Caractérisation de la méthylation gastrique liée au cancer humain de 9 îles miR CpG et la répression de leurs expressions in vitro et in vivo

Caractérisation de la méthylation gastrique humaine liés carcinome de 9 miR
îlots CpG et la répression de leurs expressions in vitro
et dans le fond de vivo
Résumé
les gènes Beaucoup miR sont situé à l'intérieur ou autour des îlots CpG. Il est difficile de savoir si la méthylation de ces îlots CpG refoule miR de la transcription régulièrement. Les objectifs de cette étude sont de caractériser le carcinome gastrique (GC) méthylation de la PI miR
îlots CpG et sa relation avec le statut de méthylation de méthodes de miRNA expression. 9 représentant miR
îlots CpG dans un panel de lignées cellulaires et des échantillons gastriques humaines (y compris les 13 biopsies normales, 38 biopsies de gastrite, 112 paires de glucocorticoïdes et leurs échantillons de marge chirurgicale) a été analysée par bisulfite-CLHPD et le séquençage. niveaux de miARN mature ont été déterminées avec RT-PCR quantitative. la fréquence de méthylation: Résultats de relations entre miR
méthylation, la transcription, le développement de GC, et les caractéristiques clinico ont été analysées statistiquement. 5 miR
îlots CpG (miR-9-1
, miR-9 -3
, miR-137
, miR-34b
et miR-210
) progressivement augmenté, tandis que la proportion de méthylé miR-200b
progressivement diminué au cours de la cancérogenèse gastrique (Ps
lt &; 0,01). Plus miR-9-1
méthylation a été détectée dans 62% -64% des échantillons de GC et 4% des échantillons normaux ou gastrite (18/28 contre 2/48; odds ratio, 41,4; P
<0,01). miR-210
méthylation a montré une forte corrélation avec H. pylori
infection. miR-375
, miR-203
et miR-193b
méthylation pourrait être l'adaptation d'accueil au développement de GCS. La méthylation de ces îlots CpG
miR a été constamment montré pour réduire de manière significative les niveaux de miARN correspondants présentés dans des lignées cellulaires humaines. La relation inverse a également été observée pour miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
et
miR-200b dans les échantillons gastriques. Parmi 112 patients du GC, miR-9-1
méthylation était un prédicteur favorable indépendant de la survie globale des patients atteints de GC à la fois une analyse univariée et multivariée (P
< 0,02). Conclusions de
En conclusion , la modification du statut de méthylation de 6 de 9 testé miR
îlots CpG a été caractérisée dans la carcinogenèse gastrique. miR-210
méthylation en corrélation avec H. pylori
infection. miR-9-1
méthylation peut être un événement spécifique à GC. Méthylation de miR
îlots CpG peuvent considérablement réguler à la baisse leur transcription régulièrement.
Contexte
miARN sont une classe abondante de petits ARN non codants qui régulent principalement l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. Ils jouent un rôle essentiel dans le renouvellement et la différenciation des cellules souches et aider à maintenir des lignées de cellules. Des recherches antérieures ont montré que dans le cancer plusieurs des miR gènes tels que miR-200b /200a /429
, miR-21
, miR-30b
,
miR-30d, miR
-31
et miR-423
sont surexprimés, tandis que d'autres gènes miR
tels que miR-143
et miR-145
sont downregulated [1-3]. Les preuves suggèrent que les changements dans l'expression des miARN se produisent fréquemment dans de nombreux cancers et ces variations soit contribuent à la cancérogenèse ou reflètent le développement et la progression des cancers.
Il y a un certain nombre de voies qui peuvent influer sur les niveaux de miARN matures dans des cellules et des tissus, tels que amplification génique ou la suppression, la régulation positive de la transcription ou la régulation négative, le traitement post-transcriptionnelle, et la dégradation miRNA [4-7]. Il est bien connu que certains miR intragenic
gènes, tels que miR-218-2
, sont transcrits de manière coordonnée avec leurs gènes hôtes grâce à des mécanismes de co-régulation [8]. Cependant, de nombreux gènes miR
sont extragénique et des gènes tels que miR-9-1
sont transcrits dans un modèle de gène indépendant hôte une certaine proportion de intragenic miR
[9]. Parce que la région promotrice exacte de la plupart des gènes miR
ne sont pas caractérisés, en particulier en ce qui concerne les gènes miR
extragéniques, les mécanismes de régulation exactes de miR de la transcription sont loin d'être clair.
Méthylation ou hyperméthylation îlots CpG dans la région de transcription à partir des sites (TSS) est généralement reconnu pour réprimer la transcription des gènes épigénétique. Contrairement à des gènes codant pour des protéines qui peuvent étendre sur plusieurs îlots CpG, le miR
gènes peuvent être plus courte qu'une île CpG, et dans certains cas, plusieurs miR
gènes (ie, le groupe de gènes d'un miR de) peut être situé à l'intérieur ou flanquant un seul îlot CpG (fichier supplémentaires 1: Tableau S1). gènes, tels que let-7a-3
et miR-34a
méthylation Aberrant des îlots CpG associés à miR
, est fréquemment observé dans de nombreux cancers [10, 11]. Il a été suggéré que la méthylation des îlots CpG qui sont associés à des gènes mir (c.-à-miR-203
, miR-152
, miR-124-1
, miR-34b /c
, miR-129-2
, miR-9-1
,
miR-130b, miR-124-2
et miR-181c
) pourraient inversement en corrélation avec leur les niveaux d'expression [12-17]. Cependant, si oui ou non la transcription des gènes miR de est régulièrement affectée par le statut de méthylation de miR
îlots CpG n'a pas été systématiquement étudiés.
Il est bien connu que la méthylation ou la déméthylation d'îlots CpG anormale dans un petit la proportion (< 1%) de la population cellulaire peut être sensible détectés dans des échantillons de tissus cellulaires hétérozygotes. Cela démontre l'avantage de l'analyse de la méthylation sur les altérations de l'expression génique à l'ARN et des protéines qui ne peut être détectée quand un tel changement est présent dans une proportion importante d'une population de cellules dans un échantillon [18]. Notre analyse bioinformatique montre 50, 9, et 70 721 gènes humains miR
dans le miRBase (Version 14.0) sont situés, respectivement, dans, flanquant, et à proximité des îlots CpG (collectivement, nous ferons référence à ceux-ci que miR
îlots CpG; fichiers supplémentaires 1: Tableau S1). Nous émettons l'hypothèse que la méthylation aberrante des îlots CpG de miR peut se produire au cours du développement et de la progression des cancers. Par conséquent, ils pourraient être utilisés comme gènes candidats non seulement pour la prédiction du pronostic du cancer, mais aussi pour l'enquête de l'association méthylation expression in vivo
. Ainsi, les îlots CpG de 9 miR
gènes liés à la maladie, y compris les gènes de 5 extragénique miR ou groupes de gènes (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b /200a /429
, miR-203
et miR-375
) et 4 gènes intragéniques ou groupes de gènes (miR-9-1
, miR-34b /c
, miR-193b /365 -1
et miR-210
), ont été choisis comme les gènes représentatifs dans la présente étude (fichier supplémentaires 1: Tableau S1). L'association méthylation-expression pour 3 des gènes de ces miR n'a pas été établi précédemment (fichiers supplémentaires 1: Tableau S2) [12, 14, 19-27]. Nous avons d'abord projeté pour le carcinome gastrique (GC) - ou aberrante miR liée hôte
A méthylation puis étudié l'association méthylation-expression in vitro et in vivo

. Les associations entre les caractéristiques clinico des patients du GC et la méthylation de ces miR
îlots CpG ont également été analysés
Méthodes
sources de lignée cellulaire et culture cellulaire de l'information Source de lignées cellulaires utilisées utilisées dans cette étude:. Cellules RKO ligne, fourni par le Dr Guoren Deng à l'Université de Californie à San Francisco; SW480 et HCT116 ont été fournies par le Dr Chen Yuanjia à Peking Union Medical College Hospital; MKN74 et 293 T fournies par Tokyo Université médicale et dentaire; PC-3 a été acheté à partir de la banque de cellules de ligne à l'Académie chinoise des sciences médicales; HL60 et KG1a ont été obtenus auprès du Département d'hématologie du premier hôpital Université de Pékin; DU145 a été obtenu à partir de Hanmi Pharmacy Company; Siha a été fourni par l'hôpital de Pékin gens de l'Université. HepG2 a été fourni par le Dr Qingyun Zhang, Calu3 et A549 par le Dr Zhiqian Zhang, H1299 et AGS par le Dr Chengchao Shou, MKN45 par le Dr Youyong Lv, et d'autres lignées cellulaires (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa et GES-1) par le Dr Yang Ke, tous à l'Université de Pékin cancérologie de L'Hôpital /Institut. Ces lignées cellulaires ont été cultivées à 37 ° C dans 5% de CO 2, en utilisant divers milieux de culture. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1a, A549, H1299, GES-1, HepG2, 293 T, DU145 et RKO ont été cultivées dans 90% RPMI-1640 et 10% de FBS. PC-3 et AGS ont été cultivées dans 90% de F-12 et 10% de FBS. Calu3, HeLa et Siha ont été cultivées dans DMEM 90% et 10% de FBS. SW480 et HCT116 ont été cultivées dans DMEM 90%: RPMI-1640 (1: 1). Et 10% de FBS
Patients et échantillons de tissus
échantillons chirurgicaux GC primaire et de leur marge chirurgicale (SM) des échantillons non cancéreux ont été appariés recueillies auprès de 112 patients hospitalisés (âge moyen 59,2 ans [gamme, 32-79], 80 hommes et 32 ​​femmes, 78 GCS non cardiaque et 34 GCS cardiaques; 40 GCS au stade pTNM I ~ II et 59 au stade III ~ IV) à l'Hôpital Universitaire du Cancer de Pékin. Les données de suivi pour tous les patients ont été recueillies pendant au moins cinq ans. Tous les échantillons cliniques, ainsi que des informations histopathologique et de suivi pour chaque cas ont été obtenus selon les directives institutionnelles approuvées. biopsies gastriques de 13 sujets sains et 38 patients en consultation externe gastrite recueillies à partir du même hôpital ont été utilisés comme non-cancéreux contrôles des patients. Avant modification par le bisulfite gastrique échantillon d'ADN génomique de chaque patient a été analysé pour déterminer la présence de H. pylori
spécifique de 23 S ADNr
par un dosage par PCR comme décrit précédemment [28]. Les Institutional Review Board de Pékin University Cancer Hospital et l'Institut a approuvé l'étude (É1041207), et tous les patients ont donné leur consentement écrit.
Extraction de l'ADN et la modification bisulfite
lignée cellulaire de cancer et l'ADN génomique de l'échantillon de tissu (1,8 pg) a été isolé par extraction au phénol /chloroforme [29]. Les résidus de cytosine non méthylés dans les échantillons d'ADN ont été convertis en résidus uracile (devenant des résidus thymidine dans les produits PCR) par l'addition de 5 M bisulfite de sodium [30]. amorce universelle Le kit ADN Wizard® système Clean-Up (Promega) a été utilisé pour purifier l'ADN traité au bisulfite avant amplification par PCR.
amplification PCR et la quantification des miR
CpG île méthylation par CLHPD
sans CpG ensembles ont été utilisés pour amplifier miR
îlots CpG par polymérase PCR de démarrage à chaud (fichier supplémentaire 1: Figure S1 et fichiers supplémentaires 1: Tableau S3). Des séquences d'îlots CpG embarqués ou flanquées des gènes de ces miR liés ont été utilisés pour concevoir les amorces. Les produits de PCR ont ensuite été analysées quantitativement par CLHPD sur l'ADN Fragment Analysis System WAVE® [31]. Les profils d'élution de miR-9-3
,
miR-200b, et miR-203
méthylation a été analysé avec un détecteur d'ultraviolet; autre miR de gène de la méthylation a été détectée avec la colonne de poste HSX-3500 Accessoire (Transgenomic, Inc., Omaha, États-Unis) et une fluorescence à haute sensibilité (FL) détecteur (excitation à 450 nm, émission à 520 nm) [32 ]. Les produits de PCR des gènes de miR méthylé et non méthylé ont été séparés par une colonne analytique DNASep® (Transgenomic) à la température correspondante partielle dénaturant (fichier supplémentaires 1: Tableau S3 et Figure S2-10). Les surfaces des pics correspondant aux produits de PCR méthylés et non méthylés ont été utilisés pour calculer la proportion de méthylé miR
île CpG [la proportion de copies méthylés = surface /surface du pic totale de méthylation pic] comme décrit précédemment [33]. M.SssI- de l'ADN génomique dénaturé à partir d'échantillons de sang a été utilisé comme témoin positif. La figure 1 chromatogrammes DHPLC et le séquençage au bisulfite de 7 îlots CpG miR dans des lignées cellulaires représentatives et des échantillons de tissus gastriques. L'ADN humain du sang périphérique (sang) et son M.Sss
produits I-méthylé (M.BLOOD) ont été utilisés comme témoins. Tous les sites CpG dans l'amplicon de chaque miR
îlot CpG sont également énumérés ci-dessus les résultats du séquençage bisulfite. Chaque ligne représente un clone; chaque barre rose représente un site CpG méthylé. Le chromatogramme correspondant de chaque échantillon séquencé (colonne de droite) est représenté (colonne de gauche).
Bisulfite clone-séquençage
produits de PCR frais de miR
îlots CpG amplifiés avec les jeux d'amorces universelles CpG-libres ont été clonés avec le kit pGEM-T Easy (Promega, Madison, Etats-Unis) et séquencés avec un 3730xl analyseur d'ADN Applied Biosystems à SinoGeneMox Company (Beijing, Chine).
Extraction de l'ARN et la détection du niveau de maturité miRNA avec les dosages RT-PCR quantitative
l'ARN total 50 ng a été extrait à partir d'échantillons frais de tissus ou de lignées cellulaires en utilisant le réactif Trizol (Life Technologies, Carlsbad, États-Unis) selon le protocole du fabricant. Correspondant échantillons d'ADNc ont été synthétisés en utilisant le kit TaqMan microARN Reverse Transcription (Life Technologies) avec miR
tige-boucle inverse spécifique de transcription (RT) amorces (spécifique pour miR-375
# RT000564, miR-34b
# RT000427, miR-137
# RT000593 et ​​miR-9
# RT000583). Les conditions de RT utilisées étaient 16 ° C pendant 30 min ➔ 42 ° C pendant 30 min ➔ 85 ° C pendant 5 min. Les niveaux de miARN ont ensuite été analysées en utilisant un kit Master Mix TaqMan Gene Expression (Life Technologies) avec la sonde et des amorces correspondant (Life Technologies, miR-375
# TM000564, miR-34b
# TM000427, miR-137
# TM000593 et ​​miR-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # RT001093 et ​​# TM001093) a été utilisé comme référence interne. Les conditions de cycle de PCR étaient 95 ° C pendant 10 minutes ➔ suivie par 40 cycles de 95 ° C à 60 ° C de 20 secondes pendant 1 min. niveaux de miR-200b
et miR-210
expression ont été déterminées en utilisant un dosage polyA RT-PCR standard. Sequences de l'adaptateur amorce RT, l'inverse primaire universelle et l'amorce de l'U6 dans le dosage régulier polyA RT-PCR sont présentés dans les fichiers supplémentaires 1: Tableau S5. RT conditions étaient 55 ° C pendant 5 min suivie de ➔ 25 ° C pendant 42 ° C de 10 min pendant 1 h ➔ et 70 ° C pendant 5 min. Les conditions de cycle de PCR étaient 95 ° C for10min ➔ suivie de 40 cycles de 95 ° C pendant 20 sec ➔ et 61 ° C pendant 1 min. L'analyse statistique
SPSS 16.0 Tendance
-test et Chi- de Pearson essai carré ont été utilisés pour analyser la différence de fréquence de méthylation de la miR entre biopsies normales, des lésions de gastrite, des échantillons GC et SM. Kruskal-Wallis H
-test et One-Way ANOVA ont été utilisées pour analyser les différences de méthylation proportion du miR entre biopsies normales, des lésions de gastrite, GC, et des échantillons SM. test exact de Fisher, test du chi carré de Pearson, et Trend
-test ont été utilisées pour analyser l'association entre miR
méthylation des taux positifs et les caractéristiques clinico. Le Mann-Whitney U
-test et étudiants de t
-test ont été utilisés pour analyser l'association entre la proportion d'allèles miR
méthylés et les caractéristiques clinico. méthodes de Kaplan-Meier et Cox-risques proportionnels ont été utilisés pour l'analyse univariée et multivariée pour comparer la survie globale des patients atteints de GC avec des différences dans l'état de méthylation de miR
îlots CpG. Tous les tests statistiques étaient bilatéraux et P
< La caractérisation des résultats de 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. de la méthylation ou la déméthylation de 6 miR
îlots CpG liés au développement de GCS
Nous avons amplifié modèles de bisulfite traités de 9 représentatifs miR
îlots CpG amorces avec CpG-libres et développé 9 essais de dHPLC pour analyser l'état de méthylation des îlots CpG dans les produits de PCR de 4 gènes intragéniques miR
(miR-9-1
, miR-34b
, miR-193b
, miR-210
) et 5 gènes miR
extragéniques (miR-9-3
, miR-137
,
miR-200b, miR-203 et
miR-375
), respectivement (figure 1, les fichiers supplémentaires 1: Tableau S3 et fichiers supplémentaires 1: Figure S1-S10). Ces essais de dHPLC ont révélé que le taux positif de méthylation de 5 miR
îlots CpG (miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, et miR-210
) a été significativement augmentée en même temps que la gravité des modifications pathologiques de l'estomac. Ces résultats suggèrent fortement que la méthylation de ces miR
îlots CpG est liée au développement de glucocorticoïdes (tendance
-test, miR-9-1
, P <
0,001; miR-9- 3
, P <
0,001; miR-34b
, P = 0,008
; miR-137
, P <
0,001; miR-210
, P
= 0,001; Tableau 1). miR-9-1
méthylation a été détectée dans 18 des 28 glucocorticoïdes (sensibilité 64%), mais seulement chez 2 des 48 biopsies normales ou gastrite montré méthylation (spécificité 96%). Bien que la méthylation du
miR-200b a été détectée dans presque tous les échantillons de tissus gastriques, la proportion de méthylée
miR-200b dans les tissus normaux ou les gastrites (46% ~ 100%) est significativement plus élevé que celui dans les deux SM et GC échantillons (41% ~ 47%) (test de Mann-Whitney U-, biopsies de gastrite contre SMs, P = 0,001;
tableau 1). Ceci suggère que miR-200b
déméthylation était un GC, un événement spécifique au patient. séquençage bisulfite de ces miR
îlots CpG ont confirmé les données obtenues à partir de l'analyse de CLHPD (Figure 1) .Table état 1 méthylation des îles miR CpG dans des échantillons de muqueuse gastrique avec différents changements pathologiques dans GC et les patients témoins non-cancéreuses de miR îles
CpG
Groupe d'échantillons gastriques
miR
-Methylation
taux positif
Proportion (%) de méthylé miR
dans les échantillons de méthylation positif du miR
taux positif (%)
χ 2
-value
tendance
-test (P
-value)
médian
[25% ~ 75%]
Mean
± SD
t /F /χ 2
-value
P
-value
miR-9-1
normal
1/13 (7.7)
27,598
< 0,001 un
NA NA
de Gastrite
1/35 (2,9)
NA
SM
9/28 (32,1)
17 [13-30]
20 ± 4
t
= -3,039
0,005 g
GC
18/28 (64,3)
29 [19-40]
32 ± 4
miR-9-3
normal
6/13 (46,2)
23,389
< 0,001 un
38 [31-59]
43 ± 6
F
= 1.639
0.189 h
Gastrite
15/37 (40,5)
43 [36-48]
42 ± 2
SM
26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2
GC
26/28 (92,9)
37 [26-43]
normal de 36 ± 2
miR-137
5/13 (38,5)
18,626
< 0,001 un
10 [4-41]
χ 2
= 8,065
0,045 d
Gastrite
24/38 (63,2)
19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3g
GC
24/26 (92,3)
36 [20-51]
37 ± 4
miR-34b

normal 6/13 (46,2)
6.947
0,008 un
13 [7-19]
χ 2
= 0,658
0,883 d
Gastrite
13/36 (36,1)
11 [3-20]
SM
22/28 (78,6)
11 [4-18]
GC
19/28 (67,9)
10 [5-32]
miR-200b
normal 13/13 (100)
0,486
0,922 f
54 [52-83]
χ 2
= 17,883
< 0,001 d
35/36 (97,2)
52 [46-100] e de Gastrite
SM
27/28 (96,4)
44 [40-47]
GC
27/28 (96,4)
48 [40-53]
miR-210

normal 2/13 (15,4)
11,908
0,001 un
NA
13/38 (34,2)
7 de [NA de Gastrite ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81,5)
11 [5-22]
GC
16/27 (59,3)
9 [4-16]
miR-193b
normal 0/13
7.045
0,008 b
NA NA
de Gastrite
2/37 (5,4)
NA
SM
7/28 (25,0)
5 [4-14]
GC
4/28 (14,3)
5 [2-12]
Mir- normale de 203
5/13 (38,5)
5.617
0,018 b
32 [29-75]
χ 2
= 2,957
0,398 d
Gastrite
20/38 (52,6)
31 [26-36]
SM
21/28 (75,0)
34 [30-36]
GC
11/28 (39,3) c
32 [29-35]
normal de miR-375
0/13
12,266
< 0,001 b Gastrite NA
NA
13/38 (34,2)
3 [3-4] e
SM
16/28 (57,1)
7 [4 -14]
GC
8/28 (28,6) c
17 [8-21]
a, tendance
test, parmi normal, gastrite, SM et des échantillons GC; b, Trend
-test, parmi les échantillons SM Normal, gastrite, et; c, test du chi carré de Pearson, GC par rapport SM: miR-203
, χ 2
= 7.292, P = 0,007
; miR-375
, χ 2
= 4,667, P = 0,031
; d, Kruskal-Wallis H
-test; e, Mann-Whitney U
-test: Gastrite contre SM,
miR-200b, U
= 230.000, P = 0,001
; Gastrite contre GC, miR-375
, U
= 46.000, P = 0,011
; SM contre GC, miR-137
, U
= 170.000, P
= 0,009; f, test du chi carré de Pearson, entre, gastrite, des échantillons de SM et GC normales; g. Couplé t
-test: SM contre GC, miR-137
, t
= -2,652, P = 0,014
; h. One-way ANOVA; NA, non disponible.
Sauf pour miR-9-1
et miR-137
, les taux ou les proportions de méthylé miR-9-3
positifs méthylation, miR-34b
, miR-210
et miR-200b
dans GCS étaient semblables à ceux de SMs (tableau 1). Pour valider si la méthylation de certains gènes de ces miR est un effet de champ se produit simultanément dans les deux tissus cancéreux et non cancéreux dans l'estomac en raison de la même exposition à des facteurs environnementaux, nous avons détecté les données de méthylation dans un autre sous-ensemble de GC et des échantillons SM de 84 patients et a constaté que le taux et la proportion de méthylé miR-9-1
positif dans GCS était encore nettement plus élevé que dans SMs (60,7% versus 32,1%; test du chi carré de Pearson, P =
0,001; Inscrivez-rank test, P
< 0,001; fichiers supplémentaires 1: Tableau S4, Subset-2). La proportion moyenne de la méthylé miR-137
a également été significativement plus élevée chez GCS que SMs (moyenne ± SD

, 26 ± 2 contre 38 ± 2, Couplé T-
test, P <
0,001). Comme prévu une différence significative dans le taux positif ou la proportion de miR-9-3 méthylé, miR-34b
, miR-210
et
miR-200b n'a pas été observée entre les GC et les échantillons SM. Ces résultats ont confirmé que miR-9-1
et miR-137
méthylation a été un événement spécifique de la tumeur et que miR-9-3
, miR-34b
et miR-210
méthylation, ainsi que miR-200b
déméthylation, était un effet de champ qui a eu lieu au cours de la cancérogenèse gastrique.
en outre, le taux positif de méthylé miR-203
et miR-375
progressivement augmenté de la normale à la gastrite à des échantillons SM, mais significativement diminué par rapport aux glucocorticoïdes SMs (test chi carré de Pearson, miR-203
, P = 0,007
; miR-375
, P = 0,031
; Tableau 1). Dans le sous-2 échantillons, nous avons également analysé miR-375
méthylation et trouvé plus miR-375
méthylation dans SMs que dans GCS nouveau (test chi carré de Pearson, P = 0,034
; fichiers supplémentaires 1 : Tableau S4). Ces données impliquent que miR-375
(et miR-203
) méthylation est pas-GC spécifique et peut-être une sorte d'adaptation à l'hôte dans les tissus non malignes au développement de GCS.
MiR
méthylation et H. pylori infection de la
pour déterminer si H. pylori
infection joue un rôle dans miR
méthylation, nous avons cherché H. pylori
spécifique de 23 S ADNr
gastriques dans des échantillons d'ADN génomique par PCR et a constaté que le taux -positif de H. pylori a augmenté en même temps que la gravité des changements pathologiques [15,4% (2 sur 13) des biopsies gastriques normales, 52,6% (20 sur 38) lésions de gastrite, et 69,0% (29 sur 42) des biopsies de SM; trend
-test, P = 0,001
] et a diminué dans les échantillons de GC (18 de 42 = 42,9%; GCS contre SMs, test de chi carré de Pearson, P = 0,016
; fichier supplémentaire 1: Figure S11 ). H. pylori
-positifs échantillons gastrite /normaux et SM ont montré méthylation significativement plus élevée de miR-210
méthylation que H. pylori
échantillons séronégatifs (P = 0,036
et 0,022, respectivement; la figure 2A et B). Figure 2: Comparaison de miR méthylation dans divers échantillons de la muqueuse gastrique avec ou sans l'existence de H. pylori. (A) de biopsies normales ou gastrite de patients ambulatoires témoins sans maladie maligne; marge et des échantillons tumoraux chirurgicaux chez des patients atteints d'un carcinome gastrique, respectivement (B et C); H. pylori spécifique 23 S ADNr
a été détecté par PCR.
Relation Inversed entre miR de la méthylation des îlots CpG et leurs niveaux d'expression correspondants
Pour étudier la relation entre l'aberrante miR
ci-dessus méthylation et la transcription du gène miR
correspondant, nous avons quantifié les niveaux miRNA matures de miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, miR-210
,
miR-200b, (et miR-375
), dont la méthylation état est lié au développement de la GC (et l'adaptation GC hôte) comme décrit ci-dessus, dans un ensemble de lignées de cellules humaines avec différents statuts de méthylation de miR
îlots CpG. Le statut de méthylation de chaque miR
îlot CpG dans ces lignées cellulaires a été déterminée par CLHPD comme illustré dans le fichier additionnel 1: Figure S2-S10. Les résultats des analyses RT-PCR quantitative a montré que dans les lignées cellulaires testées contenant méthylé miR
allèles les niveaux miRNA matures de tous les 6 miR
gènes liés au GC et un hôte adaptation du gène miR de sont significativement inférieurs à ceux détectée dans les lignées cellulaires contenant des allèles non méthylés (figure 3A miR-G). Figure 3 La relation entre le niveau d'expression et l'état de méthylation des gènes miR dans des lignées cellulaires humaines et des échantillons de tissus gastriques. (A-G) L'analyse de la corrélation entre la proportion de méthylation des îlots CpG miARN et leurs niveaux d'expression de miARN matures dans la cible îlots CpG méthylés et des lignées cellulaires humaines non méthylés; (H-P) Expression des miARN dans 20 paires de nouveaux échantillons de carcinome gastrique; (U) Target CpG island lignées cellulaires non méthylés; île méthylé lignes (M) CpG cible de cellules; île (U /M) CpG cible partiellement des lignées cellulaires méthylés.
Nous avons également analysé les niveaux miRNA de 20 paires de GC fraîches et des échantillons SM et a trouvé un niveau d'expression significativement plus élevé de miARN-200b,
miRNA-375, et miARN-210 en SMs que dans GCS (t apparié
-test: Ps
≤0.030; fichier supplémentaire 1: Figure S12). Les miARN-137 niveaux en SMs étaient également plus élevés que ceux des glucocorticoïdes, mais n'a pas été statistiquement significative (P = 0,059
). Les niveaux de miARN-9 et miARN-34b expression étaient similaires entre les SMs et GCS. Plus important encore, une relation inverse entre miR de la méthylation et le niveau d'expression correspondant a été observé pour miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
et miR-200b
dans ces échantillons de tissus gastriques (Rank d'analyse de corrélation de Spearman, miR-9-1
, r
s
= -0,533, P = 0,001
; miR-9-3
, r
s
= -0,464, P = 0,004
; miR-137
, r
s
= -0,378, P =
0,019; miR-200b
, r
s
= -0,409, P = 0,010
; Figure 3H-K). Une relation de méthylation de faible expression inverse a également été trouvé pour miR-375
dans ces échantillons de tissus (r
s
= 0,287, P = 0,085
; Figure 3O). Une telle relation n'a pas été observée pour miR-34b
et miR-210
(Figure 3L, N).
miR de la méthylation corrélée aux caractéristiques clinicopathologiques des patients
Pour étudier la possibilité de GC utilisant miR
méthylation comme facteur prédictif de pronostic de glucocorticoïdes, nous avons déterminé la prévalence de la méthylation de 7 miR
gènes et analysé la relation entre les caractéristiques clinico de GC et les niveaux de méthylation correspondants de ces miR
îlots CpG étudiées ci-dessus pour tous les patients 112 GC (tableau 2 et fichiers supplémentaires 1: Tableau S6). features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive pylori
infection.

• La présence de cellules inflammatoires S100A9-positives dans les tissus cancéreux est en corrélation avec un cancer à un stade précoce et un meilleur pronostic chez les patients souffrant présen…
• transmission de Helicobacter pylori chez l'homme a-t provoquer une épidémie dans une colonie de Stripe face dunnarts (Sminthopsis macroura)?