Caracterização de metilação relacionadas com carcinoma gástrico humano de 9 ilhas miR CPG e repressão de suas expressões in vitro e in vivo

caracterização de metilação relacionadas com carcinoma gástrico humano de 9 de miR
ilhas CpG e repressão de suas expressões in vitro Comprar e in vivo
Abstract
Fundo
Muitos miR
genes estão localizados dentro ou ao redor de ilhas CpG. Não está claro se a metilação das ilhas CpG reprime miR
transcrição regularmente. Os objetivos deste estudo são caracterizar carcinoma gástrico (CG) metilação -relacionados de miR
ilhas CpG e sua relação com métodos
miRNA expressão.
Estado de metilação de 9 representante miR
ilhas CpG em um painel de linhas celulares e amostras gástricas humanas (incluindo 13 biópsias normais, 38 biópsias gastrite, 112 pares de GC e as suas amostras de margens cirúrgicas) foi analisada por DHPLC-bissulfito e sequenciação. níveis de miARN maduro foram determinados com RT-PCR quantitativo. As relações entre miR
metilação, transcrição, desenvolvimento de GC, e as características clínico-patológicos foram analisados ​​estatisticamente.

Resultados da frequência de metilação de 5 miR
ilhas CpG (miR-9-1
, miR-9 -3
, miR-137
, miR-34b
e miR-210
) aumentou gradualmente enquanto a proporção de metilado miR-200b
diminuiu gradualmente durante a carcinogênese gástrica (Ps
< 0,01). Mais miR-9-1
metilação foi detectada em 62% -64% das amostras de GC e 4% das amostras normais ou gastrite (18/28 contra 2/48; odds ratio, 41,4; P Art < 0,01). miR-210
metilação mostrou alta correlação com H. pylori
infecção. miR-375
, miR-203
e
miR-193b metilação pode ser a adaptação de acolhimento para o desenvolvimento de GCs. A metilação desses miR
ilhas CpG foi consistentemente mostrado para reduzir significativamente os níveis correspondentes de miARN apresentados em linhas celulares humanas. A relação inversa também foi observado para miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
e
miR-200b em amostras gástricas. Entre 112 pacientes GC, miR-9-1
metilação foi um preditor independente favorável de sobrevida global dos pacientes GC em ambas as análises uni e multivariada (P Art < 0,02).
Conclusões
Em conclusão , alteração do estado de metilação de 6 de 9 testado miR
ilhas CpG foi caracterizado na carcinogênese gástrica. miR-210
metilação correlacionado com H. pylori
infecção. miR-9-1
metilação pode ser um evento específico em GC. Metilação de miR
ilhas CpG podem significativamente regular negativamente a sua transcrição regularmente.
Fundo
miRNA são uma classe abundante de pequenos RNAs não-codificantes que, principalmente, regulam a expressão gênica ao nível pós-transcricional. Eles desempenham papéis críticos na renovação e diferenciação de células-tronco e ajudam a manter linhagens celulares. Pesquisas anteriores já haviam mostrado que no câncer de vários dos miR
genes tais como o miR-200b /200A /429
, miR-21
, miR-30b
, miR-30d
, miR
-31, e miR-423
são regulados positivamente, enquanto outros miR
genes tais como o miR-143 e miR-

145 são regulados negativamente [1-3]. A evidência sugere que mudanças na expressão de miRNA ocorrem frequentemente em muitos tipos de câncer e essas variações, quer contribuir para a carcinogênese ou refletir o desenvolvimento e progressão de cancros.
Há uma série de vias que podem afetar os níveis de miRNA maduras em células e tecidos, tais como amplificação do gene ou exclusão, a regulação positiva da transcrição ou da regulação baixa, processamento pós-transcricional, e miRNA degradação [4-7]. É bem sabido que alguns miR intragénica
genes, tais como o miR-218-2
, são coordenadamente transcrito com os seus genes do hospedeiro por meio de mecanismos de co-regulação [8]. No entanto, muitos miR
genes são extragénico e uma certa proporção de miR intragénica
genes tais como o miR-9-1
são transcritos em um padrão independente do gene hospedeira [9]. Uma vez que a região promotora exacta da maior parte dos genes de miR
não são caracterizados, em especial no que diz respeito aos miR
genes extragênicos, os mecanismos reguladores exactos de miR
transcrição estão longe de ser claro.
Metilação ou de hipermetilação ilhas de CpG da região de sítios de transcrição de partida (TSS) é geralmente reconhecida para reprimir a transcrição do gene epigeneticamente. Ao contrário dos genes codificadores de proteínas que podem ter múltiplas ilhas de CpG, o miR
genes pode ser mais curta do que uma ilha de CpG, e em alguns casos, múltiplos miR
genes (ou seja, um agrupamento de genes de miR
) pode ser localizada dentro ou de acompanhamento uma única ilha CpG (arquivo adicionais 1: Tabela S1). metilação aberrante de ilhas CpG associados com miR
genes, como deixar-7a-3 Comprar e miR-34a
, é frequentemente observada em muitos tipos de câncer [10, 11]. Tem sido sugerido que a metilação das ilhas de CpG que estão associados com miR
genes (ou seja, o miR-203
, miR-152
, miR-124-1
, miR-34b /c
, miR-129-2
, miR-9-1
, miR-130b
, miR-124-2
e miR-181C
) pode inversamente correlacionada com a sua Os níveis de expressão [12-17]. No entanto, se ou não a transcrição de genes de miR
é regularmente afectados pelo estado de metilação de miR
ilhas CpG não foi sistemicamente estudados.
É bem conhecido que a metilação anormal ou a desmetilação de ilhas CpG em um pequeno proporção (< 1%) da população de células pode ser sensível à detecção em amostras de tecido heterozigotos celulares. Isto demonstra a vantagem de a análise de metilação sobre alterações da expressão do gene do ARN e os níveis de proteína que apenas pode ser detectada quando a tais mudanças está presente em uma grande proporção de uma população de células numa amostra [18]. Nossa análise bioinformática mostra 50, 9 e 70 de 721 miR
genes humanos no miRBase (liberação 14.0) estão localizadas, respectivamente, dentro, flanquear, e perto ilhas CpG (coletivamente vamos nos referir a elas como miR
ilhas CpG; arquivo adicional 1: Tabela S1). Nossa hipótese é que a metilação aberrante de miR
ilhas CpG pode ocorrer durante o desenvolvimento e progressão do câncer. Por isso, eles podem ser utilizados como genes candidatos, não só para a previsão do prognóstico do cancro, mas também para a investigação da associação metilação-expressão in vivo
. Assim, ilhas CpG de 9 miR
genes relacionados com a doença, incluindo 5 extragenic miR
genes ou grupos de genes (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b /200A /429
, miR-203
e miR-375
) e 4 genes intragênicos ou agrupamentos de genes (miR-9-1
, miR-34b /c
, miR-193b /365 -1
e miR-210
), foram selecionados como os genes representativos do presente estudo (arquivo adicionais 1: Tabela S1). A associação metilação-expressão para 3 destes miR
genes não tenha sido previamente estabelecida (arquivo adicionais 1: Tabela S2) [12, 14, 19-27]. Nós inicialmente selecionados para carcinoma gástrico (CG) - ou host-relacionados aberrante miR
metilação e, em seguida, investigaram a associação metilação-expressão in vitro e in vivo

. As associações entre características clinicopatológicas dos pacientes do GC e metilação destes miR
ilhas CpG foram também analisados ​​
Métodos
fontes de linha celular e cultura de células
informações Fonte de linhas celulares usados ​​utilizados neste estudo:. Células RKO linha, fornecido pelo Dr. Guoren Deng na Universidade da Califórnia em San Francisco; SW480 e HCT116 foram fornecidos pelo Dr. Yuanjia Chen em Peking Union Medical College Hospital; MKN74 e 293 T fornecido por Tokyo Medical and Dental University; PC-3 foi comprado a partir do celular Linha Banco da Academia Chinesa de Ciências Médicas; HL60 e KG1a foram obtidos do Departamento da Universidade de Pequim Primeiro Hospital de Hematologia; DU145 foi obtido a partir Hanmi Farmácia Companhia; Siha foi fornecido pelo Hospital Peking University Pessoas. HepG2 foi fornecida pelo Dr. Qingyun Zhang, Calu3 e A549 pelo Dr. Zhiqian Zhang, H1299 e AGS pelo Dr. Chengchao Shou, MKN45 pelo Dr. Youyong Lv, e outras linhas de células (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa e GES-1) pelo Dr. Yang Ke, tudo a Peking University Hospital do Câncer /Instituto. Estas linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO 2, utilizando vários meios de cultura. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1a, A549, H1299, GES-1, HepG2, 293 t, DU145, e RKO foram cultivadas em 90% de RPMI-1640 e FBS a 10%. PC-3 e AGS foram cultivadas em 90% de F-12 e 10% de FBS. Calu3, HeLa e Siha foram cultivadas em 90% de DMEM e FBS a 10%. SW480 e HCT116 foram cultivadas em 90% de DMEM: RPMI-1640 (1: 1). E 10% de FBS
Pacientes e amostras de tecido de amostras de GC
primária cirúrgicos e suas margens cirúrgicas amostras emparelhadas não cancerosos (SM) foram coletados de 112 pacientes (idade média 59,2 anos [intervalo, 32-79]; 80 machos e 32 fêmeas; 78 não cardíaca GCs e 34 GCs cardíacos; 40 GCs no pTNM fase I ~ II e 59 na fase III ~ IV) em Pequim Hospital do Câncer da Universidade. Follow-up de dados para todos os pacientes foi coletado durante pelo menos cinco anos. Todas as amostras clínicas, bem como informações histopatológica e acompanhamento para cada caso foram obtidos de acordo com as diretrizes institucionais aprovados. biópsias gástricas de 13 indivíduos saudáveis ​​e 38 pacientes ambulatoriais gastrite coletados do mesmo hospital foram utilizados como não-cancerosas controles paciente. Antes de modificação com bissulfito amostra de ADN genómico gástrica de cada doente foi analisado quanto à presença de H. pylori
espec�ico 23 S ADNr
por um ensaio de PCR tal como descrito anteriormente [28]. Os Institutional Review Boards de Peking University Hospital do Câncer e do Instituto aprovou o estudo (É1041207), e todos os pacientes deram consentimento informado por escrito. Extração de DNA
e modificação bisulfite
linha de células de câncer e DNA genômico amostra de tecido (1,8 mg) foi isolado utilizando fenol /clorofórmio de extracção [29]. Os resíduos de citosina não metilados nas amostras de ADN foram convertidos em resíduos de uracilo (tornando-se resíduos de timidina em produtos de PCR) pela adição de bissulfito de sódio a 5 M [30]. O iniciador universal Kit ADN Wizard® Clean-Up System (Promega) foi utilizado para purificar o ADN tratado com bissulfito antes-amplificação por PCR. Amplificação por PCR
e quantificação de miR
ilha CpG metilação por DHPLC
CpG livre conjuntos foram utilizados para amplificar miR
CpG ilhas de-arranque a quente polimerase PCR (arquivo adicionais 1: Figura S1 e arquivo adicionais 1: Tabela S3). Sequências de ilhas CpG incorporados ou ladeado estes miR relacionados
genes foram usados ​​para projetar os primers. Os produtos de PCR foram então analisados ​​quantitativamente por DHPLC no ADN Fragmento Análise Sistema [31] WAVE®. perfis de eluição de miR-9-3
, miR-200b
e miR-203
metilação foi analisada com um detector de ultravioleta; outro miR
metilação do gene foi detectado com a coluna de pós-HSX 3500 Acessório (Transgenomic, Inc., Omaha, EUA) e uma fluorescência de alta sensibilidade (FL) detector (excitação a 450 nm, emissão a 520 nm) [32 ]. Metilado e não metilado miR
produtos de PCR do gene foram separados por uma coluna analítica DNASep® (Transgenomic) à temperatura de desnaturação parcial correspondente (arquivo adicional 1: Tabela S3 e Figura S2-10). As áreas dos picos correspondentes aos produtos de PCR metilados e não metilados foram usadas para calcular a proporção de miR
metilado CpG Island [a proporção de cópias metilados = área /área de pico total de metilação-pico], como descrito anteriormente [33]. M.SssI-
ADN genómico a partir de amostras de sangue metilado foi utilizado como um controlo positivo. Figura 1 Cromatogramas DHPLC e seqüenciamento bissulfito de 7 ilhas miR CpG em linhas celulares representativas e amostras de tecido gástrico. Tanto o DNA humano de sangue periférico (sangue) e sua M.Sss
produtos I-metilado (M.BLOOD) foram utilizados como controle. Todos os locais CpG no amplicon de cada miR
ilha CpG também estão listados acima dos resultados de seqüenciamento bissulfito. Cada linha representa um clone; cada barra-de-rosa representa um sítio CpG metilado. O cromatograma correspondente de cada amostra sequenciado (coluna da direita) é mostrado (coluna da esquerda).
Bissulfito clone de sequenciamento
produtos de PCR fresco de miR
ilhas CpG amplificados com os conjuntos de primers universais CpG-livres foram clonados com o kit de pGEM-T Easy (Promega, Madison, EUA) e sequenciados com um Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer em SinoGeneMox Company (Pequim, China).
Extracção de ARN e detecção de nível de miARN maduro com ensaios de RT-PCR quantitativo
o ARN total de 50 ng foi extraída a partir de amostras de tecidos frescos ou linhas de células usando o reagente TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Correspondentes amostras de cDNA foram sintetizadas usando o TaqMan® microRNA Transcrição Reversa Kit (Life Technologies) com miR
espec�ico transcrição haste-laço inversa (RT) iniciadores (específico para miR-375
# RT000564, miR-34b
# RT000427, miR-137
# RT000593 e miR-9
# RT000583). As condições utilizadas foram RT 16 ° C durante 30 min ➔ 42 ° C durante 30 min ➔ 85 ° C durante 5 min. Os níveis de miRNA foram então analisadas utilizando um Gene Expression TaqMan kit mestre Mix (Life Technologies) com a sonda e iniciadores correspondente (Life Technologies, miR-375
# TM000564, miR-34b
# TM000427, miR-137
# TM000593 e miR-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # e # RT001093 TM001093) foi utilizado como referência interna. As condições dos ciclos de PCR foram 95 ° C durante 10 min ➔ seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 20 seg ➔ 60 ° C durante 1 min. Os níveis de expressão de miR-200b
e miR-210
foram determinadas utilizando um ensaio de RT-PCR poliA padrão. As sequências do iniciador adaptador RT, o iniciador universal e inversa U6
iniciador no ensaio normal poliA de RT-PCR são mostrados na arquivo adicional 1: Tabela S5. condições de RT foram de 55 ° C durante 5 min ➔ seguido por 25 ° C durante 10 min ➔ 42 ° C durante 1 h ➔ e 70 ° C durante 5 min. As condições dos ciclos de PCR foram 95 ° C for10min ➔ seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 20 seg ➔ e 61 ° C durante 1 min. A análise estatística

SPSS 16.0 Tendência
-test e Qui- de Pearson quadrado foram utilizados para analisar o miR
diferença de frequência de metilação entre biópsias normais, lesões de gastrite, amostras de GC e SM. Kruskal-Wallis H
-teste e One-Way ANOVA foram utilizados para analisar o MIR
diferenças metilação proporção entre biópsias normais, lesões gastrite, GC, e amostras SM. teste exato de Fisher, teste do qui-quadrado de Pearson, e Trend
-test foram utilizados para analisar a associação entre miR
taxas positivas de metilação e as características clínico-patológicas. O Mann-Whitney U
-teste e estudante de t
-test foram utilizados para analisar a associação entre a proporção de metilados miR
alelos e as características clínico-patológicas. métodos de Kaplan-Meier e Cox-Riscos Proporcionais foram utilizados para análise uni e multivariada para comparar a sobrevivência global dos doentes GC com diferenças no estado de metilação de miR
ilhas CpG. Todos os testes estatísticos foram em frente e verso, e P Art < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados Caracterização de metilação ou desmetilação de 6 de miR
ilhas CpG relacionadas com o desenvolvimento de GCs
Nós amplificado modelos tratado pelo bissulfito de 9 representativos miR
ilhas CpG primers com CpG-livres e desenvolvido 9 ensaios DHPLC para analisar o estado de metilação das ilhas CpG em produtos de PCR de 4 miR
genes intragênicos (miR-9-1
, miR-34b
, miR-193b
, miR-210
) e 5 miR
genes extragênicos (miR-9-3
, miR-137
, miR-200b
, miR-203 Comprar e miR-375
), respectivamente (Figura 1, arquivo adicionais 1: Tabela S3, e de arquivo adicionais 1: Figura S1-S10). Estes ensaios DHPLC revelou que a taxa positiva de metilação de 5 miR
ilhas CpG (miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, e miR-210
) foi significativamente aumentada em simultâneo com a gravidade das alterações patológicas no estômago. Estas descobertas sugerem fortemente que a metilação de miR estes
ilhas de CpG está relacionada com o desenvolvimento de GC (tendência
-test, miR-9-1
, P < 0,001
; miR-9- 3
, P <
0,001; miR-34b
, P = 0,008
; miR-137
, P <
0,001; miR-210
, P
= 0,001; Tabela 1). miR-9-1
metilação foi detectada em 18 dos 28 GC (sensibilidade, 64%), mas apenas em 2 de 48 biópsias normais ou gastrite mostrou metilação (especificidade, 96%). Embora a metilação de miR-200b
foi detectado em quase todas as amostras de tecidos gástricos, a proporção de metilado
miR-200b em tecidos normais ou gastrite (46% ~ 100%) foi significativamente mais elevada do que tanto em SM e GC As amostras (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U-test
, biópsias gastrite contra o SMS, P = 0,001;
Tabela 1). Isto sugere que o miR-200b
desmetilação foi um GC, evento específico do paciente. seqüenciamento bissulfito destes miR
ilhas CpG confirmou os dados obtidos a partir da análise DHPLC (Figura 1) .table estado 1 metilação de ilhas CpG miR em amostras de mucosa gástrica com diferentes alterações patológicas nos GC e pacientes do grupo controle não-cancerosas
miR Islands of CpG
Grupo de amostras gástricas
miR
metilação
taxa positiva
Proporção (%) de miR metilado
no miR
amostras de metilação positivo
taxa positiva (%)
χ Página 2
-valor
Tendência -test (P
-valor)
Median
[25% ~ 75%]
média
± SD
t /F /χ Página 2
-valor
P
-valor
miR-9-1
normal
1/13 (7,7)
27,598 Art < 0,001 a
NA
NA
Gastrite
1/35 (2,9)
NA
SM
9/28 (32,1)
17 [13-30]
20 ± 4
t
= -3,039
0,005 g
GC
18/28 (64,3)
29 [19-40]
32 ± 4
miR-9-3
normal
6/13 (46,2)
23,389 Art < 0,001 a
38 [31-59]
43 ± 6
F
= 1.639
0,189 h
Gastrite
15/37 (40,5)
43 [36-48]
42 ± 2
SM
26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2
GC
26/28 (92,9)
37 [26-43]
36 ± 2
miR-137
normal
5/13 (38,5)
18,626 Art < 0,001 a
10 [4-41]
χ Página 2
= 8,065
0,045 d
Gastrite
24/38 (63,2)
19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3g
GC
24/26 (92,3)
36 [20-51]
37 ± 4
miR-34b

normal
6/13 (46,2)
6,947
0,008 a
13 [7-19]
χ Página 2
= 0,658
0,883 d
Gastrite
13/36 (36,1)
11 [3-20]
SM
22/28 (78,6)
11 [4-18]
GC
19/28 (67,9)
10 [5-32]
miR-200b
normal
13/13 (100)
0,486
0,922 f
54 [52-83]
χ Página 2
= 17,883 Art < 0,001 d
Gastrite
35/36 (97,2)
52 [46-100] e
SM
27/28 (96,4)
44 [40-47]
GC
27/28 (96,4)
48 [40-53]
miR-210
normal
2/13 (15,4)
11,908
0,001 a
NA
NA
Gastrite
13/38 (34,2)
7 [ ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81,5)
11 [5-22]
GC
16/27 (59,3)
9 [4-16]
miR-193b
normal
0/13
7,045
0,008 b
NA
NA
Gastrite
2/37 (5,4)
NA
SM
7/28 (25,0)
5 [4-14]
GC
4/28 (14,3)
5 [2-12]
miR- 203
normal
5/13 (38,5)
5.617
0,018 b
32 [29-75]
χ Página 2
= 2.957
0,398 d
Gastrite
20/38 (52,6)
31 [26-36]
SM
21/28 (75,0)
34 [30-36]
GC
11/28 (39,3) c
32 [29-35]
miR-375
normal
0/13
12,266 Art < 0,001 b
NA
NA
Gastrite
13/38 (34,2) Sims 3 [3-4] e
SM
16/28 (57,1)
7 [4 -14]
GC
8/28 (28,6) c
17 [8-21]
, um teste de tendência
, entre normal, gastrite, SM e amostras de GC; b,
Tendência -teste, entre Normal, gastrite, e as amostras SM; c, teste do qui-quadrado de Pearson, GC contra SM: miR-203
, χ Página 2
= 7,292, P = 0,007
; miR-375
, χ Página 2
= 4.667, P = 0,031
; d, Kruskal-Wallis H
-test; e, Mann-Whitney U
-test: Gastrite contra SM, miR-200b
, U
= 230.000, P = 0,001
; Gastrite contra GC, miR-375
, U
= 46,000, P = 0,011
; SM contra GC, miR-137
, U
= 170.000, P
= 0,009; f, teste do qui-quadrado de Pearson, entre gastrite, amostras normais, SM e GC; g. Emparelhado t
-test: SM contra GC, miR-137
, t
= -2,652, P = 0,014
; h. One-way ANOVA; NA, não disponível.
Exceto para miR-9-1
e miR-137
, as taxas positivas de metilação ou proporções de metilado miR-9-3
, miR-34b
, miR-210
, e miR-200b
em GCs foram semelhantes àqueles no SMS (Tabela 1). Para validar se a metilação de alguns destes genes é
miR-um efeito de campo acontece simultaneamente em ambos os tecidos cancerosos e não cancerosos no estômago devido ao mesmo exposição a factores ambientais, foram detectados os dados de metilação em outro subconjunto de CG e as amostras SM de 84 pacientes e descobriu que a taxa positiva e proporção de metilado miR-9-1
em GCs ainda era significativamente maior do que no SMS (60,7% versus 32,1%; teste do qui-quadrado de Pearson, P =
0,001; Registe teste de classificação, P Art < 0,001; arquivo adicionais 1: Tabela S4, Subset-2). A proporção média do metilado miR-137
também foi significativamente maior nos GCs que SMs (Média
±
SD, 26 ± 2 versus 38 ± 2, emparelhado t-
teste, P <
0,001). Como esperado uma diferença significativa na taxa positiva ou a proporção de miR-9-3 metilado, miR-34b
, miR-210
e miR-200b
não foi observado entre GC e amostras SM. Estes resultados confirmaram que miR-9-1
e miR-137
metilação foi um evento específico do tumor e que miR-9-3
, miR-34b
e miR-210
metilação, bem como o miR-200b
desmetilação, foi um de efeito de campo que ocorreu durante a carcinogénese gástrica.
além disso, a taxa positiva de metilado miR-203 e miR-
375
gradualmente aumentada do normal para gastrite com amostras SM, mas diminuiu significativamente em GCs em comparação com o SMS (teste de Pearson Chi-quadrado, miR-203
, P = 0,007
; miR-375
, P = 0,031
; Tabela 1). No subgrupo-2 amostras, nós também analisados ​​miR-375
metilação e encontrou mais miR-375
metilação no SMS do que em GCs novamente (teste de Pearson Chi-quadrado, P = 0,034
; arquivo adicionais 1 : Tabela S4). Estes dados implicam que o miR-375
(203 e miR-
) metilação não é GC-específica e pode ser um tipo de adaptação de acolhimento nos tecidos não-malignas para o desenvolvimento de GC.
MiR
metilação e infecção pelo H. pylori
para determinar se a infecção por H. pylori
desempenha um papel na miR
metilação, nós olhamos para o H. pylori
espec�ico 23 S rDNA
em amostras de ADN genómico, por PCR gástricas e descobriram que o H. pylori
taxa -positivo aumentou simultaneamente com a gravidade das alterações patológicas [15,4% (2 de 13) das biópsias gástricas normais, 52,6% (20 de 38) de lesões de gastrite, e 69,0% (29 de 42) biópsias SM; tendência
-teste, P = 0,001
] e diminuiu em amostras de GC (18 de 42 = 42,9%; GCs contra SMs, teste de Pearson Chi-quadrado, P = 0,016
; arquivo adicionais 1: Figura S11 ). H. pylori
-positivas amostras gastrite /normais e SM apresentou maior metilação de miR-210
metilação do H. pylori
amostras -negative (P
= 0,036 e 0,022, respectivamente; Figura 2A e B). Figura 2 Comparação de miR metilação em várias amostras de mucosa gástrica, com e sem a existência de H. pylori. (A) biópsias normais ou gastrite de pacientes externos de controle sem doença maligna; (B e C) de margem e tumorais amostras cirúrgicas de pacientes com carcinoma gástrico, respectivamente; H. pylori específico 23-S ADNr
foi detectado por PCR.
Relação inversa entre o miR
metilação de ilhas de CpG e os seus níveis de expressão correspondentes
Para investigar a relação entre o acima aberrante miR
metilação e a transcrição do miR
gene correspondente, que quantificou os níveis de miRNA maduras de miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, miR-210
, miR-200b
, (e miR-375
), cujo estado de metilação está relacionada com o desenvolvimento de GC (e adaptação hospedeiro GC), tal como descrito acima, em um conjunto de linhas de células humanas com diferentes status de metilação de miR
ilhas CpG. O estado de metilação de cada ilha CpG miR
nestas linhas celulares foi determinada por DHPLC como ilustrado no arquivo adicional 1: Figura S2-S10. Os resultados de ensaios quantitativos de RT-PCR mostrou que nas linhas celulares testadas contendo metilado miR
alelos os níveis de miARN maduros de todas as 6 miR
genes relacionados com a GC e um hospedeiro adaptação gene miR
foram significativamente mais baixos do que aqueles detectada nas linhas celulares contendo não metilado miR
alelos (Figura 3A-G). A Figura 3 A relação entre o nível de expressão e estado de metilação de genes RIM em linhas de células humanas e amostras de tecidos gástricos. (A-G) A análise de correlação entre a percentagem de metilação de ilhas CpG miARN e os seus níveis de expressão de miARN maduros na ilha CpG alvo linhas de células humanas metilados e não metilados; (H-P) A expressão de miRNAs em 20, amostras de carcinoma gástrico frescos emparelhados; (U) linhas não metiladas ilha Alvo CpG celulares; insulares metilado linhas celulares (M) Alvo CpG; (U /M) Alvo CpG ilha parcialmente linhas celulares metiladas.
Analisamos ainda mais os níveis de miRNA de 20 pares de GC fresco e amostras SM e encontrou um nível de expressão significativamente maior de miRNA-200b,
miRNA-375, e miRNA-210 no SMS do que em GCs (Emparelhado t
-test: Ps
≤0.030; arquivo adicionais 1: Figura S12). Os níveis de miRNA-137 no SMS também foram mais altas do que os GCs, mas não foi estatisticamente significativa (P = 0,059
). Os níveis de miRNA-9 e miRNA-34b expressão foram semelhantes entre SMs e GCs. Mais importante ainda, foi observada uma relação inversa entre miR
metilação e o nível de expressão correspondente para miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
e miR-200b
nestas amostras de tecido gástrico (análise de Spearman, miR-9-1
, r
s
= -0,533, P = 0,001
; miR-9-3
, r
s
= -0,464, P = 0,004
; miR-137
, r
s
= -0,378, P =
0,019; miR-200b
, r
s
= -0,409, P = 0,010
; Figura 3H-K). A relação de metilação-expressão fraca inversa também foi encontrada para miR-375
nestas amostras de tecido (r
s
= 0,287, P = 0,085
; Figura 3O). Essa relação não foi observada para miR-34b Comprar e miR-210
(Figura 3L, N).
miR
metilação correlacionado com características clinicopatológicas dos pacientes GC
Para estudar a possibilidade de usando miR
metilação como um preditor prognóstico de GCs, determinou-se a prevalência de metilação de 7 miR
genes e analisada a relação entre as características clinicopatológicas de GC e os correspondentes níveis de metilação desses miR
ilhas CpG estudado features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive pylori
infecção. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Figura S6. Figura S12. Tabela S1. Tabela S2. Tabela S3. Tabela S4. Tabela S5. Tabela S6. Tabela S7.

• Presença de células inflamatórias S100A9-positiva em tecidos de câncer se correlaciona com um câncer em estágio precoce e um melhor prognóstico em pacientes com câncer gástrico
• Fez a transmissão do Helicobacter pylori em humanos causar um surto de doença em uma colônia de Dunnarts Stripe-faced (Sminthopsis macroura)?