Karakterisering av human magekreft relaterte metylering av 9 MIR CpG øyer og undertrykkelse av deres uttrykk in vitro og in vivo

karakterisering av menneskelig gastrisk karsinom relaterte metylering av 9 MIR
CpG øyer og undertrykkelse av deres uttrykk in vitro Hotell og in vivo
abstrakt bakgrunn
Mange Mir
gener ligger innenfor eller rundt CpG øyer. Det er uklart om metylering av disse CpG øyer undertrykker Mir
transkripsjon regelmessig. Målet med denne studien er å karakterisere magekreft (GC) -relaterte metylering av MIR
CpG øyer og sitt forhold til miRNA uttrykket.
Metoder
Metylering status av 9 representant MIR
CpG øyer i en panel av cellelinjer og humane gastriske prøver (inkludert 13 normale biopsier, 38 gastritt biopsier, 112 par av GCer og deres kirurgiske margin prøver) ble analysert ved bisulfitt-DHPLC og sekvensering. Moden miRNA nivåer ble bestemt med kvantitativ RT-PCR. Relasjoner mellom MIR
metylering, transkripsjon, GC utvikling, og clinicopathological egenskaper ble statistisk analysert.
Resultater
Metylering frekvens på 5 MIR
CpG øyer (MIR-9-1
, MIR-9 -3
, økt MIR-137
, Mir-34b
, og MIR-210
) gradvis mens andelen metylert MIR-200b
gradvis redusert i magekreftutvikling (Ps
< 0,01). Mer MIR-9-1
metylering ble påvist i 62% -64% av GC prøver og 4% av de normale eller gastritt prøver (18/28 versus 2/48, Odds ratio, 41.4; P
<0,01). MIR-210
metylering viste høy korrelasjon med H. pylori
infeksjon. MIR-375
, MIR-203
, og MIR-193b
metylering kan være vertskap tilpasning til utviklingen av GCer. Metylering av disse MIR
CpG øyer ble konsekvent vist til en betydelig reduksjon tilsvarende miRNA nivåer presenteres i humane cellelinjer. Den inverse forholdet ble også observert for MIR-9-1
, MIR-9-3
, MIR-137
, og MIR-200b
i mageprøver. Blant 112 GC pasienter, MIR-9-1
metylering var en selvstendig positiv prediktor for total overlevelse av GC pasienter i både univariat og multivariat analyse (P
< 0,02).
Konklusjoner
konklusjon , endring av metylering status for seks av ni testet MIR
CpG øyer ble karakterisert ved magekreftutvikling. MIR-210
metylering korrelert med H. pylori
infeksjon. MIR-9-1
metylering kan være en GC-spesifikk hendelse. Metylering av MIR
CpG øyer kan betydelig ned-regulere transkripsjon regelmessig.
Bakgrunn
miRNA er en rikelig klasse av små ikke-kodende RNA som i hovedsak regulerer genekspresjon på post-transkripsjonsnivået. De spiller avgjørende roller i fornyelse og differensiering av stamceller og å opprettholde celle linjene. Tidligere forskning har vist at kreft flere av Mir
gener som MIR-200b /200a /429
, MIR-21
, Mir-30b
, MIR-30d
, MIR -31
, og MIR-423
er oppregulert, mens andre MIR
gener som MIR-143 Hotell og MIR-145
er nedregulert [1-3]. Bevis tyder på at endringer i miRNA ekspresjon forekommer hyppig i mange kreftformer, og disse variasjonene enten bidrar til kreftutvikling eller reflektere utvikling og progresjon av kreft.
Det finnes en rekke veier som kan påvirke modne miRNA nivåer i celler og vev, såsom genamplifisering eller sletting, transkripsjonen oppregulering eller nedregulering, post-transcriptional behandling, og miRNA degradering [4-7]. Det er velkjent at noen intragenic MIR
gener som MIR-218-2
blir koordinert transkribert med sine verts gener gjennom co-reguleringsmekanismer [8]. Men mange MIR
gener er extragenic og en viss andel av intragenic mir
gener som MIR-9-1
blir transkribert i en vert gen-uavhengig mønster [9]. Fordi den eksakte promoter-regionen i de fleste MIR
gener ikke er preget, spesielt med hensyn til de extragenic MIR
gener, de nøyaktige reguleringsmekanismer av Mir
transkripsjon er langt fra klart.
Metylering eller hypermethylation av CpG øyer i regionen transkripsjons starte nettsteder (TSS) er generelt anerkjent for å undertrykke gentranskripsjon epigenetiske. I motsetning til protein-kodende gener som kan omfatter flere CpG-øyer, Mir
gener kan være kortere enn en CpG øy, og i noen tilfeller, multippel MIR
gener (dvs., en MIR
genklusteret) kan bli ligger innenfor eller flankerer en enkelt CpG island (tilleggsfiler 1: Tabell S1). Avvikende metylering av CpG øyer forbundet med MIR
gener, som la-7a-3 Hotell og MIR-34a
er hyppig observert i mange kreftformer [10, 11]. Det har vært antydet at metylering av CpG øyer som er forbundet med Mir
gener (dvs. MIR-203
, MIR-152
, MIR-124-1
, MIR-34b /c
, MIR-129-2
, MIR-9-1
, MIR-130b
, MIR-124-2
, og MIR-181c
) kanskje omvendt korrelert med deres uttrykk nivåer [12-17]. Imidlertid er hvorvidt transkripsjon av MIR
gener regelmessig rammet av metylering status for Mir
CpG øyer har ikke blitt systematisk undersøkt.
Det er velkjent at unormal metylering eller demetylering av CpG øyer i en liten andel (mindre enn 1%) av cellepopulasjonen kan være følsomt påvises i cellulære heterozygot vevsprøver. Dette viser fordelen ved metylering analyse i løpet av endringer i genekspresjon på RNA og proteinnivåer som bare kan påvises ved en slik endring er til stede i en stor andel av en cellepopulasjon i en prøve, [18]. Vår bioinformatiske analyse viser 50, 9, og 70 av 721 menneske MIR
gener i miRbase (Slipp 14,0) ligger henholdsvis innenfor, flankeangrep, og i nærheten av CpG øyer (kollektivt vil vi referere til disse som MIR
CpG øyer, ytterligere fil 1: Tabell S1). Vi hypotese at avvikende metylering av MIR
CpG øyer kan oppstå under utvikling og progresjon av kreft. Derfor kan de brukes som kandidat gener ikke bare for prediksjon av kreft prognose, men også for gransking av metylering utfoldelse forening in vivo
. Dermed CpG øyene 9 sykdomsrelaterte MIR
gener, inkludert fem extragenic Mir
gener eller gensamlingene (MIR-9-3
, MIR-137
, MIR-200b /200a /429
, MIR-203
, og MIR-375
) og 4 intragenic gener eller gensamlingene (MIR-9-1
, MIR-34b /c
, MIR-193b /365 -1
, og MIR-210
), ble valgt som representant gener i denne studien (tilleggsfiler 1: Tabell S1). Metylering utfoldelse forening for tre av disse MIR
gener har ikke tidligere blitt etablert (tilleggsfiler 1: Tabell S2) [12, 14, 19-27]. Vi først screenet for magekreft (GC) - eller vertsrelaterte avvik MIR
metylering og deretter undersøkt metylering utfoldelse forening in vitro Hotell og in vivo
. Sammenhenger mellom clinicopathological funksjoner i GC pasienter og metylering av disse MIR
CpG øyene ble også analysert
Metoder
Cell linje kilder og cellekultur
Kilde informasjon om brukte cellelinjer brukt i denne studien:. RKO celle linje, gitt av Dr. Guoren Deng ved University of California San Francisco; SW480 og HCT116 ble gitt av Dr. Yuanjia Chen ved Peking Union Medical College Hospital; MKN74 og 293 T levert av Tokyo Medical and Dental University, PC-3 ble kjøpt fra cellelinjen Bank ved Chinese Academy of Medical Science; HL60 og KG1A ble hentet fra Hematologisk avdeling av Peking University første sykehuset; Du145 ble innhentet fra Hanmi Pharmacy Selskapet; Siha ble gitt av Peking University Folkets sykehus. HepG2 ble gitt av Dr. Qingyun Zhang, Calu3 og A549 av Dr. Zhiqian Zhang, H1299 og AGS av Dr. Chengchao Shou, MKN45 av Dr Youyong Lv, og andre cellelinjer (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa og GES-1) av Dr. Yang Ke, alt ved Peking University Cancer Hospital /Institute. Disse cellelinjer ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO 2, ved hjelp av forskjellige kulturmedier. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1A, A549, H1299, GES-en, HepG2, 293 T, Du145, og RKO ble dyrket i 90% RPMI-1640 og 10% FBS. PC-3 og AGS ble dyrket i 90% F-12 og 10% FBS. Calu3, HeLa og Siha ble dyrket i 90% DMEM og 10% FBS. SW480 og HCT116 ble dyrket i 90% DMEM: RPMI-1640 (1: 1)., Og 10% FBS
Pasienter og vevsprøver
Kirurgiske primære GC prøver og deres sammenkoblede ikke-kreft kirurgisk margin (SM) prøvene var samlet inn fra 112 inneliggende pasienter (gjennomsnittsalder 59,2 år [rekkevidde, 32-79], 80 hanner og 32 hunner, 78 ikke-kardiale GCS og 34 hjerte GCer, 40 GCer på pTNM stadium i ~ II og 59 på scenen III ~ IV) ved Peking University Cancer Hospital. Oppfølgingsdata for alle pasienter ble samlet i minst fem år. Alle kliniske prøver, så vel som histopatologisk og oppfølging informasjon for hvert tilfelle ble oppnådd i henhold til vedtatte institusjonens retningslinjer. Gastric biopsier fra 13 friske forsøkspersoner og 38 gastritt polikliniske pasienter som samles inn fra samme sykehus ble brukt som ikke-kreftpasient kontroller. Før bisulfitt modifikasjon hver enkelt pasients mage genomisk DNA-prøve ble analysert for tilstedeværelse av H. pylori
-spesifikk 23 S rDNA
av en PCR-assay som tidligere beskrevet [28]. De Institutional Review Styrene i Peking University Cancer Hospital og Institutt godkjent studiet (É1041207), og alle pasienter ga skriftlig informert samtykke.
DNA-ekstraksjon og bisulfite modifikasjon
kreft cellelinje og vevsprøve genomisk DNA (1,8 mikrogram) ble isolert ved hjelp av fenol /kloroform-ekstraksjon [29]. De unmethylated cytosinrestene i DNA-prøvene ble omdannet til uracil residuer (blir tymidin-rester i PCR-produkter) ved tilsetning av 5 M natrium-bisulfitt [30]. Den Wizard® DNA Clean-Up System Kit (Promega) ble brukt til å rense bisulfit behandlede DNA før PCR forsterkning.
PCR forsterkning og kvantifisering av MIR
CpG island metylering av DHPLC
CpG-free universal primer sett ble brukt til å forsterke Mir
CpG øyer med hot-start PCR polymerase (tilleggsfiler 1: Figur S1 og tilleggsfiler 1: Tabell S3). Sekvenser av CpG øyer innebygd eller flankert disse relaterte Mir
gener ble brukt til å designe primere. PCR-produktene ble deretter analysert kvantitativt ved DHPLC på WAVE® DNA-fragment Analysis System [31]. Elueringsprofiler av MIR-9-3
, MIR-200b
, og MIR-203
metylering ble analysert med en ultrafiolett detektor; annet MIR
genet metylering ble oppdaget med posten kolonnen HSX-3500 tilbehør (Transgenomic, Inc., Omaha, USA) og en høy følsomhet fluorescens (FL) detektor (eksitasjon ved 450 nm, emisjon ved 520 nm) [32 ]. Metylert og unmethylated Mir
genet PCR produktene ble atskilt med en DNASep® analytisk kolonne (Transgenomic) på tilsvarende delvis denaturering temperatur (tilleggsfiler 1: Tabell S3 og figur S2-10). Topparealene som tilsvarer de metylerte og unmethylated PCR-produktene ble anvendt for å beregne hvor stor andel av metylert CpG mir
øy [andelen av metylerte kopier = metylering-toppareal /totalt toppareal] som tidligere beskrevet [33]. M.SssI-
metylert genomisk DNA fra blodprøver ble anvendt som en positiv kontroll. Figur 1 DHPLC kromatogrammene og bisulfite sekvensering av 7 MIR CpG øyer i representative cellelinjer og prøver mage vev. Både humant perifert blod-DNA (blod) og dens M.Sss
I-metylert produkt (M.BLOOD) ble anvendt som kontroller. Alle CpG steder i amplicon av hver MIR
CpG island er også oppført over resultatene av bisulfite sekvensering. Hver rad representerer en klone; hver rosa stolpe representerer et denaturert CpG nettsted. Den tilsvarende kromatogram av hver sekvensert prøve (høyre kolonne) vises (venstre kolonne).
Bisulfite klone-sekvense
Fresh PCR-produkter fra Mir
CpG øyer forsterket med CpG-frie universale primersett ble klonet med den pGEM-T Easy kit (Promega, Madison, USA) og sekvensert med et Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer på SinoGeneMox Company (Beijing, Kina).
Utvinning av RNA og påvisning av moden miRNA nivå med kvantitative RT-PCR-analyser
Totalt 50 ng RNA ble ekstrahert fra ferske vevsprøver eller cellelinjer som bruker TRIzol reagens (Life Technologies, Carlsbad, USA) i henhold til produsentens protokoll. Tilsvarende cDNA prøvene ble syntetisert ved hjelp av TaqMan® mikroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) med Mir
-spesifikk stilk-løkke inverse transkripsjon (RT) primere (spesielle MIR-375
# RT000564, Mir-34b
# RT000427, MIR-137
# RT000593, og MIR-9
# RT000583). RT-betingelser var 16 ° C i 30 minutter ➔ 42 ° C i 30 minutter ➔ 85 ° C i 5 minutter. De miRNA nivåer ble deretter analysert ved hjelp av en TaqMan Gene Expression Master Mix kit (Life Technologies) med tilsvarende sonde og primere (Life Technologies, MIR-375
# TM000564, Mir-34b
# TM000427, MIR-137
# TM000593, og MIR-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # RT001093 og # TM001093) ble anvendt som intern referanse. PCR sykkel betingelsene var 95 ° C i 10 minutter ➔ etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 20 sek ➔ 60 ° C i 1 min. Expression nivåer av MIR-200B Hotell og MIR-210
ble bestemt ved hjelp av en standard polyA RT-PCR-analyse. Sekvenser av RT adapterprimeren, det universelle inverse primeren og U6
primer i det faste polyA RT-PCR-analyse er vist i Tilleggs fil 1: Tabell S5. RT Betingelsene var 55 ° C i 5 minutter ➔ etterfulgt av 25 ° C i 10 min ➔ 42 ° C i 1 time ➔ og 70 ° C i 5 minutter. PCR sykkel betingelsene var 95 ° C for10min ➔ etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 20 sek ➔ og 61 ° C i 1 min.
Statistisk analyse
SPSS 16,0 Trend
-test og Pearson kine- kvadrat-test ble anvendt for å analysere MIR
metylering frekvensforskjellen mellom normale biopsier, gastritt lesjoner, GC og SM prøver. Kruskal-Wallis H
-test og enveis ANOVA ble brukt til å analysere Mir
metylering andel forskjeller mellom normale biopsier, gastritt lesjoner, GC og SM prøver. Fishers eksakte test, Pearsons Chi-kvadrat test, og Trend
-test ble brukt til å analysere sammenhengen mellom MIR
metylering positiver og clinicopathological funksjoner. Mann-Whitney U
-test og Student t
-test ble brukt til å analysere sammenhengen mellom andelen metylert MIR
alleler og clinicopathological funksjoner. Kaplan-Meier og Cox-proporsjonal fare metoder ble brukt for univariat og multivariat analyse for å sammenligne total overlevelse av GC pasienter med forskjeller i metylering status for Mir
CpG øyer. Alle statistiske tester var tosidig, og P
< 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Karakterisering av metylering eller demetylering av 6 MIR
CpG øyer knyttet til utvikling av GCer
Vi forsterket bisulfitt behandlet maler av 9 representative Mir
CpG øyer med CpG-frie primere og utviklet 9 DHPLC analyser for å analysere metylering status av CPG øyene i PCR-produkter av 4 intragenic Mir
gener (MIR-9-1
, Mir-34b
, MIR-193b
, MIR-210
) og 5 extragenic Mir
gener (MIR-9-3
, MIR-137
, MIR-200b
, MIR-203
og MIR-375
), henholdsvis (figur 1, tilleggsfiler 1: Tabell S3, og om tilleggsfiler 1: Figur S1-S10). Disse DHPLC analyser viste at metylering positiv rate av 5 MIR
CpG øyer (MIR-9-1
, MIR-9-3
, Mir-34b
, MIR-137
, og MIR-210
) ble signifikant øket samtidig med alvorlighetsgraden av patologiske forandringer i magen. Disse funnene sterkt at metylering av disse MIR
CpG øyer er knyttet til utvikling av GCer (trend
-test, MIR-9-1
, P <
0,001; MIR-9- 3
, P <
0,001; Mir-34b
, P =
0.008, MIR-137
, P <
0,001; MIR-210
, P
= 0,001; Tabell 1). MIR-9-1
metylering ble påvist i 18 av 28 GCer (følsomhet, 64%), men bare i to av 48 normale eller gastritt biopsier viste metylering (spesifisitet, 96%). Selv metylering av MIR-200b
ble påvist i nesten alle mage vevsprøver, andelen av metylert MIR-200b
i normale eller gastritt vev (46% ~ 100%) var signifikant høyere enn i både SM og GC prøver (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U-
test, gastritt biopsier versus SMS, P =
0,001, Tabell 1). Dette tyder på at Mir-200B
demetylering var en GC, pasientspesifikk hendelse. Bisulfite sekvensering av disse MIR
CpG øyer bekreftet data innhentet fra DHPLC analyse (figur 1) .table en Metylering status av MIR CpG øyer i mageslimhinnen prøver med ulike patologiske forandringer i GC og ikke-kreft kontrollpasienter
MIR
CpG øyer
Gruppe av mageprøver
Mir
metylering
Positiv hastighet
Andel (%) av denaturert MIR
i MIR
metylering-positive prøvene Book positive rate (%)
χ
2
-verdi
Trend
-test (P
-verdi)
Median product: [25% ~ 75%]
Mean
± SD
t /F /χ
2
-verdi
P
-verdi
MIR-9-1
Normal
1/13 (7,7)
27,598
< 0,001 en hoteller, NA hoteller, NA
gastritt
1/35 (2,9) hoteller, NA
SM
9/28 (32,1)
17 [13-30]
20 ± 4
t
= -3,039
0,005 g
GC
18/28 (64,3)
29 [19-40]
32 ± 4
MIR-9-3
Normal
6/13 (46,2)
23,389
< 0,001 en
38 [31-59]
43 ± 6
F
= 1.639
0,189 h
gastritt
15/37 (40,5)
43 [36-48]
42 ± 2
SM
26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2
GC
26/28 (92,9)
37 [26-43]
36 ± 2
Mir-137
Normal
5/13 (38,5)
18,626
< 0,001 en
10 [4-41]
χ
2
= 8,065
0.045 d
gastritt
24/38 (63,2)
19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3g
GC
24/26 (92,3)
36 [20-51]
37 ± 4
Mir-34b

Normal
6/13 (46,2)
6,947
0,008 en
13 [7-19]
χ
2
= 0,658
0,883 d
Gastritt
13/36 (36,1)
11 [3-20]
SM
22/28 (78,6)
11 [4-18]
GC
19/28 (67,9)
10 [5-32]
MIR-200b
Normal
13/13 (100)
0,486
0,922 f
54 [52-83]
χ
2
= 17,883
< 0,001 d
gastritt
35/36 (97,2)
52 [46-100] e
SM
27/28 (96,4)
44 [40-47]
GC
27/28 (96,4)
48 [40-53]
MIR-210 <.no> Normal
2/13 (15,4)
11,908
0,001 en hoteller, NA hoteller, NA
gastritt
13/38 (34,2)
7 [ ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81,5)
11 [5-22]
GC
16/27 (59,3)
9 [4-16]
MIR-193b
Normal
0/13
7,045
0,008 b hoteller, NA hoteller, NA
gastritt
2/37 (5,4)
NA
SM
7/28 (25,0)
5 [4-14]
GC
4/28 (14,3)
5 [2-12]
speil 203
Normal
5/13 (38,5)
5,617
0,018 b
32 [29-75]
χ
2
= 2,957
0,398 d
gastritt
20/38 (52,6)
31 [26-36]
SM
21/28 (75,0)
34 [30-36]
GC
11/28 (39,3) c
32 [29-35]
MIR-375
Normal
0/13
12,266
< 0,001 b hoteller, NA hoteller, NA
gastritt
13/38 (34,2)
3 [3-4] e
SM
16/28 (57,1)
7 [4 -14]
GC
8/28 (28,6) c
17 [8-21]
en, Trend
test, blant Normal, gastritt, SM og GC prøver; b, Trend
-test, blant Normal, gastritt, og SM prøver; c, Pearsons Chi-kvadrat test, GC versus SM: MIR-203
, χ
2
= 7,292, P =
0,007; MIR-375
, χ
2
= 4,667, P =
0,031; d, Kruskal-Wallis H
-test; e, Mann-Whitney U
-test: Gastritt versus SM, MIR-200b
, U
= 230.000, P =
0,001; Gastritt versus GC, MIR-375
, U
= 46.000, P =
0,011; SM versus GC, MIR-137
, U
= 170.000, P
= 0,009; f, Pearsons Chi-kvadrat test, blant Normal, gastritt, SM og GC prøver; g. Paret t
-test: SM versus GC, MIR-137
, t
= -2,652, P =
0,014; h. Enveis ANOVA; NA, ikke tilgjengelig.
Bortsett MIR-9-1 Hotell og MIR-137
, metylering positive priser eller andeler av denaturert MIR-9-3
, Mir-34b
, MIR-210
, og MIR-200b
i GCer var lik de i SMS (tabell 1). For å validere om metylering av noen av disse mir
gener er en felt-effekt skjer samtidig i begge kreft og ikke-cancervev i magen etter den samme eksponering for miljømessige faktorer, vi har oppdaget at metylering av data i en annen undergruppe av GC og SM prøver fra 84 pasienter, og fant at den positive rate og andel av denaturert MIR-9-1
i GCer var fortsatt betydelig høyere enn i SMS (60,7% versus 32,1%, Pearsons Chi-kvadrat test, P =
0,001, Logg rank test, P
< 0,001; tilleggsfiler 1: Tabell S4, Subset-2). Den gjennomsnittlige andelen av metylert MIR-137
var også betydelig høyere i GCer enn sms (Mean
± SD
, 26 ± 2 versus 38 ± 2, parings t-
test, P <
0,001). Som forventet en betydelig forskjell i positiv rate eller andelen av metylert MIR-9-3, ble Mir-34b
, MIR-210
, og MIR-200b
ikke observert mellom GC og SM prøver. Disse resultatene bekrefter at Mir-9-1 Hotell og MIR-137
metylering var en svulst spesifikk hendelse og at Mir-9-3
, Mir-34b
, og MIR-210
metylering, samt MIR-200b
demetylering, var en felt-effekt som skjedde under magekreftutvikling.
Videre, etter den positive frekvensen av denaturert MIR-203 Hotell og MIR-375 gradvis økt fra normal til gastritt til SM prøver, men betydelig redusert i GCer sammenlignet med SMS (Pearson Chi-kvadrat test, MIR-203
, P =
0,007; MIR-375
, P =
0,031; Tabell 1). I undergruppen-2 prøver, vi også analysert MIR-375
metylering og funnet mer MIR-375
metylering i sms enn i GCer igjen (Pearson Chi-kvadrat test, P =
0,034, ytterligere fil 1 : Tabell S4). Disse dataene antyder at MIR-375 plakater (og MIR-203
) metylering ikke er GC-spesifikke og kan være en slags vert tilpasning i de ikke-ondartet vev til utvikling av GCer.
MIR
metylering og H. pylori
infeksjon
å finne ut om H. pylori
infeksjon spiller en rolle i MIR
metylering, så vi for H. pylori
-spesifikk 23 S rDNA
i mage genomiske DNA-prøver ved PCR, og fant at H. pylori
-positivt hastighet økes samtidig med alvorlighetsgraden av patologiske forandringer [15,4% (2 av 13) av normal gastrisk biopsier, 52,6% (20 av 38) av gastritt lesjoner og 69,0% (29 av 42) SM biopsier; trend
-test, P =
0,001] og redusert i GC prøver (18 av 42 = 42,9%; GCer versus SMS, Pearson Chi-kvadrat test, P
= 0,016; tilleggsfiler 1: Figur S11 ). H. pylori
-positive gastritt /normale og SM prøvene viste signifikant høyere metylering av MIR-210
metylering enn H. pylori
-negative prøver (P
= 0,036 og 0,022, henholdsvis figur 2A og B). Figur 2 Sammenligning av mir metylering i forskjellige mageslimhinnen prøver med og uten tilstedeværelsen av Helicobacter pylori. (A) Normal eller gastritt biopsier fra kontroll polikliniske pasienter uten ondartet sykdom; (B og C) Kirurgiske marger og tumorprøver fra pasienter med gastrisk karsinom, henholdsvis; H. pylori-spesifikke 23 S rDNA
ble påvist ved PCR.
Invers sammenheng mellom MIR
metylering av CpG øyer og deres tilsvarende uttrykk nivåer
å undersøke forholdet mellom de ovennevnte avvik MiR
metylering og transkripsjon av den tilsvarende MIR
genet, vi kvantifisert de modne miRNA nivåer av MIR-9-1
, MIR-9-3
, Mir-34b
, MIR-137
, MIR-210
, MIR-200b
, (og MIR-375
), hvis metylering status er relatert til utviklingen av GC (og GC vert tilpasning) som beskrevet ovenfor, i et sett av humane cellelinjer med ulik metylering status for Mir
CpG øyer. Metylering status for hver MIR
CpG øy i disse cellelinjene ble bestemt av DHPLC som illustrert i tilleggsfiler 1: S2-S10 figur. Resultater av kvantitative RT-PCR-analyser viste at i de testede cellelinjer som inneholder denaturert Mir
alleler de modne miRNA nivåer av alle 6 GC-relaterte MIR
gener og en rekke tilpasning Mir
genet var betydelig lavere enn de påvises i cellelinjene som inneholder unmethylated Mir
alleler (3A-G). Figur 3 Forholdet mellom Ekspresjonsnivået og metylering status av mir gener i humane cellelinjer og prøver gastrisk vev. (A-G) Den korrelasjonsanalyse mellom metylering andel av miRNA CpG øyer og deres modne miRNA uttrykk nivåer i målet CpG island denaturert og unmethylated humane cellelinjer; (H-P) Uttrykk for miRNAs i 20 sammenkoblede, friske magekarsinom prøver; (U) Target CpG island unmethylated cellelinjer; (M) Target CpG island metylert cellelinjer; (U /M) Target CpG island delvis denaturert cellelinjer.
Vi videre analysert miRNA nivåer av 20 par frisk GC og SM prøver og fant en signifikant høyere uttrykk nivå av miRNA-200b, etter miRNA-375, og miRNA-210 i sms enn i GCer (paret t
-test: Ps
≤0.030, ytterligere fil 1: Figur S12). De miRNA-137 nivåer i sms var også høyere enn i GCer, men var ikke statistisk signifikant (P =
0,059). Uttrykket nivåer av miRNA-9 og miRNA-34b var lik mellom SMS og GCer. Viktigst, ble det observert en invers sammenheng mellom MIR
metylering og tilsvarende uttrykk nivå for MIR-9-1
, MIR-9-3
, MIR-137
, og MIR-200b
i disse mage vevsprøver (Spearman Rank korrelasjonsanalyse, MIR-9-1
, r
s
= -0,533, P =
0,001; MIR-9-3
, r
s
= -0,464, P =
0.004, MIR-137
, r
s
= -0,378, p =
0,019, MIR-200b
, r
s
= -0,409, P =
0,010; figur 3H-K). En svak invers metylering utfoldelse forholdet ble også funnet for MIR-375
i disse vevsprøver (r
s
= 0,287, P =
0,085; figur 3O). En slik sammenheng ble ikke observert for Mir-34b Hotell og MIR-210 plakater (figur 3L, N).
MIR
metylering korrelert til clinicopathological kjennetegn ved GC pasienter
å utrede muligheten for bruker MIR
metylering som en prognose prediktor for GCer, vi fast bestemt på utbredelsen av metylering av 7 MIR
gener og analysert forholdet mellom clinicopathological funksjonene i GC og de tilsvarende metylering nivåer av disse Mir
CpG øyer studerte features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive

• Nærvær av S100A9-positive inflammatoriske celler i kreftvev korrelerer med en tidlig fase kreft og en bedre prognose i pasienter med magekreft
• Gjorde overføring av Helicobacter pylori fra mennesker forårsake et sykdomsutbrudd i en koloni av Stripe-faced dunnarts (Sminthopsis macroura)