector (excitación a 450 nm, emisión a 520 nm) [32 ]. Metilado y no metilado miR
productos de PCR de genes estaban separados por una columna analítica DNASep® (Transgenomic) a la temperatura correspondiente parcial desnaturalización (archivo adicional 1: Tabla S3 y la Figura S2-10). Las áreas de los picos correspondientes a los productos de PCR metilados y no metilados se utilizaron para calcular la proporción de MIR metilado
isla CpG [la proporción de copias metiladas = área /área de pico total de metilación de pico] tal como se describe anteriormente [33]. se utilizó M.SssI-
ADN genómico metilado de muestras de sangre como un control positivo. Figura 1 cromatogramas DHPLC y secuenciación de bisulfito de 7 islas CpG en el miR líneas celulares representativas y muestras de tejido gástrico. Tanto el ADN de sangre periférica humana (sangre) y su M.Sss
productos I-metilado (M.BLOOD) se utilizaron como controles. Todos los sitios CpG en la amplificación de cada MIR
isla CpG también se enumeran por encima de los resultados de la secuenciación de bisulfito. Cada fila representa un clon; cada barra de color rosa representa un sitio CpG metilados. El cromatograma correspondiente de cada muestra se secuenció (columna derecha) se muestra (columna izquierda).
Bisulfito clon de secuenciación
productos de PCR fresca de MIR
islas CpG amplificados con los conjuntos de cebadores universales CpG libres fueron clonados con el kit pGEM-T Easy (Promega, Madison, EE.UU.) y se secuenció con un Applied Biosystems 3730xl analizador de ADN en SinoGeneMox Company (Pekín, china).
la extracción de ARN y la detección del nivel de madurez miARN con los ensayos de RT-PCR cuantitativa
total 50 ng de ARN fue extraído de muestras de tejidos frescos o líneas de células usando el reactivo TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Correspondientes muestras de cDNA fueron sintetizados utilizando la TaqMan ® Micro RNA kit de transcripción inversa (Life Technologies) con el miR
específico de la transcripción inversa del tallo-bucle (RT) primers (específico para el miR-375
# RT000564, miR-34b
# RT000427, miR-137
# RT000593, y miR-9
# RT000583). Las condiciones de RT utilizadas fueron 16 ° C durante 30 min ➔ 42 ° C durante 30 min ➔ 85 ° C durante 5 min. Los niveles de miRNA A continuación se analizaron utilizando un TaqMan Expresión Génica Master Mix Kit (Life Technologies) con la sonda y los cebadores correspondientes (Life Technologies, miR-375
# TM000564, miR-34b
# TM000427, miR-137
# TM000593, y miR-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # RT001093 y # TM001093) se utilizó como referencia interna. Las condiciones de los ciclos de PCR fueron 95 ° C durante 10 min ➔ seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 20 seg ➔ 60 ° C durante 1 min. Los niveles de expresión de miR-200b
y miR-210
se determinaron utilizando un ensayo de poli RT-PCR estándar. Secuencias del adaptador de RT cebador, el cebador inverso universal y la U6
imprimación en el ensayo regular de poli RT-PCR se muestran en archivo adicional 1: Cuadro S5. condiciones de RT fueron 55 ° C durante 5 min ➔ seguido de 25 ° C durante 10 min ➔ 42 ° C durante 1 hr ➔ y 70 ° C durante 5 min. Las condiciones de los ciclos de PCR fueron 95 ° C for10min ➔ seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 20 seg ➔ y 61 ° C durante 1 min. El análisis estadístico SPSS 16.0
Tendencia
test de Chi y de Pearson cuadrado de prueba se utiliza para analizar el MIR
diferencia entre la frecuencia de metilación biopsias normales, lesiones de gastritis, muestras de GC y SM. Kruskal-Wallis H
-test y ANOVA de un factor se utilizaron para analizar el MIR
diferencias de metilación proporción entre biopsias normales, lesiones de gastritis, GC, y muestras SM. prueba exacta de Fisher, la prueba de Chi-cuadrado de Pearson, y Trend
-test se utilizaron para analizar la asociación entre el miR
tasas positivas de metilación y las características clínico-patológicas. El Mann-Whitney U-test
y estudiante de t-test
se utilizaron para analizar la asociación entre la proporción de alelos metilados miR
y las características clínico-patológicas. los métodos de Kaplan-Meier y Cox-Riesgo Proporcional se utilizaron para el análisis univariante y multivariante para comparar la supervivencia global de los pacientes con GC diferencias en el estado de metilación de las islas CpG
MIR. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, y P Hotel < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Caracterización de metilación o desmetilación de 6 MIR
islas CpG relacionados con el desarrollo de los GC
Estamos amplificado plantillas tratado con bisulfito de 9 representativas de miR
islas CpG cebadores con CpG libres y desarrollado ensayos 9 DHPLC para analizar el estado de metilación de las islas CpG en los productos de PCR de 4 miR
genes intragenic (miR-9-1
, miR-34b
, miR-193b
, miR-210
) y 5 miR
genes extragenic (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b
, miR-203 y
miR-375
), respectivamente (Figura 1, archivo adicional 1: Tabla S3, y archivo adicional 1: Figura S1-S10). Estos ensayos DHPLC revelaron que la tasa positiva de metilación de 5 MIR
islas CpG (miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, y miR-210
) se incrementó significativamente simultáneamente con la gravedad de los cambios patológicos en el estómago. Estos resultados sugieren fuertemente que la metilación de estas islas CpG de miR
se relaciona con el desarrollo de los GC (tendencia
-test, el miR-9-1
, P < 0,001
; miR-9- 3
, P < 0,001
; miR-34b
, P = 0,008
; miR-137
, P < 0,001
; miR-210
, P
= 0,001; Tabla 1). miR-9-1
metilación se detectó en 18 de 28 GC (sensibilidad, 64%), pero sólo en 2 de 48 biopsias normales o gastritis mostró metilación (especificidad, 96%). Aunque se detectó metilación de miR-200b
en casi todas las muestras de los tejidos gástricos, la proporción de metilado
miR-200b en los tejidos normales o gastritis (46% ~ 100%) fue significativamente mayor que en ambos SM y GC muestras (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U
prueba, biopsias gastritis frente SMs, P = 0,001;
Tabla 1). Esto sugiere que el miR-200b
desmetilación era un GC, caso específico del paciente. secuenciación de bisulfito de éstos MIR
islas CpG confirmaron los datos obtenidos del análisis de DHPLC (Figura 1) .Tabla estado 1 La metilación de islas CpG en el miR muestras de mucosa gástrica con diferentes cambios patológicos en GC y control de pacientes no cancerosos
MIR Islands of CpG
Grupo de muestras gástricas
MIR
metilación
tasa positiva
Proporción (%) de MIR metilado
en el miR-metilación
muestras positivas
tasa positiva (%) guía empresas χ
2-valor
Tendencia
-test (P-valor
) guía empresas mediana
[25% ~ 75%]
media ± DE

t /F /χ
2-valor
P-valor

miR-9-1
normal
1/13 (7,7)
27.598 Hotel < 0,001
una NA NA

Gastritis
1/35 (2,9)
NA
SM
9/28 (32,1)
17 [13-30]
20 ± 4
t = -3,039

0,005 g
GC
18/28 (64,3)
29 [19-40]
32 ± 4
miR-9-3
normal
6/13 (46,2)
23.389 Hotel < 0,001
un 38 [31-59]
43 ± 6
F = 1.639

0.189 h
Gastritis
15/37 (40,5)
43 [36-48]
42 ± 2
SM
26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2
GC
26/28 (92,9)
37 [26-43]
36 ± 2
miR-137
normal
5/13 (38,5)
18.626 Hotel < 0,001
un 10 [4-41]
χ
2 = 8.065
0.045 d
Gastritis
24/38 (63,2) página 19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3 g
GC
24/26 (92,3)
36 [20-51]
37 ± 4
miR-34b

normal
6/13 (46,2)
6.947 0.008
una página 13 [7-19]
χ
2 = 0,658 0,883 d
La gastritis

13/36 (36,1) página 11 [3-20]
SM
22/28 (78,6) página 11 [4-18]
GC
19/28 (67,9)
10 [5-32]
miR-200b
normal
13/13 (100)
0,486 0,922
f
54 [52-83]
χ
2 = 17,883 Hotel < 0,001 d
Gastritis gratis (97,2): perfil 52 [46-100] e 35/36
SM
27/28 (96,4)
44 [40-47]
GC
27/28 (96,4)
48 [40-53]
miR-210
normal
2/13 (15,4)
11,908 0,001
un
NA NA

Gastritis
13/38 (34,2) página 7 [ ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81,5) página 11 [5-22]
GC
16/27 (59,3) página 9 [4-16]
miR-193b
normal
0/13
7.045 0.008 b

NA NA

Gastritis
2/37 (5,4)
NA
SM
7/28 (25,0) página 5 [4-14]
GC
4/28 (14,3) página 5 [2-12]
miR 203
normal
5/13 (38,5) 5.617

0.018 b
32 [29-75]
χ
2 = 2.957
0,398 d
Gastritis
20/38 (52,6)
31 [26-36]
SM
21/28 (75,0)
34 [30-36]
GC
11/28 (39,3) c
32 [29-35]
miR-375
normal
0/13
12.266 Hotel < 0,001 b
NA NA

Gastritis
13/38 (34,2) página 3 [3-4] e
SM
16/28 (57,1) página 7 [4 -14]
GC
8/28 (28,6) c
17 [8-21]
una tendencia
prueba, entre normal, gastritis, SM y muestras de GC; b,, Trend
-test entre Normal, gastritis, y las muestras de SM; c, la prueba de Chi-cuadrado de Pearson, GC frente SM: miR-203
, χ
2 = 7.292, p = 0,007
; miR-375
, χ
2 = 4,667, p = 0,031
; d, Kruskal-Wallis H
-test; e, Mann-Whitney U-test
: Gastritis contra SM, miR-200b
, T
= 230.000; p = 0,001
; La gastritis frente a GC, miR-375
, T
= 46.000, P = 0,011
; SM frente a GC, miR-137
, T = 170.000
, P = 0,009
; f, la prueba de Chi-cuadrado de Pearson, entre muestras, gastritis, SM y GC normales; gramo. Emparejado t-test
: SM frente a GC, miR-137
, t = -2.652
, P = 0,014
; marido. ANOVA de una vía; ND, no disponible.
Excepción de miR-9-1
y miR-137
, las tasas positivas de metilación o proporciones de miR-metilado 9-3
, miR-34b
, miR-210
, y miR-200b Hoteles en los GC fueron similares a los de SMS (Tabla 1). Para validar si la metilación de algunos de estos genes miR
es un efecto de campo ocurre simultáneamente en ambos tejidos cancerosos y no cancerosos en el estómago debido a la misma exposición a factores ambientales, se han detectado los datos de metilación en otro subconjunto de GC y las muestras SM de 84 pacientes y encontraron que la tasa positiva y la proporción de miR-metilado 9-1 Hoteles en Glasgow fue aún significativamente más alta que en los SM (60,7% frente a 32,1%; la prueba de Chi-cuadrado de Pearson, p =
0,001; Firma rank test, P Hotel < 0,001; la disposición 1: Tabla S4, Subset-2). La proporción media de la metilado miR-137
también fue significativamente mayor en los GC que los SMS (media ± DE

, 26 ± 2 frente a 38 ± 2, emparejado t-
prueba, P <
0,001). Como era de esperar una diferencia significativa en la tasa positiva o la proporción de metilado miR-9-3, miR-34b
, miR-210
, y miR-200b
no se observó entre GC y muestras SM. Estos resultados confirmaron que el miR-9-1
y miR-137
metilación fue un evento específico del tumor y que el miR-9-3
, miR-34b
, y miR-210
metilación, así como miR-200b
desmetilación, fue un efecto de campo que se produjo durante la carcinogénesis gástrica.
Por otra parte, la tasa positiva de metilado de miR-203 y miR-
375
aumenta gradualmente de normal a la gastritis a las muestras SM, pero disminuyó significativamente en los GC en comparación con SMS (prueba de Chi-cuadrado de Pearson, miR-203
, P = 0,007
; miR-375
, P = 0,031
; Tabla 1). En el subgrupo-2 muestras, también se analizó el miR-375
metilación y encontramos más de miR-375
metilación en los SM que en los GC de nuevo (test de Pearson Chi-cuadrado, p = 0,034
; la disposición 1 : Tabla S4). Estos datos implican que el miR-375 gratis (y-203 de miR
) metilación no se GC-específico y podrían ser una especie de adaptación de acogida en los tejidos no malignos en el desarrollo de los GC.
MIR
metilación y la infección por H. pylori
para determinar si la infección por H. pylori
juega un papel en el miR
metilación, buscamos H. pylori específicos de
23 S rDNA
en gástricas muestras de ADN genómico por PCR y se encontró que el H. pylori
tasa -positivo aumentó simultáneamente con la gravedad de los cambios patológicos [15,4% (2 de 13) de biopsias gástricas normales, 52,6% (20 de 38) de lesiones gastritis, y el 69,0% (29 de 42) biopsias SM; Tendencia
-test, p = 0,001
] y la disminución en las muestras de GC (18 de 42 = 42,9%; GC frente SMS, prueba de Chi-cuadrado de Pearson, P = 0,016
; archivo adicional 1: Figura S11 ). pylori
-positivos muestras gastritis /normales y SM H. mostraron significativamente más altos de metilación de miR-210
metilación de H. pylori
muestras seronegativas (P = 0,036
y 0,022, respectivamente; Figura 2A y B). Figura 2 Comparación de la MIR metilación en diferentes muestras de mucosa gástrica con y sin existencia de H. pylori. (A) biopsias normales o gastritis de pacientes externos de control sin enfermedad maligna; (B y C) quirúrgicas de margen y tumorales muestras de pacientes con carcinoma gástrico, respectivamente; Específico de H. pylori 23 S rDNA
fue detectado por PCR.
Relación entre el miR Inversed
metilación de las islas CpG y sus correspondientes niveles de expresión
a investigar la relación entre la anterior aberrante MIR
metilación y la transcripción del gen de miR
correspondiente, que cuantifica los niveles de miARN maduros de miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, miR-210
, miR-200b
, (y miR-375
), cuyo estado de metilación se relaciona con el desarrollo de GC (y la adaptación de acogida GC) como se ha descrito anteriormente, en un conjunto de líneas celulares humanas con diferente estado de metilación de las islas CpG
MIR. El estado de metilación de cada uno de miR
isla CpG en estas líneas celulares se determinó mediante DHPLC como se ilustra en el archivo adicional 1: Figura S2-S10. Los resultados de los ensayos de RT-PCR cuantitativa mostró que en las líneas celulares ensayadas con adición de miR metilado alelos
los niveles de miARN maduros de todos los 6 miR
genes relacionados con la GC-y un host de adaptación de miR
genes fueron significativamente inferiores a las detectado en las líneas celulares que contienen no metilado miR
alelos (Figura 3A-G). Figura 3 La relación entre el nivel de expresión y el estado de metilación de los genes miR en líneas celulares humanas y muestras de tejido gástrico. (A-G) El análisis de correlación entre la proporción de metilación de islas CpG miARN maduros y sus niveles de expresión de los genes miARN en el objetivo isla CpG metilados líneas celulares humanas y no metilados; (H-P) La expresión de miRNAs en 20 pares de muestras de carcinoma gástrico, frescas; (U) de la isla líneas celulares no metiladas CpG destino; líneas de células insulares metilado (M) Objetivo CpG; isla (T /M) Objetivo CpG metilados parcialmente líneas celulares.
Asimismo, analizaron los niveles de miARN de 20 pares de GC fresco y muestras SM y se encontró un nivel de expresión significativamente mayor de miARN-200b, España miRNA-375, y miRNA-210 en SMS que en los GC (t pareada
-test: Sal
≤0.030; archivo adicional 1: Figura S12). Los niveles de miARN-137 en SMS también fueron más altos que los de los GC, pero no fue estadísticamente significativa (p = 0,059
). Los niveles de expresión de los genes miARN-9 y miRNA-34b fueron similares entre los MS y GC. Lo más importante, se observó una relación inversa entre el miR
metilación y el correspondiente nivel de expresión de miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
, y miR-200b
en estas muestras de tejido gástrico (análisis de correlación de Spearman Rango, miR-9-1
, r
s
= -0.533, P = 0,001
; miR-9-3
, r
s
= -0,464, p = 0,004
; miR-137
, r
s
= -0,378, p =
0,019; miR-200b
, r
s
= -0,409, p = 0,010
; Figura 3H-K). Una relación metilación débil expresión inversa también se encontró para el miR-375
en estas muestras de tejido (r
s
= 0,287, p = 0,085
; Figura 3O). Tal relación no se observó para el miR-34b
y miR-210 gratis (Figura 3L, N).
MIR
metilación correlacionado con las características clínico-patológicas de los pacientes GC
a estudiar la posibilidad de usando el miR
metilación como predictor pronóstico de los GC, se determinó la prevalencia de la metilación de genes 7 miR
y analizado la relación entre las características clinicopatológicas de GC y los correspondientes niveles de metilación de estos MIR
islas CpG estudiada features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive pylori
infección.

• La presencia de células inflamatorias S100A9 positivo en tejidos de cáncer se correlaciona con un cáncer en etapa temprana y un mejor pronóstico en pacientes con cáncer gástrico
• la transmisión de Helicobacter pylori hizo a los humanos causan un brote de la enfermedad en una colonia de la raya de cara dunnarts (Sminthopsis macroura)