Характеристика человека карциномы желудка, связанных с метилирования 9 микроРНК CpG островов и подавления их выражения в пробирке и в vivo

Характеристика человека карциномы желудка, связанных с метилирования 9 MIR
CpG островов и подавление их выражения в пробирке и
в естественных условиях

Аннотация
фоне
Многие MIR
гены расположены внутри или вокруг CpG островов. Пока неясно, является ли метилирование репрессирует этих островов CpG MIR
транскрипции на регулярной основе. Целью данного исследования являются характеризовать карциномы желудка (GC) метилирование о связанных MIR
CpG острова и его отношения с микроРНК выражения.
Методов
статуса метилирования 9 представительства MIR
CpG островов в панель из клеточных линий и образцов желудочного человека (в том числе 13 нормальных биопсий, 38 гастрит биопсий, 112 пар ГКС и их хирургических образцов гарантийных депозитов) анализировали с помощью бисульфита-DHPLC и секвенирования. Уровни Зрелые микроРНК определяли с количественной ОТ-ПЦР. Отношения между MIR
метилирование, транскрипцию, развитие GC и клинико-патологические характеристики были статистически проанализированы.

Результаты метилирования частота 5 MIR
CpG острова (MIR-9-1
, микроРНК-9 -3
, микроРНК-137
, микроРНК-34b
и микроРНК-210
) постепенно увеличивается, а доля метилированной MIR-200b
постепенно уменьшается во время желудочного канцерогенеза (Ps <бр> &л; 0,01). Подробнее микроРНК-9-1
метилирование была обнаружена у 62% -64% образцов ГХ и 4% от нормального или гастрит образцов (18/28 против 2/48; отношение шансов 41,4; P &
л; 0,01). микроРНК-210
метилирования показали высокую корреляцию с H. Pylori
инфекции. микроРНК-375
, микроРНК-203
и микроРНК-193b
метилирования может быть адаптация хозяина к развитию ШС. Метилирование этих MIR
CpG островов последовательно показали значительно снизить соответствующие уровни микроРНК, представленные в клеточных линиях человека. Обратная зависимость наблюдается и для микроРНК-9-1
, микроРНК-9-3
, микроРНК-137
и микроРНК-200b
в желудочном образцах. Среди 112 пациентов GC, микроРНК-9-1
метилирование был независимым благоприятным прогностическим фактором общей выживаемости больных ГХ в обоих одномерный и многомерный анализ (P &
Lt; 0,02).
Выводы
В заключение , изменение статуса метилирования 6 из 9 испытания микроРНК
CpG острова характеризовалась в желудочном канцерогенезе. микроРНК-210
метилирование коррелирует с H. Pylori
инфекции. микроРНК-9-1
метилирования может быть GC-конкретное событие. Метилирование MIR
CpG острова могут значительно понижающей регуляции их транскрипции на регулярной основе.
Фона
микроРНК являются обильные класс малых некодирующих РНК, которые в основном регулируют экспрессию генов на пост-транскрипционном уровне. Они играют важную роль в обновлении и дифференциации стволовых клеток и помогают поддерживать клеточных клонов. Предыдущие исследования показали, что при раке несколько из MIR
генов, таких как микроРНК-200b /200а /429
, MIR-21
, микроРНК-30b
, микроРНК-30d
, MIR
-31, и микроРНК-423
позитивно регулируются, в то время как другие MIR
гены, такие как микроРНК-143
и микроРНК-145
являются подавляются [1-3]. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что изменения в экспрессии микроРНК часто встречаются во многих видов рака и эти изменения либо способствуют канцерогенеза или отражать развитие и прогрессирование рака.
Есть несколько путей, которые могут повлиять на зрелых уровни микроРНК в клетках и тканях, таких как амплификации гена или делеция, транскрипционный или деактивация повышающей регуляцией, пост-транскрипционный обработки и деградации микроРНК [4-7]. Хорошо известно, что некоторые внутригенная микроРНК
гены, такие как микроРНК-218-2
, скоординировано расшифрованы с их генами-хозяевах через совместное регулирование механизмов [8]. Тем не менее, многие MIR
гены extragenic и определенная доля внутригенной MIR
гены, такие как MIR-9-1
транскрибируются в принимающем гена независимый узор [9]. Поскольку точная область промотора большинства MIR
генов не отличаются, особенно в отношении extragenic MIR
генов, точные механизмы регуляции транскрипции MIR
далеки от ясности.
Метилирования или гиперметилированием CpG острова в области транскрипции исходного сайтов (УТП), как правило, признается репрессировать транскрипцию гена эпигенетически. В отличие от белок-кодирующих генов, которые могут охватывать несколько островков CpG, Мирский
гены могут быть короче, чем острова CpG, а в некоторых случаях, несколько микроРНК генов
(т.е. MIR
кластер генов) может быть расположены внутри или фланговые одного острова CpG (Дополнительный файл 1: Таблица S1). Ненормальная метилирование CpG островков, связанных с MIR
гены, такие как пусть-7а-3
и микроРНК-34а
, часто наблюдается во многих раковых заболеваний [10, 11]. Было высказано предположение, что метилирование островков CpG, которые связаны с MIR
генов (т.е. микроРНК-203
, микроРНК-152
, микроРНК-124-1
, микроРНК-34b /с
, микроРНК-129-2
, микроРНК-9-1
, микроРНК-130b
, микроРНК-124-2
и микроРНК-181C
) может обратно коррелировать с их уровни экспрессии [12-17]. Тем не менее, независимо от того или нет транскрипции генов MIR
регулярно зависит от статуса метилирования CpG MIR
островов не системно изученные.
Хорошо известно, что ненормального метилирования или деметилирования CpG островов в небольшой доля (≪ 1%) популяции клеток может быть чувствительно обнаружен в клеточных образцах гетерозиготных ткани. Это демонстрирует преимущество анализа метилирования над изменениями экспрессии генов на РНК и белка уровнях, которые могут быть обнаружены только тогда, когда такая изменения присутствует в значительной части популяции клеток в образце [18]. Наш биоинформатики анализ показывает 50, 9, и 70 из 721 Mir
генов человека в miRbase (Release 14.0) расположены, соответственно, в пределах, фланговые, и около CpG островов (в совокупности мы будем называть их микроРНК
CpG острова; Дополнительный файл 1: Таблица S1). Мы предполагаем, что аберрантных метилирования MIR
CpG островков может произойти во время развития и прогрессирования рака. Поэтому они могут быть использованы в качестве генов-кандидатов не только для предсказания прогноза рака, но и для исследования метилирования экспрессии ассоциации в естественных условиях
. Таким образом, CpG острова 9 болезней, связанных с MIR
генов, в том числе 5 extragenic MIR
генов или генных кластеров (MIR-9-3
, микроРНК-137
, микроРНК-200b /200а /429
, микроРНК-203
и микроРНК-375
) и 4 внутригенных генов или генных кластеров (MIR-9-1
, микроРНК-34B /C
, микроРНК-193b /365 -1
и микроРНК-210
), были выбраны в качестве репрезентативных генов в данном исследовании (дополнительный файл 1: Таблица S1). Метилирование выражение ассоциация 3 из этих MIR
генов не было ранее установлено (дополнительный файл 1: Таблица S2) [12, 14, 19-27]. Мы изначально экранированы для карциномы желудка (GC) - или хост связанных с аберрантной микроРНК
метилирование, а затем исследовали метилирование-экспрессии ассоциации в пробирке
и в естественных условиях
. Ассоциации между клинико-патологическими особенностями пациентов GC и метилирования этих MIR
были также проанализированы CpG острова
методы
источники клеточной линии и в клеточной культуре
Источник информации используемых клеточных линий, используемых в данном исследовании:. РКО клеток линии, предоставленные доктором Guoren Денга в университете Калифорнии в Сан-Франциско; SW480 и НСТ116 были предоставлены доктором Юаньцзя Чэнь в пекинской больнице Союза медицинского колледжа; MKN74 и 293 Т обеспечивается Токийского медицинского и стоматологического университета; PC-3 был приобретен из клеточной линии банка при Китайской академии медицинских наук; HL60 и KG1A были получены из отделения гематологии Пекинского Первой университетской больницы; Du145 была получена из Hanmi фармацевтической компании; SIHA был предоставлен Пекинский университет Народной больницы. HepG2 была предоставлена доктором Qingyun Чжан, Calu3 и А549 доктором Zhiqian Чжан, H1299 и AGS доктором Chengchao Shou, MKN45 доктором Youyong Lv, и другие клеточные линии (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa и ГЭС-1) д-р Ян Кэ, все в Пекинском университете рака больницы /института. Эти клеточные линии культивировали при 37 ° С в атмосфере 5% СО <суб> 2, с использованием различных культуральных сред. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1A, А549, H1299, ГЭС-1, HepG2, 293 Т, Du145 и РКО культивировали в 90% RPMI-1640 и 10% FBS. РС-3 и АГС культивировали в 90% F-12 и 10% FBS. Calu3, Hela и SIHA культивировали в 90% DMEM и 10% FBS. SW480 и НСТ116 культивировали в 90% DMEM: RPMI-1640 (1: 1). И 10% ЭТС
Пациенты и образцы ткани
Хирургические образцы первичной ГХ и их спаренные нераковых хирургического края (SM) образцы были собрана из 112 госпитализированных (средний возраст 59,2 лет [диапазон, 32-79]; 80 мужчины и 32 женщины; 78 несердечная ГКС и 34 сердечных ШС; 40 ШС на pTNM стадии I ~ II и 59 на стадии III ~ IV) в Пекинском онкологической больницы университета. Последующие данные для всех пациентов собирали в течение по крайней мере пяти лет. Все клинические образцы, а также гистопатологические и Followup информация для каждого случая были получены в соответствии с утвержденными ведомственным руководящим принципам. Желудочные биопсии из 13 здоровых лиц и 38 амбулаторных больных гастритом, собранных из той же больницы были использованы в качестве контрольных пациентов без рака. Перед тем как бисульфит модификации желудка геномную ДНК-образец каждого пациента анализировали на наличие антихеликобактерной
-специфические 23 S рДНК Ру по ПЦР-анализе, как описано ранее [28]. Институциональные обзорные советы Пекинского университетской больницы и онкологического института одобрил исследование (É1041207), и все пациенты дали письменное информированное согласие.
Экстракции ДНК и бисульфит модификации
линии клеток рака и образец ткани геномную ДНК (1,8 мкг) выделяли с помощью экстракции фенолом /хлороформом [29]. Неметилированной остатков цитозина в образцах ДНК были преобразованы в урацил остатков (становящийся тимидина аминокислотных остатков в продуктах ПЦР) путем добавления 5 М бисульфита натрия [30]. Kit Wizard® ДНК Clean-Up System (Promega) использовали для очистки ДНК бисульфит обработанных перед ПЦР-амплификации.
ПЦР-амплификации и количественного анализа MIR
CpG острова метилирование по DHPLC
CpG-свободный универсальный праймер наборы были использованы для амплификации микроРНК
CpG островков от горячего старта ПЦР-полимеразы (дополнительный файл 1: Рисунок S1 и дополнительный файл 1: Таблица S3). Последовательности CpG островков внедренных или связанных с этими фланкированных MIR
гены были использованы для разработки праймеров. Продукты ПЦР анализировали количественно DHPLC на фрагмент ДНК анализа системы Wave® [31]. Элюированные профили микроРНК-9-3
, микроРНК-200B
и микроРНК-203
метилирования анализируют с помощью ультрафиолетового детектора; другой Mir
метилирования гена был обнаружен с послеколоночной HSX-3500 Аксессуар (Transgenomic, Inc., Омаха, США) и флуоресценции высокой чувствительности (FL) детектора (возбуждение при 450 нм, излучение при 520 нм) [32 ]. Метилированный и неметилированная Mir
ген ПЦР-продукты были разделены аналитической колонке DNASep® (Transgenomic) при соответствующей температуре частичной денатурации (Дополнительный файл 1: Таблица S3 и рисунок S2-10). Площади пиков, соответствующих метилированных и неметилированных продуктов ПЦР использовали для расчета доли метилированного MIR
CpG острова [доля метилированных копий = метилирования площадь пика /общая площадь пика], как описано ранее [33]. M.SssI-
метилированный геномную ДНК из образцов крови, использовали в качестве положительного контроля. Рисунок 1 DHPLC хроматограммы и бисульфит секвенирование 7 микроРНК CpG островков в репрезентативных клеточных линий и образцов тканей желудка. Оба ДНК человеческой периферической крови (кроветворение) и его M.Sss
I-метилированных продуктов (M.BLOOD) были использованы в качестве контрольной группы. Все сайты CpG в ампликону каждого MIR
CpG острова также перечислены выше результатов бисульфита секвенирования. Каждая строка представляет собой один клон; каждый розовый бар представляет собой метилированный сайт CpG. Соответствующая хроматограммы каждого образца секвенировали (правая колонка) показана (левая колонка).
Бисульфита клон-секвенирование
продукты Свежие ПЦР MIR
CpG островков усиленных с универсальными наборами праймеров CpG-свободных были клонированы с pGEM-T Easy Kit (Promega, Мэдисон, США) и секвенировали с Applied Biosystems 3730xl ДНК Analyzer в SinoGeneMox компании (Пекин, Китай).
извлечение РНК и выявления уровня зрелых микроРНК с количественного анализа RT-PCR
Общую РНК 50 нг экстрагировали из образцов свежей ткани или клеточных линий с использованием реагента TRIzol (Life Technologies, Карлсбад, США) в соответствии с протоколом производителя. Соответствующие образцы кДНК синтезировали с использованием TaqMan® микроРНК обратной транскрипции Kit (Life Technologies) с MIR
Определённые стволовых петля обратной транскрипции (RT) праймеров (специфический для микроРНК-375
# RT000564, микроРНК-34b <бр> # RT000427, микроРНК-137
# RT000593, и микроРНК-9
# RT000583). Условия RT были использованы 16 ° С в течение 30 мин ➔ 42 ° С в течение 30 мин ➔ 85 ° С в течение 5 мин. Уровни микроРНК затем анализировали с использованием TaqMan Gene Expression Master Mix комплект (Life Technologies) с соответствующим зондом и праймерами (Life Technologies, микроРНК-375
# TM000564, микроРНК-34b
# TM000427, микроРНК-137
# TM000593, и микроРНК-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # RT001093 и # TM001093) использовали в качестве внутреннего стандарта. Условия ПЦР были езда на велосипеде 95 ° C в течение 10 минут ➔ затем 40 циклов при 95 ° С в течение 20 сек ➔ 60 ° С в течение 1 мин. Уровни экспрессии микроРНК-200B
и микроРНК-210
определяли с использованием стандартного полиА RT-PCR анализа. Последовательности адаптера праймера RT, универсального обратного праймера и U6
праймера в регулярном полиА RT-PCR анализа приведены в дополнительном файле 1: Таблица S5. Условия RT были 55 ° С в течение 5 мин с последующим ➔ 25 ° С в течение 10 мин ➔ 42 ° С в течение 1 ч, ➔ и 70 ° С в течение 5 мин. Условия ПЦР были езда на велосипеде 95 ° С for10min ➔ затем 40 циклов при 95 ° С в течение 20 сек ➔ и 61 ° С в течение 1 мин.
Статистический анализ
SPSS 16.0 Trend
-test и хи-Пирсона квадрат были использованы для анализа Мирский
разность частот метилирования между нормальными биопсий, гастрит поражений, GC и SM образцов. Крускала-Уоллиса H
-test и One-Way ANOVA были использованы для анализа Мирский
метилирование пропорция различия между нормальными биопсий, гастрит поражений, GC, и образцы СМ. точный критерий Фишера, критерий хи-квадрат Пирсона, и Trend
-test были использованы для анализа ассоциации между микроРНК
метилирования положительные темпы и особенности клинико. Манна-Уитни U
-test и Стьюдента
-test были использованы для анализа взаимосвязи между долей метилированных MIR
аллели и клинико-патологическими особенностями. Kaplan-Meier и Cox-пропорциональных рисков методы были использованы для однофакторного и многофакторного анализа для сравнения общей выживаемости пациентов с GC различия в состоянии метилирования Мирского
Результаты CpG островов. Все статистические тесты были двусторонними, а Р
&л; 0,05 считали статистически значимыми.

Результаты Характеристика метилирования или деметилирования 6 MIR
CpG островов, связанные с развитием ГКС
Мы усиливаемого бисульфита обработанные шаблоны 9 репрезентативных микроРНК
CpG островов с CpG-свободных праймеров и разработали 9 DHPLC анализы для анализа статуса метилирования CpG островов в продуктах ПЦР 4 внутригенных MIR
генов (MIR-9-1
, микроРНК-34b
, микроРНК-193b
, микроРНК-210
) и 5 extragenic MIR
гены (MIR-9-3
, микроРНК-137
, микроРНК-200b
, микроРНК-203 и
микроРНК-375
), соответственно (Рисунок 1, Дополнительный файл 1: Таблица S3 и Дополнительный файл 1: Рисунок S1-S10). Эти DHPLC анализы показали, что метилирование положительная скорость 5 MIR
CpG острова (MIR-9-1
, микроРНК-9-3
, микроРНК-34b
, микроРНК-137
, и микроРНК-210
) был значительно увеличен одновременно с тяжестью патологических изменений в желудке. Эти данные убедительно свидетельствуют, что метилирование этих микроРНК
CpG островов связано с развитием ГКС (тенденция
-test, микроРНК-9-1
, P &л;
0,001; микроРНК-9- 3
, P &л;
0,001; микроРНК-34b
, P = 0,008
; микроРНК-137
, P &л;
0,001; микроРНК-210
, P
= 0,001; таблица 1). микроРНК-9-1
метилирование был обнаружен в 18 из 28 ШС (чувствительность, 64%), но только в 2 из 48 нормальных или гастрит биопсия показала метилирование (специфичность, 96%). Хотя метилирование микроРНК-200B
был обнаружен практически во всех тканях желудка образцов, доля метилированной микроРНК-200B
в нормальных или гастрит тканей (46% ~ 100%) была значительно выше, чем в обоих СМ и GC образцы (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U- тест
, гастрит биоптаты в сравнении с SMS-, P = 0,001;
таблица 1). Это говорит о том, что микроРНК-200b
деметилирования был GC, пациент-конкретное событие. Бисульфит секвенирование этих MIR
CpG острова подтвердили данные, полученные из анализа DHPLC (Рисунок 1) .table статус 1 Метилирование микроРНК CpG островков в желудочном образцах слизистой оболочки с различными патологическими изменениями в ГК и нераковых пациентов контрольной группы
MIR
CpG острова

Группа образцов желудочного

MIR
-Methylation

положительной скорости

Доля (%) метилированных MIR <бр> в MIR
метилирования-положительных образцов

положительная ставка (%)

χ страница 2 -value

Trend
-test (P
-value)

Медиана
[25% ~ 75%]

Среднее
± SD

T /F /χ страница 2 -value

P
-value

микроРНК-9-1

Нормальный
1/13 (7.7)
27,598
&л; 0,001
NA NA

Гастрит
1/35 (2.9)
Н.
SM
9/28 (32,1) <бр> 17 [13-30]
20 ± 4
т
= -3,039
0,005 г
GC
18/28 (64,3)
29 [19-40]
32 ± 4
микроРНК-9-3

Нормальный
6/13 (46,2)
23,389
&л; 0,001
38 [31-59]
43 ± 6
F
= 1.639
0,189 ч
Гастрит
15/37 (40,5)
43 [36-48]
42 ± 2 <бр> SM
26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2
GC
26/28 (92,9)
37 [26-43] <бр> 36 ± 2
MIR-137 |
Нормальный
5/13 (38,5)
18,626
&л; 0,001 управлением
10 [4-41]
χ страница 2 = 8,065
0,045 d
Гастрит
24/38 (63,2)
19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3g
GC
24/26 (92,3)
36 [20-51]
37 ± 4
микроРНК-34b <бр>
Нормальный
6/13 (46,2)
6,947
0,008 управлением
13 [7-19]
χ страница 2 = 0,658
0,883 г
Гастрит
13/36 (36,1)
11 [3-20]
SM
22/28 (78,6)
11 [4-18]
GC
19/28 (67,9)
10 [5-32]
MIR-200b

Нормальный
13/13 (100)
0,486
0,922 ф
54 [52-83]
χ страница 2 = 17,883
&л; 0,001 г
гастрита
35/36 (97,2)
52 [46-100] е
SM
27/28 (96,4)
44 [40-47]
GC
27/28 (96,4)
48 [40-53]
MIR-210

Normal
2/13 (15,4)
11.908
0.001
NA NA

гастрита
13/38 (34,2)
7 [ ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81,5)
11 [5-22]
GC
16/27 (59,3)
9 [4-16] <бр> микроРНК-193b

Нормальный
0/13
7.045
0,008 б
NA NA

Гастрит
2/37 (5.4)
NA
SM
7/28 (25,0)
5 [4-14]
GC
4/28 (14,3)
5 [2-12]
зер- 203 |
Нормальный
5/13 (38,5)
5,617
0,018 б
32 [29-75]
χ страница 2 = 2,957 <бр> 0,398 г
Гастрит
20/38 (52,6)
31 [26-36]
SM
21/28 (75,0)
34 [30-36]
GC
11/28 (39,3) с
32 [29-35]
микроРНК-375 |
Нормальный
0/13
12.266
&ЛТ; 0,001 б
NA NA

Гастрит
13/38 (34,2)
3 [3-4] е
SM
16/28 (57,1)
7 [4 -14]
GC
8/28 (28,6) с
17 [8-21]
а, Trend
тест, среди нормальных, гастрит, СМ и образцы GC; б, Trend
-test, среди нормальных, гастрит, и образцы SM; с, хи-квадрат Пирсона, GC по сравнению с SM: микроРНК-203
, χ страница 2 = 7,292, P = 0,007
; микроРНК-375
, χ страница 2 = 4,667, P = 0,031
; d, Крускала-Уоллиса H
-test; е, Манна-Уитни U
-тесту: Гастрит по сравнению с СМ, микроРНК-200B
, U
= 230,000, P = 0,001
; Гастрит по сравнению с GC, микроРНК-375
, U
= 46,000, р = 0,011
; SM по сравнению с GC, микроРНК-137
, U
= 170,000, P
= 0,009; е, хи-квадрат Пирсона, среди нормальных, гастрит, СМ и хромато образцов; г. Соединенный т
-test: SM по сравнению с GC, MIR-137
, т
= -2.652, P = 0,014
; час Одностороннее ANOVA; NA, не доступен.
Для микроРНК-9-1
и микроРНК-137
За исключением случаев, метилирования положительные ставки или пропорции метилированной микроРНК-9-3
, микроРНК-34b
, MIR-210
и микроРНК-200b
в ШС были аналогичны в ПМП (таблица 1). Для того, чтобы проверить, если метилирование некоторых из этих генов MIR
является полем эффект происходит одновременно в обоих раковых и нераковых тканей в желудке из-за того же воздействия факторов окружающей среды, мы обнаружили данные метилирования в другой подгруппе GC и SM образцы от 84 пациентов и обнаружили, что положительная норма и доля метилированной микроРНК-9-1
в ШС по-прежнему значительно выше, чем в ПМП (60,7% против 32,1%; хи-квадрат Пирсона, P =
0,001; Войти ранговый, P
&лт; 0,001; Дополнительный файл 1: Таблица S4, Subset-2). Средняя доля метилированных микроРНК-137
также был значительно выше, чем в ШС оМ (Среднее ± SD

, 26 ± 2 по сравнению с 38 ± 2, Парный t-
тест, P <
0,001). Как и следовало ожидать существенное различие в положительной скорости или доли метилированного MIR-9-3, микроРНК-34b
, микроРНК-210
, и микроРНК-200b
не наблюдалось между ГХ и образцов СМ. Эти результаты подтвердили, что микроРНК-9-1
и микроРНК-137
метилирование было событие опухольспецифические и микроРНК-9-3
, микроРНК-34b
и микроРНК-210 <бр> метилирования, а также микроРНК-200b
деметилирования, был полевой эффект, который произошел во время желудочного канцерогенеза.
Кроме того, положительная норма метилированных микроРНК-203
и микроРНК-375
постепенно увеличивается от нормального до гастрита к образцам СМ, но значительно уменьшились в ШС по сравнению с оМ (хи-квадрат Пирсона тест, микроРНК-203
, P = 0,007
; микроРНК-375
, P = 0,031
; Таблица 1). В подгруппе-2 образцах, мы также проанализировали MIR-375
метилирования и нашел больше MIR-375
метилирование в ПМП, чем в ШС снова (хи-квадрат Пирсона тест, P = 0,034
; Дополнительный файл 1 Таблица S4). Эти данные указывают на то, что микроРНК-375
(и микроРНК-203
) метилирование не GC-специфический и может быть одним из видов адаптации хозяина в доброкачественных тканей к развитию ШС.
MIR
метилирование и H. Pylori
инфекции
Чтобы определить, является ли H. Pylori
инфекции играет определенную роль в Мирском
Результаты метилирование, мы искали хеликобактерной
Определённые 23 S рДНК <бр> в желудочном образцов геномной ДНК с помощью ПЦР и обнаружили, что H. Pylori
-положительным скорость одновременно увеличилась с выраженностью патологических изменений [15,4% (2 из 13) нормальных желудочных биопсий, 52,6% (20 из 38) из гастрит поражений, и 69,0% (29 из 42) СМ биопсий; тренд
-test, P = 0,001
] и снижение в образцах GC (18 из 42 = 42,9%; ШС по сравнению с оМ, хи-квадрат Пирсона тест, P
= 0,016; Дополнительный файл 1: Рисунок S11 ). H. Pylori
-положительные Образцы гастрит /нормальные и SM показали значительно более высокую метилирование MIR-210
метилирования, чем H. Pylori
-отрицательные образцов (P = 0,036
и 0,022, соответственно; фиг 2A и В). Рисунок 2. Сравнение микроРНК метилирования в различных образцах слизистой оболочки желудка с и без наличия H.pylori. (A) Нормальный или гастрит биопсий контрольных амбулаторных больных без злокачественных заболеваний; (В и С) хирургического края и опухолевые образцы от больных с желудочной карциномы, соответственно; H. пилори специфических 23 S рДНК
была обнаружена с помощью ПЦР.
Инвертирован отношения между MIR
метилирования CpG островков и их соответствующие уровни экспрессии
Для изучения взаимосвязи между аномальным выше микроРНК
метилирование и транскрипции соответствующего гена MIR
, мы количественно зрелые уровни микроРНК СИК-9-1
, микроРНК-9-3
, микроРНК-34b
, микроРНК-137 <бр>, микроРНК-210
, микроРНК-200b
, (и микроРНК-375
), чей статус метилирования связан с развитием GC (и адаптации ГХ-хозяина), как описано выше, в наборе клеточных линий человека с различным статусом метилирования MIR
CpG островов. Статус метилирования каждого Mir
CpG острова в этих клеточных линиях определяли DHPLC, как показано на дополнительный файл 1: Рисунок S2-S10. Результаты количественного анализа RT-PCR показали, что в исследованных клеточных линиях, содержащих метилированный MIR
аллели зрелых уровни микроРНК всех 6 GC связанных с MIR
генов и один хост адаптации MIR
гена были значительно ниже, чем те, обнаруженный в клеточных линиях, содержащих неметилированная Mir
аллели (рис 3A-G). Рисунок 3 Соотношение между уровнем экспрессии и статуса метилирования генов Mir в человеческих клеточных линий и образцов желудочного тканей. (A-G) Анализ корреляции между метилирования долей микроРНК CpG островков и их зрелые уровни экспрессии микроРНК в целевом CpG острова метилированных и неметилированные линий клеток человека; (Н-Р) Выражение микроРНК в 20 парных, свежих образцов желудочного рака; (U) Target CpG острова линии неметилированные клеток; (M) Задание CpG острова метилируется клеточные линии; (U /M) Задание CpG острова частично метилированных клеточные линии.
Мы дополнительно анализировали уровни микроРНК из 20 пар свежей ГХ и образцов СМ и обнаружили значительно более высокий уровень экспрессии микроРНК-200b,
микроРНК-375, и микроРНК-210 в ПМП, чем в ШС (парный т
-test: Ps
≤0.030; Дополнительный файл 1: Рисунок S12). Уровни микроРНК-137 в ПМП также были выше, чем в ШС, но не было статистически значимым (P = 0,059
). Уровни экспрессии микроРНК-9 и микроРНК-34b были похожи между SMS- и ШС. Самое главное, что наблюдалась обратная зависимость между MIR
метилирования и соответствующий уровень экспрессии для MIR-9-1
, MIR-9-3
, микроРНК-137
и микроРНК-200b
в этих образцах ткани желудка (анализ Спирмена ранг Корреляция, микроРНК-9-1
, г
<суб> s
= -0,533, p = 0,001
; микроРНК-9-3 <ш>, г
<суб> s
= -0,464, P = 0,004
; микроРНК-137
, г
<суб> s
= -0,378, P =
0,019; микроРНК-200b
, г
<суб> s
= -0,409, P = 0,010
; Рисунок 3Н-K). Метилирования выражение отношения слабая обратная был также найден для микроРНК-375
в этих образцах тканей (г
<суб> s
= 0,287, P = 0,085
; Рисунок 3О). Такое соотношение не наблюдалось для микроРНК-34b
и микроРНК-210
(Рисунок 3 л, N).
MIR
метилирование коррелирует с клинико-патологическими характеристиками больных GC
Изучить возможность с помощью микроРНК
метилирование в качестве предсказателя прогноза ШС, мы определили распространенность метилирования 7 MIR
генов и проанализировали взаимосвязь между клинико-патологическими особенностями GC и соответствующих уровней метилирования этих MIR
CpG острова изученным features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive пилори
инфекции. Рисунок S2. Рисунок S3. Рисунок S12. Таблица S1. Таблица S2. Таблица S3. Таблица S4. Таблица S5. Таблица S6. Таблица S7.

Характеристика человека карциномы желудка, связанных с метилирования 9 микроРНК CpG островов и подавления их выражения в пробирке и в vivo

Исследования

Исследования

Other Languages