Karakterisering van menselijke maag-carcinoom verband methylatie van CpG eilanden 9 miR en onderdrukking van hun uitingen in vitro en in vivo

Karakterisering van menselijke maag-carcinoom in verband methylatie van 9 miR
CpG eilanden en onderdrukking van hun uitingen in vitro en in vivo

Abstract achtergrond
Veel miR
genen gelegen binnen of rond CpG eilanden. Het is onduidelijk of methylatie van deze CpG eilanden onderdrukt miR
transcriptie regelmatig. De doelstellingen van dit onderzoek zijn op maagcarcinoom (GC) te karakteriseren -gerelateerde methylatie van miR
CpG eilanden en de relatie met miRNA meningsuiting.
Methods
methylatie status van 9 vertegenwoordiger miR
CpG eilanden in een paneel van cellijnen en humane gastrische monsters (waaronder 13 normale biopten, 38 biopsies gastritis, 112 paren GC en de chirurgische monsters marge) werd geanalyseerd met bisulfiet-DHPLC en sequencing. Rijpe miRNA werden bepaald met kwantitatieve RT-PCR. Relaties tussen miR
methylatie, transcriptie, GC ontwikkeling en klinisch-pathologische kenmerken zijn statistisch geanalyseerd.
Resultaten
Methylering frequentie van 5 miR
CpG eilanden (miR-9-1
, miR-9 -3
, miR-137
, miR-34b
en miR-210
) geleidelijk toegenomen, terwijl het aandeel van gemethyleerde miR-200b geleidelijk
daalde in de maag carcinogenese (Ps
< 0,01). Meer miR-9-1
methylering werd gedetecteerd in 62% -64% van de GC monsters en 4% van de normale of gastritis monsters (18/28 versus 2/48; Odds ratio 41,4; P
<0,01). miR-210
methylering toonde hoge correlatie met H. pylori
infectie. miR-375
, miR-203
en miR-193b
methylatie zou gastheer aanpassing aan de ontwikkeling van GC zijn. Methylering van deze miR
CpG eilanden consequent aangetoond dat de overeenkomstige miRNA niveaus die in menselijke cellijnen significante daling. De omgekeerde relatie werd ook waargenomen voor miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
en miR-200b
in de maag monsters. Onder de 112 GC patiënten, miR-9-1
methylering was een onafhankelijke gunstige voorspeller van de totale overleving van GC de patiënten in beide univariate en multivariate analyse (P Restaurant < 0,02).
Conclusies
Tot slot , wijziging van de methylatie status van 6 van 9 getest miR
CpG eilanden werd gekenmerkt in de maag carcinogenese. miR-210
methylering gecorreleerd met H. pylori
infectie. miR-9-1
methylatie kan een GC-specifieke gebeurtenis zijn. Methylering van miR
CpG eilanden aanzienlijk regelmatig neerwaarts reguleren hun transcriptie. Achtergrond
miRNA zijn een overvloedige klasse van kleine niet-coderende RNA's die voornamelijk reguleren genexpressie bij de post-transcriptie regelen. Ze spelen cruciale rol in de vernieuwing en differentiatie van stamcellen en het handhaven van cellijnen. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat bij kanker een aantal van de miR
genen zoals miR-200b /200A /429
, miR-21
, miR-30b
, miR-30d
, miR -31
en miR-423 Wat zijn opgereguleerd, terwijl andere miR
genen zoals miR-143 Kopen en miR-145 Wat zijn neerwaarts gereguleerd [1-3]. Er zijn aanwijzingen dat veranderingen in miRNA expressie komen vaak in veel kankers en deze varianten ofwel bijdragen aan kanker gast de ontwikkeling en progressie van kanker.
Er zijn een aantal routes die van invloed rijpe miRNA niveaus in cellen en weefsels, zoals genamplificatie of deletie, transcriptie regulatie of neerwaartse regulatie, post-transcriptie processing, en miRNA degradatie [4-7]. Het is bekend dat sommige intragene miR
genen, zoals miR-218-2
, worden gecoördineerd getranscribeerd met hun gastheer genen door middel van co-regulering mechanismen [8]. Echter, veel miR
genen extragene en een bepaald percentage van intragene miR
genen zoals miR-9-1
getranscribeerd in een gastheer gen-onafhankelijke patroon [9]. Omdat de exacte promotorregio van de meeste miR
genen niet worden gekenmerkt, in het bijzonder met betrekking tot de extragene miR
genen, de exacte regulerende mechanismen van miR
transcriptie zijn verre van duidelijk.
Methylering of hypermethylatie van CpG eilanden in de regio van transcriptie start sites (TSS) wordt algemeen als gentranscriptie epigenetisch onderdrukken. Unlike eiwitcoderende genen die meerdere CpG eilanden kunnen overspannen, de miR
genen kunnen korter zijn dan een CpG eiland, en in sommige gevallen, verschillende miR
genen (dwz een miR
gencluster) kan gelegen binnen of flankeren één CpG eiland (Extra file 1: Tabel S1). Afwijkende methylering van CpG eilanden geassocieerd met miR
genen, zoals let-7a-3 Kopen en miR-34a
wordt vaak waargenomen in vele soorten kanker [10, 11]. Er is gesuggereerd dat methylatie van de CpG eilanden die worden geassocieerd met miR
genen (dwz miR-203
, miR-152
, miR-124-1
, miR-34b /c
, miR-129-2
, miR-9-1
, miR-130b
, miR-124-2
en miR-181 quater
) misschien omgekeerd correleren met hun expressie [12-17]. Echter, al dan niet transcriptie van miR
genen regelmatig getroffen door de methylatie status van miR
CpG eilanden is niet systematisch onderzocht.
Het is bekend dat abnormale methylatie of demethylering van CpG eilanden in een kleine deel (< 1%) van de celpopulatie kan gevoelig worden gedetecteerd in cellen heterozygote weefselmonsters. Hieruit blijkt het voordeel van methyleringsanalyse dan veranderingen van genexpressie op het RNA en eiwitniveaus die alleen kunnen worden gedetecteerd wanneer een dergelijke verandering aanwezig is in een groot deel van een celpopulatie in een monster [18] is. Onze bioinformatica analyse blijkt 50, 9 en 70 van de 721 menselijke miR
genen in het miRbase (Release 14.0) bevinden zich respectievelijk binnen, flankerende, en in de buurt van CpG eilanden (collectief zullen we verwijzen naar deze als miR
CpG eilanden; Extra file 1: Tabel S1). Onze hypothese is dat afwijkende methylering van CpG eilanden miR
optreden tijdens de ontwikkeling en progressie van kanker. Daarom kunnen zij worden gebruikt als kandidaatgenen niet alleen voor het voorspellen van de prognose van kanker, maar ook voor het onderzoek van de methylatie-expressie in vivo vereniging
. Zo CpG eilanden 9 ziektegerelateerde miR
genen, waaronder 5 extragene miR
genen of gen-clusters (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b /200a /429
, miR-203
en miR-375
) en 4 intragene genen of gen-clusters (miR-9-1
, miR-34b /c
, miR-193b /365 -1
en miR-210
), werden geselecteerd als de vertegenwoordiger van de genen in de huidige studie (Extra file 1: Tabel S1). De methylatie-expressie vereniging voor 3 van deze miR
genen is nog niet eerder vastgestelde (Extra file 1: Tabel S2) [12, 14, 19-27]. We aanvankelijk gescreend op maagcarcinoom (GC) - of-host-gerelateerde afwijkende miR
methylatie en vervolgens onderzocht de methylatie-expressie vereniging in vitro en in vivo

. Associaties tussen klinisch-pathologische kenmerken van GC patiënten en methylatie van deze miR
CpG eilanden werden ook geanalyseerd
Methods
Cellijn bronnen en celkweek
Bron informatie gebruikte cellijnen die in deze studie:. RKO cel lijn, die door Dr. Guoren Deng aan de Universiteit van Californië in San Francisco; SW480 en HCT116 werden verstrekt door Dr. Yuanjia Chen in Peking Union Medical College Hospital; MKN74 en 293 T door Tokyo Medical en Dental University; PC-3 werd gekocht van de cellijn Bank aan de Chinese Academie van Medische Wetenschappen; HL60 en KG1A werden verkregen van de afdeling Hematologie van Peking University eerste ziekenhuis; DU145 werd verkregen van Hanmi Pharmacy Company; Siha werd verstrekt door de Universiteit van Peking People's Hospital. HepG2 werd verzorgd door Dr. Qingyun Zhang, Calu3 en A549 door Dr. Zhiqian Zhang, H1299 en AGS door Dr. Chengchao Shou, MKN45 door dr Youyong Lv, en andere cellijnen (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa en GES-1) door Dr. Yang Ke, allemaal op de Universiteit van Peking kanker ziekenhuis /instituut. Deze cellijnen werden gekweekt bij 37 ° C in 5% CO 2, met behulp van verschillende kweekmedia. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1A, A549, H1299, GES-1, HepG2, 293 T, Du145 en RKO werden gekweekt in 90% RPMI-1640 en 10% FBS. PC-3 en AGS werden gekweekt in 90% F-12 en 10% FBS. Calu3, HeLa en Siha werden gekweekt in 90% DMEM en 10% FBS. SW480 en HCT116 werden gekweekt in 90% DMEM: RPMI-1640 (1: 1). En 10% FBS
Patiënten en weefselmonsters
Chirurgische primaire GC monsters en hun gekoppelde niet-kanker resectieranden (SM) monsters werden verzameld bij 112 opgenomen patiënten (gemiddelde leeftijd 59,2 jaar [range, 32-79], 80 mannen en 32 vrouwen, 78 niet-cardiale GC en 34 cardiale GC; 40 GC in pTNM stadium I ~ II en 59 in de fase III ~ IV) aan de Universiteit van Peking kanker ziekenhuis. Follow-up gegevens van alle patiënten werd verzameld gedurende ten minste vijf jaar. Alle klinische monsters, en histopathologische en follow-informatie voor elk geval werden verkregen volgens de goedgekeurde institutionele richtlijnen. Gastrische biopten van 13 gezonde personen en 38 gastritis poliklinische vanuit hetzelfde ziekenhuis werden als niet-kankerpatiënt controles. Vóór bisulfiet modificatie elke patiënt maag genomisch DNA monster werd geanalyseerd op de aanwezigheid van H. pylori
-specifieke 23 S rDNA
door een PCR-test zoals eerder [28] beschreven. De Institutional Review Board van de Universiteit van Peking kanker ziekenhuis en het Instituut ingestemd met de studie (É1041207), en alle patiënten gaven schriftelijk informed consent.
DNA-extractie en bisulfiet modificatie
cel kanker lijn en weefselmonster genoom DNA (1,8 ug) werd geïsoleerd met behulp van fenol /chloroform-extractie [29]. De niet-gemethyleerde cytosine residuen in de DNA-monsters werden omgezet in uracil residuen (steeds thymidine residuen in PCR producten) door de toevoeging van 5 M natriumbisulfiet [30]. De Wizard DNA Clean-Up System Kit (Promega) werd gebruikt om de bisulfiet behandeld DNA voor PCR-amplificatie te zuiveren.
PCR-amplificatie en kwantificering van miR
CpG eiland methylering door DHPLC
CpG-vrij universele primer sets werden gebruikt voor het versterken van miR
CpG eilanden door hot-start PCR polymerase (Extra file 1: Figuur S1 en Extra file 1: Tabel S3). Sequenties van CpG eilanden ingebed of geflankeerd deze verbonden miR
genen werden gebruikt om primers te ontwerpen. De PCR producten werden vervolgens kwantitatief geanalyseerd door DHPLC op de WAVE® DNA fragment Analysis System [31]. Elutieprofielen van miR-9-3
, miR-200b
en miR-203
methylatie werd geanalyseerd met een UV-detector; andere miR
gen methylering werd gedetecteerd met de postkolom HSX-3500 accessoire (Transgenomic, Inc., Omaha, USA) en een uiterst gevoelige fluorescentie (FL) (excitatie bij 450 nm, emissie bij 520 nm) [32 ]. Gemethyleerd en niet-gemethyleerd miR
gen PCR-producten werden gescheiden door een DNASep® analytische kolom (Transgenomic) aan de corresponderende gedeeltelijke denaturerende temperatuur (Extra file 1: Tabel S3 en figuur S2-10). De piekoppervlakten overeenkomend met de gemethyleerde en ongemethyleerde PCR producten werden gebruikt om de hoeveelheid gemethyleerde miR berekenen
CpG eiland [het aantal kopieën gemethyleerde = methylatie-piekoppervlakte /totale piekgebied] zoals eerder beschreven [33]. M.SssI-
gemethyleerd genomisch DNA van bloedmonsters werd gebruikt als een positieve controle. Figuur 1 DHPLC chromatogrammen en bisulfiet sequencing van 7 miR CpG eilanden in representatieve cellijnen en samples maag weefsel. Zowel menselijk perifeer bloed DNA (bloed) en de M.Sss
I-gemethyleerde producten (M.BLOOD) werden als controles. Alle CpG sites in de amplicon van elk miR
CpG eiland zijn ook boven de resultaten van bisulfiet sequencing vermeld. Elke rij vertegenwoordigt een kloon; elk roze balk vertegenwoordigt een gemethyleerde CpG plaatse. De overeenkomstige sequentie chromatogram van elk monster (rechterkant) wordt getoond (linker kolom).
Bisulfiet kloon-sequencing
verse PCR producten van miR
CpG eilanden geamplificeerd met de CpG-vrije universele primersets werden gekloneerd met de pGEM-T Gemakkelijk kit (Promega, Madison, USA) en de sequentie met een Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer bij SinoGeneMox Company (Beijing, China).
Extractie van RNA en detectie van de volwassen miRNA level met kwantitatieve RT-PCR-tests
50 ng totaal RNA werd geëxtraheerd uit verse weefselmonsters of cellijnen met de TRIzol reagens (Life Technologies, Carlsbad, USA) volgens het protocol van de fabrikant. Overeenkomstige cDNA monsters werden gesynthetiseerd met behulp van de TaqMan® MicroRNA reverse transcriptie Kit (Life Technologies) met miR
-specifieke stam-lus inverse transcriptie (RT) primers (specifiek voor miR-375
# RT000564, miR-34b
# RT000427, miR-137
# RT000593 en miR-9
# RT000583). RT toegepaste waren 16 ° C gedurende 30 min ➔ 42 ° C gedurende 30 min ➔ 85 ° C gedurende 5 minuten. De miRNA niveaus werden vervolgens geanalyseerd met behulp van een TaqMan genexpressie Master Mix kit (Life Technologies) met de bijbehorende sonde en primers (Life Technologies, miR-375
# TM000564, miR-34b
# TM000427, miR-137
# TM000593 en miR-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # en # RT001093 TM001093) werd gebruikt als interne referentie. De PCR cycling condities waren 95 ° C gedurende 10 min ➔ gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 20 seconden ➔ 60 ° C gedurende 1 min. Expressie van miR-200b Kopen en miR-210
werden bepaald met een standaard polyA RT-PCR-bepaling. Sequenties van de RT-adapter primer, de universele omgekeerde primer en het U6
primer in de reguliere polyA RT-PCR-test worden getoond in Extra file 1: Tabel S5. RT-omstandigheden waren 55 ° C gedurende 5 min ➔ gevolgd door 25 ° C gedurende 10 min ➔ 42 ° C gedurende 1 uur ➔ en 70 ° C gedurende 5 minuten. De PCR-cycling omstandigheden waren 95 ° C for10min ➔ gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 20 seconden ➔ en 61 ° C gedurende 1 min.
Statistische analyse
SPSS 16.0 Trend
-test en Pearson Chi- kwadraattest werd gebruikt om de miR
methylatie frequentieverschil tussen normale biopten, gastritis letsels, GC en SM monsters te analyseren. Kruskal-Wallis H
-test en One-Way ANOVA werd gebruikt om de miR
methylatie verhouding verschillen tussen normale biopten, gastritis letsels, GC en SM monsters te analyseren. Fisher's exact test, Chi-kwadraat test Pearson, en Trend
-test werden gebruikt om de vereniging te analyseren tussen miR
methylatie positieve tarieven en de klinische en features. De Mann-Whitney U
-test en Student's t
-test werden gebruikt om de relatie tussen het aandeel van gemethyleerde miR
allelen en de klinische en functies te analyseren. Kaplan-Meier en Cox-proportionele risico's methodes werden gebruikt voor univariate en multivariate analyse om de totale overleving van patiënten met GC verschillen in methylatie status van miR
CpG eilanden te vergelijken. Alle statistische toetsen waren tweezijdig en P Restaurant < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
Analyse van methylatie of demethylering van 6 miR
CpG eilanden in verband met de ontwikkeling van GC
Wij versterkt-bisulfiet behandeld templates van 9 vertegenwoordiger miR
CpG eilanden met CpG-vrije primers en ontwikkelde 9 DHPLC assays voor de methylatie status van de CpG eilanden in PCR-producten van 4 intragene miR
genen (miR-9-1
, miR-34b
analyseren, miR-193b
, miR-210
) en 5 extragene miR
genen (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b
, miR-203 Kopen en miR-375
), respectievelijk (figuur 1, Extra file 1: Tabel S3 en Extra file 1: Figuur S1-S10). Deze DHPLC tests bleek dat de methylatie positieve tarief van 5 miR
CpG eilanden (miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, en miR-210
) was significant verhoogd gelijktijdig met de ernst van aandoeningen van maag. Deze bevindingen suggereren sterk dat methylatie van deze miR
CpG eilanden is gerelateerd aan de ontwikkeling van GC (trend
-test, miR-9-1
, P <
0,001; miR-9- 3
, P <
0,001; miR-34b
, P = 0,008
; miR-137
, P <
0,001; miR-210
, P
= 0,001; Tabel 1). miR-9-1
methylering werd gedetecteerd in 18 van 28 GC (sensitiviteit, 64%), maar in 2 van 48 normale of gastritis biopten bleek methylering (specificiteit 96%). Hoewel methylatie van miR-200b
in bijna alle weefsels maag monsters gedetecteerd, het percentage gemethyleerd miR-200b
in normale of gastritis weefsels (46% ~ 100%) was significant hoger dan zowel SM en GC monsters (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U- Electronics test, gastritis biopsieën versus SMs, p =
0,001; Tabel 1). Dit suggereert dat miR-200b
demethylering was een GC, patiënt-specifieke gebeurtenis. Bisulfietsequencing deze miR
CpG eilandjes bevestigde de resultaten van DHPLC analysegegevens (figuur 1) .table 1 methylatiestatus van CpG eilanden in miR maagslijmvlies monsters met verschillende pathologische veranderingen in GC en niet-carcinomateuze controlepatiënten
miR
CpG eilanden
Groep van maag monsters
miR
methylering
Positieve tarief
Aandeel (%) van gemethyleerd miR
in de miR
methylatie-positieve monsters
positieve tarief (%)
χ 2
-waarde
Trend
-test (P
-waarde)
Median
[25% ~ 75%]
Mean
± SD
t /F /χ 2
-waarde
P
-waarde
miR-9-1
Normal
1/13 (7,7)
27,598 Restaurant < 0,001 een
NA NA

Gastritis
1/35 (2.9)
NA
SM
28/09 (32.1)
17 [13-30]
20 ± 4
t
= -3,039
0,005 g
GC
18/28 (64,3)
29 [19-40]
32 ± 4
miR-9-3
Normal
13/06 (46,2)
23,389 Restaurant < 0,001 een
38 [31-59]
43 ± 6
F
= 1,639
0,189 h
Gastritis
15/37 (40,5)
43 [36-48]
42 ± 2
SM
26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2
GC
26/28 (92,9)
37 [26-43]
36 ± 2
miR-137
Normal
13/05 (38,5)
18,626 Restaurant < 0,001 een
10 [4-41]
χ 2
= 8,065
0.045 d
Gastritis
24/38 (63,2)
19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3g
GC
24/26 (92,3)
36 [20-51]
37 ± 4
miR-34b

Normal
13/06 (46,2)
6,947
0.008 een
13 [7-19]
χ 2
= 0,658
0,883 d
Gastritis
13/36 (36,1)
11 [3-20]
SM
22/28 (78,6)
11 [4-18]
GC
19/28 (67,9)
10 [5-32]
miR-200b
Normal
13/13 (100)
0,486
0,922 f
54 [52-83]
χ 2
= 17,883 Restaurant < 0,001 d
Gastritis
35/36 (97,2)
52 [46-100] e
SM
27/28 (96,4)
44 [40-47]
GC
27/28 (96,4)
48 [40-53]
miR-210

Normal
13/02 (15,4)
11,908
0,001 een
NA NA

Gastritis
13/38 (34,2)
7 [ ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81,5)
11 [5-22]
GC
16/27 (59,3)
9 [4-16]
miR-193b
Normaal
0/13
7,045
0.008 b
NA NA

Gastritis
2/37 (5.4)
NA
SM
28/07 (25,0)
5 [4-14]
GC
28/04 (14,3)
5 [2-12]
buitenspiegels 203
Normal
13/05 (38,5)
5,617
0,018 b
32 [29-75]
χ 2
= 2,957
0,398 d
Gastritis
20/38 (52,6)
31 [26-36]
SM
21/28 (75,0)
34 [30-36]
GC
11/28 (39,3) c
32 [29-35]
miR-375
Normaal
0/13
12,266 Restaurant < 0,001 b
NA NA

Gastritis
13/38 (34,2)
3 [3-4] e
SM
16/28 (57,1)
7 [4 -14]
GC
28/08 (28,6) c
17 [8-21]
, Trend
test, onder normale, Gastritis, SM en GC monsters; b, Trend
-test onder normaal, gastritis en SM monsters; c, Chi-kwadraat test Pearson's, GC versus SM: miR-203
, χ 2
= 7,292, p = 0,007
; miR-375
, χ 2
= 4,667, p = 0,031
; d, Kruskal-Wallis H
-test; e, Mann-Whitney U-test
: Gastritis versus SM, miR-200b
, U
= 230.000, p = 0,001
; Gastritis versus GC, miR-375
, U
= 46.000, p = 0,011
; SM versus GC, miR-137
, U
= 170.000; p
= 0,009; f, Chi-kwadraat test van Pearson, onder normaal, gastritis, SM en GC monsters; g. Gepaarde t
-test: SM versus GC, miR-137
, t
= -2,652, P = 0,014
; h. One-way ANOVA; NA, niet beschikbaar.
Met uitzondering van miR-9-1 Kopen en miR-137
, de methylering positieve percentages of verhoudingen van gemethyleerde miR-9-3
, miR-34b
, miR-210
en miR-200b
in GC waren vergelijkbaar met die in SMS (tabel 1). Valideren of methylatie van sommige miR
genen is een veldeffect gebeurt gelijktijdig zowel kankerachtige en niet-kankerachtige weefsels in de maag als gevolg van dezelfde blootstelling aan omgevingsfactoren, gedetecteerd we de methylering gegevens in een andere subgroep van GC en SM monsters van 84 patiënten en vond dat de positieve snelheid en aandeel van gemethyleerde miR-9-1
in GC was nog steeds aanzienlijk hoger dan die in SMS (60,7% versus 32,1%; Chi-kwadraat test Pearson's, P =
0,001; Log rank test, P Restaurant < 0,001; Extra file 1: Tabel S4, subset-2). Het gemiddelde aandeel van de gemethyleerde miR-137
was ook significant hoger in GC dan SMS (Mean
± SD
, 26 ± 2 versus 38 ± 2, Gekoppelde t-
test, P <
0.001). Zoals verwacht een significant verschil in de positieve snelheid of het aandeel van gemethyleerde miR-9-3, werd miR-34b
, miR-210
en miR-200b
niet waargenomen tussen GC en SM samples. Deze resultaten bevestigden dat miR-9-1 Kopen en miR-137
methylatie was een tumor-specifieke gebeurtenis en dat miR-9-3
, miR-34b
en miR-210
methylatie, evenals miR-200b
demethylering, was een field-effect die tijdens de maag carcinogenese.
Bovendien
de positieve snelheid van gemethyleerde miR-203 Kopen en miR-375 geleidelijk verhoogd van normaal tot gastritis aan SM steekproeven, maar aanzienlijk gedaald in GC, vergeleken met SMS (Pearson Chi-square test, miR-203
, P =
0.007; miR-375
, P = 0,031
; Tafel 1). In de subgroep-2 monsters analyseerden we ook miR-375
methylering en vond meer miR-375
methylatie SMS dan in GC weer (Pearson Chi-square test, P = 0,034
; Extra file 1 : Tabel S4). Deze data impliceren dat miR-375
(en miR-203
) methylering niet GC-specifiek en kan een soort host aanpassing in de niet-kwaadaardige weefsels naar de ontwikkeling van GC zijn.
MiR
methylatie en infectie H. pylori
Om te bepalen of H. pylori
infectie een rol in miR
methylering speelt, hebben we gezocht naar H. pylori
-specifieke 23 S rDNA
gastrische genomische DNA-monsters door PCR en vond dat de H. pylori-positieve percentage
gelijktijdig toe met de ernst van de pathologische veranderingen [15,4% (2 van de 13) van de normale gastrische biopten, 52,6% (20 van 38) van gastritis laesies en 69,0% (29 van 42) SM biopten; trend
-test, P = 0,001
] en daalde in GC monsters (18 van 42 = 42,9%; GC versus SMS, Pearson Chi-square test, P
= 0,016; Extra file 1: Figuur S11 ). H. pylori
-positieve gastritis /normaal en SM monsters vertoonden significant hogere methylatie van miR-210
methylatie dan H. pylori
-negatieve monsters (P
= 0,036 en 0,022, respectievelijk figuur 2A en B). Figuur 2 Vergelijking van miR methylatie in verschillende maagslijmvlies monsters met en zonder aanwezigheid van H. pylori. (A) Normaal of gastritis biopten van controle poliklinische patiënten zonder kwaadaardige ziekte; (B en C) chirurgische marge en tumormonsters van patiënten met maagcarcinoom, respectievelijk; H. pylori-specifieke 23 S rDNA
werd gedetecteerd door PCR.
Inversed relatie tussen miR
methylatie van CpG eilanden en de bijbehorende expressie niveaus Belgique Om de relatie tussen de bovengenoemde afwijkende miR
onderzoeken methylering en de transcriptie van de overeenkomstige miR
gen, we gekwantificeerd de volwassen miRNA niveaus van miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, miR-210
, miR-200b
, (en miR-375
), waarvan de methylatie status met betrekking tot de ontwikkeling van GC (GC en gastheer adaptatie), zoals hierboven beschreven, in een set van humane cellijnen met verschillende methylatie status van miR
CpG eilanden. De methylatie status van elke miR
CpG eiland in deze cellijnen werd bepaald door DHPLC zoals geïllustreerd in Extra file 1: Figuur S2-S10. De resultaten van kwantitatieve RT-PCR-tests toonden aan dat in de geteste cellijnen die gemethyleerd miR
allelen de volwassen miRNA niveaus van alle 6-GC-gerelateerde miR
genen en een host aanpassing miR
gen waren aanzienlijk lager dan die gedetecteerd in de cellijnen die ongemethyleerde miR
allelen (Figuur 3A-G). Figuur 3 het verband tussen expressieniveau en methylatie status van miR genen in humane cellijnen en monsters maagweefsel. (A-G) De correlatie tussen methylatie analyse aandeel van miRNA CpG eilanden en hun volwassen miRNA expressie niveaus in het doel CpG eiland gemethyleerd en niet-gemethyleerd humane cellijnen; (H-P) expressie van miRNAs in 20 gepaarde, verse maagcarcinoom monsters; (U) Target CpG eiland gemethyleerd cellijnen; (M) Target CpG eiland gemethyleerde cellijnen; (U /M) Target CpG eiland gedeeltelijk gemethyleerde cellijnen.
Wij verder geanalyseerd het miRNA niveaus van 20 paren van verse GC en SM samples en vonden een significant hogere expressie niveau van miRNA-200b,
miRNA-375, en miRNA-210 SMS dan in GC (Gepaarde t
-test: Ps
≤0.030; Extra file 1: Figuur S12). Het miRNA-137 niveaus in SMs waren ook hoger dan die van GCs, maar was niet statistisch significant (p = 0,059
). De expressie van miRNA-9 en miRNA-34b waren vergelijkbaar tussen SMS en GC. Belangrijker nog, een omgekeerde relatie tussen miR
methylatie en de bijbehorende expressie werd waargenomen voor miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
en miR-200b
in deze maag weefselmonsters (Rank Correlatie analyse Spearman, miR-9-1
, r
s
= -0,533, P = 0,001
; miR-9-3
, r
s
= -0,464, P = 0,004
; miR-137
, r
s
= -0,378, P =
0,019; miR-200b
, r
s
= -0,409, P = 0,010
Figuur 3H-K). Een zwakke inverse methylatie-expressie relatie werd ook gevonden voor miR-375
in deze weefselmonsters (r
s
= 0,287, p = 0,085
Figuur 3O). Een dergelijke relatie werd niet waargenomen voor miR-34b Kopen en miR-210
(figuur 3L, N).
MiR
methylering gecorreleerd met klinisch-pathologische kenmerken van GC patiënten Belgique Om de mogelijkheid te bestuderen gebruik miR
methylering als prognose voorspeller van GC, hebben we de prevalentie van methylering van 7 miR
genen en de relatie tussen de klinische en pathologische kenmerken van GC en de overeenkomstige methylering van deze miR geanalyseerd
CpG eilanden bestudeerde hierboven voor alle 112 GC-patiënten (tabel 2 en Extra file 1: Table S6). features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive pylori
infectie. Figuur S2. Figuur S3. Tabel S1. Tabel S2. Tabel S3. Tabel S4. Tabel S5. Tabel S6. Tabel S7.

• Aanwezigheid van S100A9-positieve ontstekingscellen in kankerweefsel correleert met een vroeg stadium van kanker en een betere prognose bij patiënten met maagkanker
• Heeft overdracht van Helicobacter pylori van mensen veroorzaken een ziekte-uitbraak in een kolonie van Streep-faced Dunnarts (Sminthopsis macroura)?