Karakterizacija človeške želodčne povezanih karcinom metiliranjem 9 miR CpG otokov in zatiranju njihovih izrazov in vitro in in vivo

Karakterizacija človeške želodčne povezane s karcinomom metilacije 9 miR
CpG otokov in zatiranje njihovih izrazov in vitro
in in vivo
Abstract
Ozadje
mnogih MIR
geni ki se nahajajo znotraj ali okoli CpG otokov. Nejasno je, ali metilacija teh CpG otokov zatira MIR
prepis redno. Namen te študije je značilno želodčni karcinom (GC) -povezana metilacija miR
CpG otokov in odnose z Mirne izražanja.
Metod
statusa metilacija 9 reprezentativnega miR Poslovni
CpG otokov je z plošča celičnih linij in želodčnih vzorcih človeških (vključno z 13 normalnih biopsije, 38 gastritis biopsije, 112 parov GK in njihovih kirurških vzorcev doplačilu) je bila analizirana z bisulfita-DHPLC in zaporedja. Ravni Mature Mirna so bile določene s kvantitativno RT-PCR. Razmerja med miR
metilacije, prepis, razvoj GC, in clinicopathological značilnosti so statistično obdelali.
Rezultati
metilacije pogostost 5 miR
CpG otokov (miR-9-1
, miR-9 -3
, miR-137
, miR-34b
in miR-210
) postopoma povečala, medtem ko
delež metiliran pokoj-200B v želodcu rakotvornost postopoma znižuje (Ps
< 0,01). Več miR-9-1
metilacije so odkrili v 62% -64% vzorcev GC in 4% normalnih ali gastritis vzorcev (18/28 primerjavi 2/48; razmerje obetov, 41,4; P
< 0,01). miR-210
metilacija pokazala visoko korelacijo s H. pylori
okužbe. miR-375
, miR-203
in miR-193b
metilacija lahko prilagoditev gostitelj za razvoj GK. Metilacija teh MIR
CpG otokov dosledno bistveno zmanjšala ustrezne ravni Mirna predstavljene v humanih celičnih linijah. opazili tudi v obratnem sorazmerju za miR-9-1
, miR-9-3
, miR-137
in miR-200B
in želodčnih vzorcih. Med 112 bolniki GC, miR-9-1
metilacija je neodvisna ugoden pokazatelj celotnem preživetju bolnikov GC tako univariantne in multivariatne analize (P
< 0,02).
Sklepi
Skratka , sprememba statusa metilacijskega 6 9 testirali miR
CpG otokov je značilna želodčnega rakotvornost. miR-210
metilacija povezana s H. pylori
okužbe. miR-9-1
metilacija lahko dogodek GC-specifična. Metilacija miR
CpG otokov lahko pomembno redno navzdol uravnavajo svojo transkripcijo.
Ozadje
miRNA so bogat razred majhnih RNA brez kodiranja, ki večinoma uravnavajo izražanje genov na post-transkripcijski ravni. Igrajo ključne vloge pri obnovi in ​​diferenciacije matičnih celic in pomaga ohranjati celičnih linij,. Predhodne raziskave so pokazale, da pri raku več MIR
gene kot miR-200B /200a /429
, MIR-21
, miR-30b
, miR-30d
, MIR -31
in miR-423
se molekul, medtem ko so drugi MIR
genov kot miR-143
in miR-145
navzdol reguliranih [1-3]. Dokazi kažejo, da pride do sprememb v Mirni izražanja pogosto v številnih oblik raka in te razlike bodisi prispevajo k rakotvornosti ali odražajo razvoj in napredovanje raka.
Obstaja več poti, ki lahko vplivajo na zrelih ravni Mirna v celicah in tkivih, kot so pomnožitev gena ali izbris, prepisovanja Povecanje ali downregulation, post-transkripcijski obdelavo in miRNA razgradnja [4-7]. Znano je, da so nekateri intragenic miR
genov, kot je miR-218-2
, so koordinirano prepisani z gostujočimi genov preko koregulacije mehanizmov [8]. Vendar pa veliko MIR
geni extragenic in določen delež intragenic miR
gene kot miR-9-1
se prevedejo v gostiteljski genski neodvisen vzorec [9]. Ker so točen promotor regija večini MIR
genov ni značilno, zlasti v zvezi s extragenic Mir
genov, natančne regulativni mehanizmi MIR
prepisu še zdaleč niso jasne.
Metilacije ali hypermethylation od CpG otokov v regiji prepisu začenja območij (TSS) je splošno priznano, da zatirajo gensko transkripcijo epigenetically. Za razliko od kodiranja proteinskih genov, ki lahko obsegajo več CpG otokov, MIR
geni sme biti krajši od otoka CPG, in v nekaterih primerih, multipla miR
genov (tj MIR
gen cluster) lahko ki se nahajajo znotraj ali spremljajočih en sam otok CpG (Dodatni datotek 1: Tabela S1). Aberrant metilacija CpG otokov, povezanih z miR
genov, kot je oddajal-7a-3
in miR-34a
, je pogosto opaziti v mnogih raka [10, 11]. Predlagano je bilo, da metilacija CPG otokov, ki so povezane z MIR
genov (tj miR-203
, miR-152
, miR-124-1
, miR-34b /c
miR-129-2
, miR-9-1
, miR-130b
, miR-124-2
in miR-181c
) morda obratno povezati z njihovimi stopnje izraženosti [12-17]. Vendar pa je, ali prepis MIR
genov, ki jih metilacijskega statusa miR redno prizadeti
CpG otokov ni bila sistemsko preučevali.
Znano je, da je nenormalno metilacije in demetilacije CpG otokov v majhen delež (< 1%) celične populacije lahko občutkom odkriti v celičnih vzorcih heterozigotnih tkiva. To kaže na prednosti analizi metilacijskega več sprememb izražanja genov na RNK in koncentracije proteina, ki jih je mogoče zaznati samo takrat, ko je prisotna v velikem deležu populacije celic v vzorcu [18] taka sprememba. Naša genske analize je razvidno, 50, 9, in 70 721 ljudi MIR
genov v miRbase (Release 14,0) se nahajajo, oziroma, v roku, spremljajočih in blizu CpG otokov (skupaj se bomo sklicevali na to, kot miR
CpG otokov; Dodatni datotek 1: Tabela S1). Smo hipotezo, da lahko pride do odstopanja v metilacija MIR
CpG otokov pri razvoju in napredovanju raka. Zato bi jih bilo mogoče uporabiti kot kandidatnih genih, ne le za napovedovanje raka prognozo, ampak tudi za preiskavo metilacija-izražanja združenja vivo
. Tako CpG otokov 9, povezane z boleznijo MIR
genov, vključno s 5 extragenic MIR
genov in genskih skupin (miR-9-3
, MIR-137
, miR-200B /200A /429
, miR-203
in miR-375
) in 4 intragenic geni ali gruče genov (miR-9-1
, miR-34b /c
, miR-193b /365 -1
in miR-210
), so bili izbrani kot reprezentativne genov v tej študiji (Dodatni datotek 1: Tabela S1). Metiliranje-izraz združenje za 3 teh MIR
genov še ni bila ustanovljena (Dodatne datoteke 1: Tabela S2) [12, 14, 19-27]. Sprva smo pregledani za želodčni karcinom (GC) - ali zmotno miR povezanih z gostitelja
metilacije in nato preiskovali metilacija-izraz združenje vitro
in vivo
. Združenja med clinicopathological značilnosti bolnikov GC in metilacije teh miR
Analizirali smo tudi CpG otoki
Metode
celične linije viri in celični kulturi
Vir informacije o uporabljenih celičnih linij, ki se uporabljajo v tej študiji:. RKO celica linija, ki jo dr Guoren Deng na University of California San Francisco; SW480 in HCT116 so bili zagotovljeni dr Yuanjia Chen na Medical College Hospital Peking unije; MKN74 in 293 T, ki jih Tokyo zdravniških in zobozdravniških univerze; PC-3 je bila kupljena iz celične linije banke na kitajske akademije medicinske znanosti; HL60 in KG1A smo pridobili iz hematologijo oddelka Peking University prve bolnišnice; DU145 smo dobili od Hanmi Pharmacy Company; Siha je zagotovila Peking University Ljudska bolnišnica. HepG2 je zagotovil dr Qingyun Zhang, Calu3 in A549 dr Zhiqian Zhang, H1299 in AGS dr Chengchao Shou, MKN45 dr Youyong Lv in druge celične linije (SGC7901, BGC823, MGC803, HeLa in GES-1) dr Yang Ke, vse na Peking University Cancer Hospital /Institute. Te celične linije kultiviramo pri 37 ° C v 5% CO 2, ob uporabi različnih gojiščih kultur. MKN45, MKN74, SGC7901, BGC823, MGC803, HL60, KG1A, A549, so H1299, GES-1, HepG2, 293 T, DU145, in RKO kultivirani v 90% RPMI-1640 in 10% FBS. PC-3 in AGS smo gojili v 90% F-12 in 10% FBS. Calu3, HeLa in Siha smo kultivirali v DMEM 90% in 10% FBS. SW480 in HCT116 smo gojili v 90% DMEM: RPMI-1640 (1: 1). In 10% FBS
Bolniki in vzorce tkiva
Kirurški vzorci primarne GC in njihovih seznanjenih ne-rakave kirurški h kritju (SM) vzorcev je bilo zbrani od 112 hospitaliziranih (povprečna starost 59,2 let [območje, 32-79], 80 moških in 32 ženskih, 78 brez srca GCS in 34 srčnih GK; 40 GK v pTNM fazi I ~ II in 59 v fazi III ~ IV) na Peking University Cancer Hospital. Nadaljnji podatki za vse bolnike je bila najmanj pet let zbirajo. Vse klinične vzorce, kot tudi histopatološki in Followup informacije za vsak primer so bili pridobljeni v skladu z odobrenimi smernicami ustanove. Želodčne biopsije iz 13 zdravih osebah in 38 gastritis ambulantne bolnike, zbranih iz iste bolnišnice so bili uporabljeni kot nerakave nadzora bolnikov. Pred bisulfita modifikacijo smo analizirali vsakega pacienta želodca genomsko DNA vzorec prisotnosti H. pylori
-specifična 23. S rekombinantno
ga testu PCR kot je prej [28] opisano. Institucionalni Pregled odbori za Peking University Hospital raku in Zavod odobrila študijo (É1041207), in vsi bolniki so dali pisno obveščene privolitve.
Ekstrakcijo DNK in bisulfita spremembo
Rak celične linije in tkivnega vzorca genomske DNA (1,8 mikrogramov) smo izolirali s pomočjo ekstrakcije fenol /kloroform [29]. Je nemetiliran ostanki citozinske v vzorcih DNA smo pretvorili v ostankih uracil (postanejo ostankov timidinskih v produktov PCR) z dodatkom 5 M natrijevega bisulfita [30]. Wizard® DNA Clean-Up sistem Kit (Promega) je bil uporabljen za čiščenje DNK-bisulfita zdraviti pred PCR.
PCR pomnoževanje in količinska miR
CpG otok metilacija s DHPLC
CpG brez univerzalni temeljni premaz sklopi so bili uporabljeni za razširitev miR
CpG otokov z vročim zagonom PCR polimerazo (Dodatni datoteka 1: Slika S1 in dodatni datoteke 1: Tabela S3). Zaporedja CpG otokov vgrajenih ali obdajata teh povezanih MIR
geni so bili uporabljeni za oblikovanje primerje. PCR produkt smo nato analizirali kvantitativno DHPLC na WAVE® DNA fragmenta analizo sistema [31]. Elucijske profili pokoj-9-3
, MIR-200B
in miR-203
metilacije smo analizirali z ultravijoličnim detektorjem; druge MIR
gen metilacija je bila odkrita s post kolono HSX-3500 Pribor (Transgenomic, Inc., Omaha, ZDA) in visoko občutljivost fluorescence a (FL) detektorjem (vzbujanje pri 450 nm, emisijski pri 520 nm) [32 ]. Metiliran in nemetiliran MIR
izdelki gene PCR ločimo z DNASep® analizno kolono (Transgenomic) na ustrezni delni temperaturo denaturacije (Dodatni datotek 1: Tabela S3 in slika S2-10). Površine vrhov, ki ustrezajo metilnim in nemetiliran produktov PCR so bili uporabljeni za izračun deleža metilalkohola miR
otok CpG [delež metilnim kopij = metilacijskega-površina vrha /celotna površina vrha], kot je predhodno opisan [33]. M.SssI-
metiliran genomsko DNA iz vzorcev krvi smo uporabili kot pozitivno kontrolo. Slika 1 DHPLC kromatogrami in bisulfit zaporedja 7 miR CpG otokov v reprezentativnih celičnih linij in vzorcev želodca tkiva. Oba periferne krvi človeka DNA (krvi) in njegov M.Sss
I-methylated izdelkov (M.BLOOD) so bili uporabljeni kot kontrole. Vse CpG mesta v AMPLICON vsakega miR
otok CpG so navedeni tudi nad rezultati bisulfita sekvenciranja. Vsaka vrstica predstavlja en klon; vsak roza bar predstavlja metiliran CpG mesto. Ustrezni kromatogram vsakega zaporedje vzorca (desni stolpec) je prikazana (levi stolpec).
Bisulfit klon-zaporedja
Sveže PCR produkti miR
CpG otokov ojačane z CpG prostih univerzalnih primerskega sklopi so kloniranih z pGEM-T Easy kit (Promega, Madison, ZDA) in zaporedje z Applied Biosystems 3730xl DNK analizatorjem na SinoGeneMox Company (Peking, Kitajska).
Ekstrakcija RNA in odkrivanje ravni zrel miRNA z kvantitativnih preskusih RT-PCR
Skupaj 50 ng RNA je bila vzeta iz vzorcev sveže tkivne in celične linije z uporabo TRIzola reagenta (Life Technologies, Carlsbad, ZDA) po protokolu proizvajalca. Ustrezne cDNA vzorci so bili sintetizirani z TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies) z miR
-specifična izvornih loop obratno transkripcijo (RT) primerja (posebno za miR-375
# RT000564, miR-34b
# RT000427, miR-137
# RT000593 in miR-9
# RT000583). Pogoji RT uporabljeni bila 16 ° C za 30 minut ➔ 42 ° C za 30 minut ➔ 85 ° C 5 min. Ravni Mirni smo nato analizirali z TaqMan Gene Expression Master Mix komplet (Life Technologies), z ustrezno sondo in primerji (Life Technologies, miR-375
# TM000564, miR-34b
# TM000427, miR-137
# TM000593 in miR-9
# TM000583). U6
(Life Technologies, # RT001093 in # TM001093) je bila uporabljena kot notranjo uporabo. Kolesarske pogoji PCR bila 95 ° C za 10 min ➔ čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 20 sec ➔ 60 ° C 1 min. ekspresijski nivoji miR-200B
in miR-210
smo določili z uporabo standardnega poliA RT-PCR. Zaporedja adapterja temeljni premaz RT, univerzalni obratno temelj in U6
temeljni premaz v rednem poliA RT-PCR testa so prikazani v dodatni datoteki 1: Tabela S5. RT pogoji so bili 55 ° C za 5 minut, čemur sledi ➔ 25 ° C 10 min ➔ 42 ° C 1 uro ➔ in 70 ° C 5 min. Kolesarske pogoji PCR je bila 95 ° C for10min ➔ čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 20 sekund ➔ in 61 ° C za 1 min.
Statistična analiza
SPSS 16,0 Trend
-test in Pearsonov Chi- kvadrat test smo uporabili za analizo MIR
metilacija frekvenčno razliko med običajnimi biopsije, gastritis lezij, GC in SM vzorcev. Kruskal-Wallis H
-test in One-Way ANOVA smo uporabili za analizo MIR
metilacija delež razlike med normalnimi biopsije, gastritis lezij, GC in SM vzorcev. Fisherjev natančni test, Pearsonov hi-kvadrat test, in Trend
-test so bile uporabljene za analizo povezavo med miR
metilacije pozitivne stopnje in clinicopathological funkcije. Mann-Whitney U
-test and Student je t
-test so bile uporabljene za analizo povezavo med deležem metilirani MIR
alelov in clinicopathological funkcije. Kaplan-Meier in Cox-sorazmernih tveganj metode so bile uporabljene za univariantne in multivariatne analize primerjati celokupno preživetje bolnikov GC z razlikami v metilacijskega statusa miR
CpG otokov. Vsi statistični testi so bili dvostranski in P
< 0.05 smo imeli za statistično značilne.
Rezultati
Karakterizacija metilacije ali demetilacijo 6 miR
CpG otokov v zvezi z razvojem GK
smo ojačeno-bisulfitne obravnavajo predloge za 9 reprezentativnih miR
CpG otokov z CpG prostih temelji in razvili 9 DHPLC teste za analizo metilacijskega statusa otokov CpG v PCR produkta 4 intragenic MIR
genov (miR-9-1
, miR-34b
, miR-193b
, miR-210
) in 5 extragenic MIR
genov (miR-9-3
, miR-137
, miR-200B
, miR-203
in miR-375
), v tem zaporedju (slika 1, Dodatna datoteka 1: Tabela S3 in dodatna datoteka 1: Slika S1-S10). Te DHPLC analize pokazale, da je metilacija pozitivna stopnja 5 miR
CpG otokov (miR-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, in miR-210
) signifikantno hkrati poveča z resnostjo patoloških sprememb v želodcu. Te ugotovitve močno nakazujejo, da metilacije od teh miR
CpG otokov je povezano z razvojem GK (trend
-test, MIR-9-1
, P <
0,001; miR-9- 3
, P <
0,001; miR-34B
, P =
0.008; miR-137
, P <
0,001; miR-210
, P
= 0,001; tabela 1). miR-9-1
metilacije je bila odkrita v 18 od 28 GK (občutljivost, 64%), vendar le v 2 od 48 normalne ali gastritis biopsija je pokazala metilacije (specifičnost, 96%). Čeprav je metilacija miR-200B
odkrili pri skoraj vseh želodčnih tkiva vzorcev, je bil delež metiliran miR-200B
v normalnih ali gastritis tkiva (46% ~ 100%) bistveno višja od tiste, ki tako v SM in GC vzorcev (41% ~ 47%) (Mann-Whitney U-
test, gastritis biopsije v primerjavi s SMS, P =
0,001; tabela 1). To kaže, da je bil miR-200B
demetilacijo GC, specifičen za pacienta dogodek. Bisulfit zaporedja teh miR
CpG otoki potrjujejo podatke, dobljene iz analize DHPLC (slika 1) .table stanje 1 Metiliranie miR CpG otokov v želodcu vzorcih sluznice z različnimi patološkimi spremembami v GC in bolnikov, ki niso rakavi kontrolnih
miR
CpG otoki
Skupina želodca vzorcev
MIR
metiliranje
pozitivno stopnjo
Delež (%) od metiliran miR
v MIR
metilacijskih pozitivnih vzorcev
pozitivna stopnja (%)
χ
2
-vrednost
Trend
-test (P
-vrednost)
Mediana
[25% ~ 75%]
Srednja
± SD
t /F /χ
2
-vrednost
P
-vrednost
miR-9-1
Normal
1/13 (7,7)
27,598
< 0,001
NA
Na
gastritis
1/35 (2,9)
NA
SM
28/09 (32,1)
17 [13-30]
20 ± 4
t
= -3,039
0,005 g
GC
18/28 (64,3)
29 [19-40]
32 ± 4
miR-9-3
Normal
6/13 (46.2)
23,389
< 0,001
38 [31-59]
43 ± 6
F
= 1.639
0,189 h
gastritis
15/37 (40,5)
43 [36-48]
42 ± 2
SM
26/28 (92,9)
38 [26-44]
36 ± 2
GC
26/28 (92,9)
37 [26-43]
36 ± 2
MIR-137
Normal
5/13 (38,5)
18,626
< 0,001
10 [4-41]
χ
2
= 8,065
0,045 d
gastritis
24/38 (63,2)
19 [7-36]
SM
25/26 (96,4)
15 [7-40]
21 ± 3g
GC
24/26 (92,3)
36 [20-51]
37 ± 4
miR-34b

Normal
6/13 (46.2)
6,947
0.008
13 [7-19]
χ
2
= 0,658
0,883 d
gastritis
13/36 (36,1)
11 [3-20]
SM
22/28 (78,6)
11 [4-18]
GC
19/28 (67,9)
10 [5-32]
MIR-200B
Normal
13/13 (100)
0,486
0,922 f
54 [52-83]
χ
2
= 17,883
< 0,001 d
gastritis
35/36 (97,2)
52 [46-100] e
SM
27/28 (96,4)
44 [40-47]
GC
27/28 (96,4)
48 [40-53]
MIR-210

Normal
2/13 (15,4)
11.908
0.001
NA
Na
gastritis
13/38 (34,2)
7 [ ,,,0],5-10]
SM
22/27 (81,5)
11 [5-22]
GC
16/27 (59,3)
9 [4-16]
miR-193b
Normal
0/13
7.045
0.008 b
NA
Na
gastritis
2/37 (5.4)
NA
SM
7/28 (25.0)
5 [4-14]
GC
28/04 (14,3)
5 [2-12]
miR- 203
Normal
5/13 (38,5)
5,617
0.018 b
32 [29-75]
χ
2
= 2,957
0,398 d
gastritis
20/38 (52,6)
31 [26-36]
SM
21/28 (75,0)
34 [30-36]
GC
11/28 (39,3) c
32 [29-35]
miR-375
Normal
0/13
12.266
< 0,001 b
NA
Na
gastritis
13/38 (34,2)
3 [4/3] e
SM
16/28 (57,1)
7 [4 -14]
GC
28/08 (28,6) c
17 [8-21]
je tendenca
preskus, med Normal, gastritis, SM in GC vzorcev; b, Trend
-test, med Normal, gastritis in SM vzorcev; c, Pearsonov hi-kvadrat test, GC primerjavi SM: miR-203
, χ
2
= 7,292, P =
0,007; miR-375
, χ
2
= 4,667, P =
0,031; d, Kruskal-Wallis H
-test; e, Mann-Whitney U
-test: gastritis primerjavi SM, MIR-200B
, U
= 230.000, P =
0.001; Gastritis primerjavi z GC, miR-375
, U
= 46,000, P =
0,011; SM primerjavi z GC, miR-137
, U
= 170.000, P
= 0,009; f, Pearsonov hi-kvadrat test, med Normal, gastritis, SM in GC vzorcev; g. Paru t
-test: SM primerjavi z GC, MIR-137
, t
= -2.652, P =
0,014; h. Enosmerna ANOVA; NA, ni na voljo.
Razen miR-9-1
in pokoj-137
, metilacije pozitivne stopnje ali delež metiliran miR-9-3
, miR-34b
, MIR-210
in miR-200B
in GK so bile podobne tistim v SMS (tabela 1). Za potrditev, če je metilacija nekaterih od teh Mir
genov polje učinek se zgodi istočasno v obeh rakavih in ne-rakavih tkiv v želodcu zaradi istega izpostavljenosti okoljskim dejavnikom, smo zaznali podatke metilacije v drugi podskupini GC in SM vzorcev iz 84 bolnikov, in ugotovila, da je bila pozitivna stopnja ter delež metiliran miR-9-1
v GK še vedno precej višja od tiste v SMS (60,7% v primerjavi s 32,1%, hi-kvadrat test Pearson, P =
0,001; Prijava rang test, P
< 0,001; Dodatne datoteke 1: Tabela S4, Podmnožica-2). Povprečni delež metiliran miR-137
je tudi bistveno višja v GK kot SMS (Mean
± SD
, 26 ± 2 v primerjavi z 38 ± 2 Seznanjene t-
test, P <
0,001). Kot je bilo pričakovati bistveno razliko v pozitivne stopnje ali delež metiliran miR-9-3, miR-34b
, miR-210
in miR-200B
niso opazili med GC in SM vzorcev. Ti rezultati so potrdili, da je bil miR-9-1
in miR-137
metilacija dogodek tumor specifična in da miR-9-3
, miR-34b
in miR-210
metilacija, kot tudi miR-200B
demetilacijo, je polje učinek, ki je nastal v želodcu rakotvornost.
Poleg tega
pozitivna stopnja metiliran miR-203
in pokoj-375 postopoma povečuje od običajnih do gastritis do SM vzorcev, vendar bistveno zmanjšal v GK v primerjavi z SMS (Pearsonov hi-kvadrat test, miR-203
, P =
0.007; miR-375
, P =
0,031; tabela 1). V podskupini 2-vzorcev smo analizirali tudi MIR-375
metilacijo in ugotovila več MIR-375
metilacije v SMS, kot v GK znova (Pearsonov hi-kvadrat test, P =
0,034; Dodatni datotek 1 Preglednica S4). Ti podatki kažejo, da je miR-375
(in miR-203
) metilacija ne GC-specifična in je lahko ena vrsta prilagoditev gostiteljice v non-malignih tkiv v razvoju GK.
MIR
metilacija in H. pylori
okužba
če želite ugotoviti, H. pylori
okužba igra vlogo pri miR
metilacije, smo iskali H. pylori
-specifična 23. s rDNA
v želodčnih genomskih vzorcih DNA s PCR, in ugotovila, da v H. pylori
-positive stopnja hkrati povečala z resnostjo bolezenskih sprememb [15,4% (2 od 13) normalnih želodca biopsije, 52,6% (20 od 38) iz gastritis lezije in 69,0% (29 od 42), SM biopsije; trend
-test, P =
0,001] in se je v vzorcih GC (18 od 42 = 42,9%; GK primerjavi SMS, Pearson Chi-kvadrat test, P
= 0,016; Dodatna datoteka 1: Slika S11 ). H. pylori
-positive gastritis /normalno in SM vzorci so pokazali bistveno višjo metilacije Mir-210
metilacije od H. pylori
HBeAg negativnih vzorcev (P
= 0,036 in 0,022, v tem zaporedju; Slika 2A in B). Slika 2 Primerjava miR metilacije v različnih vzorcih želodčni sluznici in brez obstoja H. pylori. (A), Normal ali gastritis biopsije iz kontrolne ambulantne bolnike brez maligne bolezni; (B in C) kirurške robov in tumorskih vzorcev bolnikov z želodčnega raka, oziroma; H. pylori specifične 23 S rDNA
je bila odkrita s PCR.
Obrnjeno razmerje med MIR
metilacije CpG otokov in njihovih ustreznih stopnjah izražanja PODJETJA
Da bi raziskali odnos med zgornjo odklonskega miR
metilacija in prepis ustrezne MIR
gena, smo količinsko zreli ravni Mirna Mir-9-1
, miR-9-3
, miR-34b
, miR-137
, miR-210
, miR-200B
(in miR-375
), katerega metilacija stanje je povezano z razvojem GC (in prilagajanja GC gostiteljico), kot je opisano zgoraj, v nizu linije človeških celic z drugačnim statusom metilacijskega miR
CpG otokov. Metilacijskega statusa vsake miR
otok CpG v teh celičnih linijah smo določili z DHPLC kot je prikazano v dodatni datoteki 1: Slika S2-S10. Rezultati količinskih testov RT-PCR je pokazala, da v testiranih celičnih linijah, ki vsebujejo metilira MIR
alelov zrele ravni Mirna vseh 6 v zvezi z GC MIR
genov in eno gostiteljsko prilagoditve so bile MIR
gen bistveno nižje od tistih, ki odkrita v celičnih linij, ki vsebujejo nemetiliran MIR
alelov (Slika 3A-G). Slika 3 Razmerje med stopnjo izražanja in metilacijskega statusa MIR genov v humanih celičnih linijah in vzorcev želodca tkiva. (A-G) Analiza korelacije med metilacije deležem miRNA CpG otokov in zrelih ravni miRNA izražanja v ciljni otoku CpG metilni in nemetiliran linije človeških celic; (H-P) Izražanje miRNAs v 20 seznanjenih, sveže želodca vzorcih karcinoma; (U) Ciljna CpG otok nemetiliran celične linije; (M) Ciljna CpG otoških metilira celične linije; (U /M) Ciljna CpG otok delno metilni celične linije.
Smo dodatno analizirali raven Mirna po 20 parov svežega GC in SM vzorcev in ugotovili, bistveno višjo stopnjo ekspresije miRNA-200B,
miRNA-375, in miRNA-210 SMS, kot v GK (Seznanjena t
-test: Ps
≤0.030; Dodatna datoteka 1: Slika S12). Ravni miRNA-137 v SMS so tudi višje od tistih v GK, vendar ni bila statistično značilna (P =
0,059). Stopnje izraženosti Mirna-9 in miRNA-34b, so bili podobni med SMS in GK. Najpomembneje je, da so opazili obratno sorazmerje med MIR
metilacije in ustrezen nivo izražanja za pokoj-9-1
, MIR-9-3
, miR-137
in miR-200B
v teh vzorcih želodca tkiva (Spearman je Rank analize korelacije, miR-9-1
, r
s
= -0,533, P =
0.001; miR-9-3
, r
s
= -0,464, P =
0,004; miR-137
, r
s
= -0,378, P =
0,019; miR-200B
, r
s
= -0,409, P =
0,010; Slika 3H-K). Šibka inverzna metilacija-izraz razmerje je bilo tudi za miR-375
v teh vzorcih tkiv (r
s
= 0,287, P =
0,085; slika 3O). Tak odnos ni bil upoštevan za miR-34B
in miR-210
(slika 3 L, N).
MIR
metilacija korelaciji z clinicopathological značilnosti bolnikov GC
Preučiti možnost uporabo miR
metilacije kot prognoze napovedovalec GK, smo ugotovili razširjenost metilacije 7 MIR
genov in analizirati odnos med clinicopathological značilnosti GC in ustreznih ravneh metilacija teh miR
CpG otokov študiral predvsem za vse 112 GC bolnikov (tabela 2 in dodatna datotek 1: Tabela S6). features

miR-9-1
methylation

miR-9-3
methylation

miR-137
methylation

miR-34b
methylation

miR-200b
methylation

miR-375
methylation

miR-210
methylation

Positive pylori
okužbe. Slika S2. Slika S3. Slika S12. Tabela S2. Tabela S3. Tabela S4. Tabela S5. Tabela S6. Tabela S7.

• Prisotnost S100A9 pozitivnih vnetnih celic v tumorskih tkivih povezana z zgodnjim rakom fazi in boljšo prognozo pri bolnikih z razjedo cancer
• Ali prenos Helicobacter pylori pred ljudmi povzroči izbruh bolezni v koloniji trak obrazom Dunnarts (Sminthopsis macroura)