En GSDMB förstärkare driven HSV tymidinkinas-uttryckande vektor för styrning ockult peritoneal spridning av magcancer cells

En GSDMB
förstärkare drivna HSV tymidinkinas-uttryckande vektor för styrning ockult peritoneal spridning av gastric cancerceller Bild Sammanfattning
bakgrund
Magcancer (GC) är en av de stora maligna sjukdomar i hela världen, särskilt i Asien, och Japan och Korea har den högsta incidensen i världen. Eftersom de flesta av de fall som är okänsliga för behandlingar dör på grund av peritoneal spridning (PD) av cancerceller, är viktig för patientöverlevnad styra PD. GSDMB
är en medlem av gasdermin genfamiljen. Eftersom GSDMB
uttrycks i många typer av cancer, inklusive GC, är det troligt att genen innehåller en regulatorisk region som utnyttjas för terapi av ockult PD genom cancercellspecifik expression av cytotoxiska gener.
Metoder
Vi utförde reporter analyser för att identifiera den regulatoriska regionen för cancercellen specifika uttryck. Vi konstruerade även en lentiviral terapeutisk vektor som uttrycker herpes simplex-virus tymidinkinas (HSVtk) i en GC-cellspecifikt sätt, och testade den i en musmodell av PD.
Resultat
vi identifierat den regulatoriska regionen vid 496 till 989 från GSDMB
transkriptionsstartstället och betecknas det som en GSDMB
förstärkare. Lentiviral terapeutisk vektor tryckte proliferation av en GC-cellinje, 60As6, in vitro
i närvaro av ganciklovir, och intraperitoneal administrering av vektorn förlängde överlevnaden sikt av möss som ympades intraperitonealt med 60As6 en vecka före administrationen.
slutsatser
GSDMB
driven HSVtk expressionsvek hade en terapeutisk effekt på de ockulta PD modellmöss. Denna strategi kan potentiellt användas för att behandla GC patienter med PD.
Nyckelord
Mage tumörer bukhålan genterapi HSV tymidinkinas Bakgrund
Gastric cancer (GC) är en av de stora maligna sjukdomar, särskilt i Asien, och den näst vanligaste orsaken till cancerassocierade dödsfall i världen [1]. Det är oftast delas in i två typer (Laurens klassificering) [2], intestinal och diffus, som tros återspegla dess patogenes [3]. Den diffusa-typ GC (DGC) är under klassificeras som dåligt differentierad GC (icke-fast typ) eller odifferentierad GC i klassificeringssystemet japanska Gastric Cancer Association [4]. DGC är infiltrativ och ofta visar aggressiv invasion i magväggen, vilket resulterar i metastas och spridningen av de GC-celler in i peritonealhålan (peritoneal spridning, PD). Sälja The disseminerade GC-celler i bukhålan ge upphov till peritoneal karcinomatos ( PC) [5]. PC orsakar gastrointestinala symptom såsom buksmärtor, illamående och kräkningar, samt systemiska symtom såsom viktminskning och ascites. PC inte bara starkt försämrar livskvaliteten för GC patienter, men det är också den ledande dödsorsaken i GC [6]. Med stödjande vård ensam, är medianöverlevnad för patienter med PC 3-6 månader [7]. Om de behandlas med systemisk kemoterapi, på samma sätt som för andra metastatiska lesioner, visar PC en sämre respons på terapin än andra typer av metastas i GC, främst på grund av dålig fördelning av det kemoterapeutiska medlet i bukhålan. Därför har de senaste insatserna fokuserat på innovativa PC läkemedel, till exempel kombinera cytoreduktiv kirurgi, termisk behandling, och intraperitoneal kemoterapi. Dessa kombinerade tillvägagångssätt har något förbättrat prognosen för PC, även om medianöverlevnadsperiod är fortfarande mindre än 12 månader, vilket gör det tydligt att det finns en praktisk gräns för effekten av kirurgiska cytoreduktion [8, 9]. Nyligen genomförda studier tyder på att det är viktigt att identifiera GC patienter med ockult PD genom att utföra en cytologisk undersökning av peritoneal lavage, eftersom sådana fall visade förbättrad prognos om de erhållna omvandling till negativ cytologi av omfattande intraoperativ peritoneal sköljning följt av intraperitoneal kemoterapi [10].
begreppet "självmordsgen" cancerterapi, med användning av herpes simplex virus tymidinkinas (HSVtk), uppstod på 1980-talet [11]. HSVtk katalyserar fosforylering av guanosin analoga ganciklovir (GCV) till en mono form som därefter fosforyleras av cellulära nukleotid kinaser i mycket giftiga ganciklovirtrifosfat [12]. Ganciklovirtrifosfat blockerar DNA-replikation, vilket leder till cellcykelstopp och celldöd [13]. Terapi inbegriper HSVtk överföring till cancerceller, följt av GCV administration, är känd som självmord genterapi, och denna teknik användes nyligen i en klinisk prövning fas III på glioblastoma multiforme [12].
I denna studie har vi utvecklat en terapeutisk vektor som uttrycker HSVtk i cancerceller, med användning av en regulatorisk region av gasdermin B-genen (GSDMB
). GSDMB
är en medlem av gasdermin (GSDM
) familj som består av fyra gener, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC Köpa och GSDMD
[14, 15], och är uttrycks i prolifererande celler av normalt epitel och även i många typer av cancer, inklusive esofagus, magsäck, lever, kolon, livmoderhalsen och bröstcancer [14, 16-18]. GSDMB
expression drivs av två promotorer, den cellulära promotom och LTR-härledda promotorn [19-21]. LTR-härledda promotorn (LTR-promotom) är aktiv i de flesta normala vävnader, förutom i magen, och i många cancercellinjer, medan cellulär promotor är aktiv i normal magvävnad och i vissa cancercellinjer [20]. I denna studie identifierade vi en region i nedströms av LTR-promotorn, som visade stark transkriptionell aktivitet i GC-cellinjer. Vi använde denna region för att konstruera en HSVtk-uttryck virusvektor för att styra ockult PD.
Metoder
mänskliga vävnader
Magcancer (GC) vävnader som tillhandahålls av National Cancer Center Hospital efter att ha erhållit skriftligt informerat samtycke från varje patienten, som godkändes av National Cancer Center Institutional Review Board (ID: No.17-030). Vävnadsprover frystes omedelbart med flytande kväve efter kirurgisk extraktion, och lagrades vid -80 ° C fram till användning.
Microarray analys
Totalt RNA isolerades genom att suspendera cellerna i ISOGEN lysbuffert (Nippon Gene, Toyama, Japan) följt av utfällning med isopropanol. Vi utförde uttryck analyser med hjälp av mänskligt uttryck Array U95A version 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA) enligt leverantörens protokoll. Uttrycket värde (genomsnittlig skillnad: AD) av varje gen beräknades med hjälp av Genechip Analys Suite version 4.0 programvara (Affymetrix). Hierarkisk klustring av microarray uppgifter utfördes med användning av GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), Microsoft Excel och Cluster & Treeview [22, 23]. Alla microarray uppgifter har deponerats i en MIAME kompatibel databas, GEO (anslutningsnummer, GSE47007). Genom Wilcoxon u
-testet (p
< 0,05), och genom att visa en 2-faldig förändring, gener uttrycks specifikt i diffus-typ GC selekterades [22]
Cellinjer och primära kultur av mus. mesotelceller
Tre gastriska cancercellinjer, HSC-57, härledda från intestinal-typ GC, och HSC-59 och HSC-60, båda härledda från diffus-typ GC, fastställdes och som kännetecknas av en av författarna [24 ]. SNU16, som härrör från diffusa-typ GC, lämnades från American Type Culture Collection (ATCC), två andra cellinjer med effektivitet i att producera PD möss, 60As6 och 60As6GFP (60As6 uttrycker grönt fluorescerande protein), upprättades av författarna från diffus typ GC härledd HSC-60-cellinje efter flera passager av intraperitoneal transplantation till möss [25]. CC-2511, en fibroblast-cellinje, köptes från Lonza, Japan (Tokyo, Japan). Alla cellinjer upprätthölls i Dulbeccos Modified Eagle Medium. Mus mesotelceller skördades genom injicering av 10 ml av värmt 0,25% Trypsin /EDTA-lösning in i peritonealhålan [26]. Cellerna inkuberades under 3 dagar i RPMI-1640 kompletterat med L-glutamin, Fenolrött och HEPES (Wako, Tokyo, Japan). Met-5A, en human mesothelial cellinje, tillhandahölls av ATCC och upprätthölls i medium 199 (Life Technologies, Tokyo, Japan) kompletterat med 3,3 nM EGF (Life Technologies), 400 nM hydrokortison (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA), 870 nM insulin (Life Technologies) och 10% FBS.
RT-PCR
Totalt RNA från humana normala organ köptes från BioChain, Hayward, CA. Totalt RNA extraherades med användning av en RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tokyo, Japan). Efter generering av första sträng-cDNA från total RNA med användning ThermoScript RT-PCR System (Life Technologies, Tokyo Japan), utfördes PCR med AccuPrime ™ Pfx
DNA-polymeras (Life Technologies) under följande cykelbetingelser av antingen 35 (LTR-transkript ) eller 25 cykler (andra): 95 ° C under 1 min; 56 ° C (β-aktin) eller 58 ° C (andra) under 1 minut; och 72 ° C under 1 min. Följande primeruppsättningar användes: för cellulär promotor transkriptet, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'och 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; för LTR-promotor-härledda transkript, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'och 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; för 3'-sidan av GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3 'och 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3'; för MYH11
, 5'CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'och 5'- CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; och för β-aktin
, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'och 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3'.
Reporter Assay Review, en genomfragment, -1.080-1053 av GSDMB
och innehållande LTR-promotorn, amplifierades genom PCR med användning av LA Taq Hot Start-DNA-polymeras (Takara) i 35 cykler vid 96 ° C under 30 s och 68 ° C under 2 min, med användning av primeruppsättningar: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'och 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', och sattes in i en pGL3 basvektor (Promega, Madison, WI). Det trunke användning av restriktionsställena: Nhe
I och Eco
R jag att generera -1.035-1053 fragment; KPN Review I och Eco
R I för -426 till 1053; Nhe
I och Afl
II för -61 till 1053; Nhe
I och Eco
81 I för 129-1053; och Nhe
I och Stu
jag för 496-1053. Den 496-1053 reporterkonstruktion var ytterligare stympade med restriktionsenzymer: Nhe
I och Swa
jag för 757-1053; Nhe
I och Pvu
II för 860-1053; Nhe
I och Bst
X I för 989-1053; Xho
I och Bst
X I för 496-989; Xho
I och Pvu
II för 496-860; och Xho
I och Swa
I för 496-757. För ytterligare trunkering av 496-989 fragmentet, utfördes PCR med fragmentet som en mall med användning av Ex Taq DNA-polymeras (Takara) i 35 cykler av 95 ° C under 1 min, 58 ° C under 1 min och 72 ° C i 1 min, under användning av följande primeruppsättningar: för 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'och 5'- AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; och för 649-989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'och 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Efter amplifiering, var fragmenten insattes i pGL4.12 [luc2CP
] vektor (Promega). De -1 kb uppströms regioner av CXCR4
och CXCR7
framställdes genom genomisk PCR med användning MightyAmp DNA-polymeras (Takara) i 35 cykler vid 98 ° C under 10 s, 62 ° C i 15 s och 68 ° C i 2 min, med användning av följande primeruppsättningar: för CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'och 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; och för CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'och 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Dessa fragment sattes in i pGL4.12 [luc2CP
] vektor. Ett mikrogram varje konstruktion och Renilla luciferas kontroll reportervektor (pRL-SV40 vektor, Promega) samtransfekterades i 1 x 10 5 celler med användning av SuperFect transfektionsreagens (QIAGEN). Luciferasanalysen genomfördes 24 h efter reportern införandet, med användning av ett Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Analysen utfördes i tre exemplar.
GSDMB
enhancer-HSVtk lentivirus vektor Review, en pMFG-HSVtk vektorn tillhandahölls av RIKEN BRC genom National Bio-Resursprojektet i MEXT, Japan, med tillstånd av Dr . Hirofumi Hamada, och en HSVtk-cDNA skars ut från det som en Nco
I-Bam
Hl-fragment. För att konstruera GSDMB
enhancer-HSVtk lentivirus vektor, först den 496-989-fragmentet (GSDMB
enhancer) sattes in i pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) mellan Nhe
I och Hind
III platser och sedan HSVtk-cDNA sattes in i vektorn vid en Bam
-ställe i framåt (för avkänning-strängen uttryck) eller bakåt (för antisense-strängen uttryck) riktning. Därefter tillsattes GSDMB
enhancer-HSVtk förnuft och GSDMB
enhancer-HSVTK antisens-fragmenten skars ut från de plasmidvektorer som Nhe
I-Not
I fragment och infogades i pLVSIN-CMV neo vektorer mellan Xbal
I och Not
I-ställena. Slutligen tillsattes en CMV-promotor avlägsnas från de lentivirala konstruktionerna. För att generera viruspartiklar som innehåller vektorades konstruktionerna infördes i Lenti-X ™ 293 T-celler (Takara) med hjälp av Lenti-X ™ HTX Packaging System (Takara). Efter 72 h'-inkubation byttes mediet uppsamlades och den virala titern (cfu /ml) bestämdes genom transduktion in i HT-1080-celler i närvaro av polybren (5 | j, g /ml i odlingsmedium, Sigma-Aldrich). Partiklarna applicerades på Met-5A och 60As6 (1 × 10 5 celler per skål, i tre exemplar) in vitro
i närvaro av polybren (5 | j, g /ml) och cellerna inkuberades i medium innehållande Gancicrovir (GCV, 5 | ig /ml, WAKO) under 5 dagar för celltillväxtanalyser. Analyserna utfördes i tre exemplar och P
-värdet av Students t
-test mellan de odlade cellerna med (+) och utan (-) GCV beräknades Behandling
PD musmodell med GSDMB förstärkare-HSVtk vektorer
Vi har tidigare rapporterade en mus PD modell (PD möss) som producerades av intraperitoneal injektion av 60As6 celler [25]. 60As6GFP celler (1 x 10 6 celler per mus) injicerades i bukhålan av 18 möss (6 veckor gamla möss av CB17 /ICR Prkdc < scid > /CrlCrlj Genotyp: scid /scid, Charles River, Yokohama Japan) vid dag 1. mössen delades in i två grupper; en grupp injicerades med antisens-expressionsvektor, och den andra gruppen injicerades med känslan vektorn; båda grupperna sedan injicerades intraperitonealt med 2 ml av PBS-lösning innehållande viruspartikel (5 x 10 5 cfu) och Ganciclovir (2 mg) vid 8, 10 och 12 dagar. Den genomsnittliga överlevnadstiden för varje grupp och P
-värde av Students t
-test mellan de två grupperna har beräknats. Studien godkändes av National Cancer Center utskottet djurförsök.
Resultat
Identifiering av en förstärkare region GSDMB
, som driver genuttryck i GC-celler
att identifiera promotor /enhancer regioner som skulle vara effektivt i utvecklingen av ett terapeutiskt vektor för peritoneal spridning (PD), först sökte vi efter gener oftare uttrycks i diffus-typ GC än i intestinal-typ GC använder jämförande genexpressionsanalys mellan 12 primära diffusa typer och 18 tarm -types, eftersom PD oftare ses i diffus-typ GC än i tarm-typ [22]. Vi märkte att fyra av tio Affymetrix Genechip probuppsättningar visar den högsta flerfaldiga förändringen för genuttryck i diffus-typ GC jämfört med intestinal-typ var probuppsättningar för MYH11
(myosin, tung kedja 11, glatt muskulatur genen Ytterligare fil 1: Tabell S1). Efter att ha bekräftat att genen inte uttrycks i den immortaliserade human mesotelceller linje Met-5A (data visas ej), valde vi MYH11
som en stark kandidat för genen vars promotor möjliggör diffus typ GC specifikt uttryck av HSVtk. Emellertid är genen inte uttrycks i 60As6 celler som användes för framställning av PD modellmöss (ytterligare fil 2: Figur S1). Det är troligt att MYH11
uttrycks i cancer-associerade fibroblaster som är särskilt rikligt förekommande i diffus-typ GC vävnader. Nästa, gå ut analysen microarray uppgifter, skiftade vi vår uppmärksamhet mot uppströms regioner i CXCR4
(kemokin (CXC motiv) receptor 4-genen) och CXCR7
(kemokin (CXC motiv) receptor 7-genen), som båda uttrycks i många typer av cancer och har en viktig roll i metastas [27]. Men med hjälp av reporter analyser, fann vi att de uppströms regionerna i dessa gener var transkriptionellt aktiv i både Met-5A och 60As6 celler (Ytterligare fil 2: Figur S2), vilket innebär att regionerna driva uttrycket av HSVtk i humana mesotelceller in vivo
. Slutligen har vi fokuserat på GSDMB
genen, som vår tidigare studie visade att det är starkt uttryckt i GC vävnader och cellinjer [14].
GSDMB
transkriberas av två promotorer, cellulära och LTR-promotorer ( Fig. 1a), och senare används främst i normala vävnader och cancercellinjer [19-21]. Vi bekräftade dessa fynd genom att utföra RT-PCR-analyser på RNA från flera olika typer av normala vävnader (Fig. 1b). RT-PCR på GC kirurgiska prover visade att LTR-promotorn användes i 14 av 15 intestinal-typ GC och i 11 av 15 diffus typ GC (Fig. 1c). Fikon. 1 GSDMB
genen transkriberas av den cellulära och LTR-promotorer. (A) En schematisk illustration av de två promotorerna. (B) Expression av två transkript, en genom cellulär promotor och den andra av LTR, i humana normala vävnader (RT-PCR). Fyra varianter av humant GSDMB transkript är registrerade i Genbank; variant 1 (NM_001042471), variant 2 (NM_018530), variant 3 (NM_001165958) och variant 4 (NM_001165959). Transkription av varianter 1, 3 och 4 drivs av den cellulära promotom och den för variant 2 är av LTR-promotorn. 3'-sidan av den GSDMB
transkripten är gemensam för vardera. (C) Expression av LTR-transkript i magcancer vävnader, 15 tarm-typ och 15 diffus typ prover (RT-PCR på kirurgiska prover) katalog att identifiera en region avgörande för den transkriptionella aktiviteten i GC-celler, ett DNA-fragment som spänner -1.080-1053 bp positionen från en transkriptionsstartplatsen för LTR-promotorn, isolerades (Fig. 2a). De reporter analyser på trunkerade DNA-fragment med användning av två GC-cellinjer, HSC-57 och HSC-59, visade att en 496-989-regionen hade stark transkriptionell aktivitet, till och med starkare än den för den ursprungliga -1.080-1053 fragmentet och som ytterligare trunkering av 496-989-fragmentet resulterade i signifikant reduktion av den transkriptionella aktiviteten (Fig. 2b). Den region som motsvarar detta fragment med stark transkriptionell aktivitet benämndes GSDMB
enhancer. Fikon. 2 Identifiering av GSDMB
förstärkare. (A) En schematisk illustration som visar reporterkonstruktioner som används i luciferasanalyser. Långa terminala upprepningen (LTR) del av de mänskliga endogena retrovirus visas med en dubbelriktad pil. Positionen är från transkriptionsstartstället för utskrift av LTR-promotorn. (B) Luciferasanalyser med två gastric cancercellinjer, HSC-57 och HSC-59, visade en region med stark transkriptionsaktivitet, som spänner från 496 till 989, som betecknades som GSDMB
förstärkare. Vektor, tom reportervektor, Bar, standardavvikelse
Konstruktion av en GSDMB
förstärkare drivna HSVtk lentivirus vektor
Vi har tidigare rapporterat en mus PD modell (PD möss) som producerades av intraperitoneal injektion av 60As6 celler [ ,,,0],25]; i denna studie har vi utvecklat en viral terapeutisk vektor för behandling av PD möss. För att undersöka styrkan av transkriptionsaktiviteten för GSDMB
förstärkare i 60As6, var reporter analyser utföras med reportern konstruera för uppströms regionerna CXCR4 Mössor och CXCR7
för jämförelse. Den GSDMB
förstärkare uppvisade starkare transkriptionsaktivitet i 60As6 celler än CXCR4
eller CXCR7
uppströms regioner, och, viktigare, GSDMB
förstärkare hade mycket svag transkriptionsaktivitet i mus peritoneala mesotelceller och i Met-5A, en human mesotelcell linjen (Fig. 3). Detta resultat antyder att den GSDMB
enhancer möjliggör HSVtk expression nästan uteslutande i 60As6 men inte i mesotelceller hos peritonealhålan hos PD-möss, och förmodligen inte i human peritoneal mesothelium. Fikon. 3 GSDMB
förstärkare har stark transkriptionell aktivitet i en 60As6 cellinje. Luciferasanalyser med tre typer av odlade celler: 60As6 celler som användes för framställning av peritoneal spridning (PD) modellmöss i denna studie, primära kulturceller av mus peritoneala mesotelceller och etablerad human mesotherial cellinje Met-5A. Bar, standardavvikelse
Därefter undersökte vi effekten av HSVtk /GCV behandling med hjälp av GSDMB
förstärkare drivna HSVtk lentivirus vektor på 60As6 in vitro
(Fig. 4a). Antalet 60As6 celler omvandlade med lentivirus vektor reducerades signifikant vid inkubation i medium kompletterat med GCV; å andra sidan, hade samma HSVtk /GCV behandling ingen effekt på cellantalet av Met-5A (fig. 4b). Fikon. 4 HSVtk /GCV behandling med hjälp av GSDMB
förstärkare drivna lentivirus vektor förbättrade överlevnaden av PD möss. (A) En lentiviral terapeutisk vektor för GSDMB
förstärkare (Enh) -driven uttryck av herpes simplex virus tymidinkinas (HSVtk). (B) Cellproliferationsanalyser på 60As6 och Met-5A transducerad med den terapeutiska vektorn, utfördes genom inkubering i medium med (+) /utan (-) ganciklovir (GCV). (C) en regim av HSVtk /GCV terapi för PD möss. Bar, standardavvikelse, P
, P
-värdet av Students t
-test mellan de odlade cellerna med (+) och utan (-) GCV. (D) Mikroskopisk observation uppvisade en liten population av 60As6GFP celler (grön fluorescens) implanterade i mus peritoneum vid dag 10 (e) Antal överlevande möss efter HSVtk /GCV behandling med känslan sträng uttrycker vektorn (röd) och med en antisens -sträng uttrycka vektor som referens (blå). Genomsnittliga överlevnadstiden för varje grupp visas på höger sida med P
- värdet av Students t
-test mellan de två grupperna
HSVtk /GCV behandling av ockulta PD möss
Vi tillämpade HSVtk /GCV terapi till PD-möss. I denna terapeutiska analys framställde vi två typer av GSDMB
förstärkare drivna lentivirus vektor: en vektor uttryckte känslan-strängen av HSVtk cDNA och användes för behandling av PD möss, medan den andra vektorn uttryckte antisens-strängen och användes som kontroll. Terapin påbörjades sju dagar efter intraperitoneal inokulation av 60As6 celler som uttrycker grönt fluorescensprotein (60As6GFP). Denna regim var avsedd för behandling av ockult PD modell där 60As6GFP celler diffust inympade i peritonealhålan (fig. 4c, d). Efter tre doser av behandling, vid dag 36 hade ingen av de nio möss som behandlats med HSVtk sinnesuttrycksvektor dog, medan två av de nio referens mössen redan hade dött. Ingen av de nio referens möss levde på dag 57, dvs åtta veckor efter injektion av 60As6GFP celler; Men fyra av nio terapeutiska vektor behandlade möss fortfarande levde (Fig. 4e). Detta resultat tyder på att terapi kan förbättra prognosen av ockulta PD möss.
Diskussion
GSDMB
förstärkare driver genuttryck i GC-celler
Tidigare rapporterade vi att GSDMB
uttrycks i alla GC vävnader och cellinjer undersöktes [14], och i denna studie har vi visat att LTR-promotorn driver GSDMB
expression i 25 av 30 GC prover (Fig. 1c). Den transkriptionella aktiviteten av LTR-regionen (Fig. 2a) har tidigare demonstrerats genom reporter analyser i icke-GC cellinjer [20, 21]. Men vi hittade en distinkt region med stark transkriptionsaktivitet i den nedströms LTR-regionen, och betecknade den som GSDMB
förstärkare. I tillägg till de två GC-cellinjer, HSC-57 och HSC-59, den transkriptionella aktiviteten hos denna region som detekteras av reporter analyser i andra GC-cellinjer, inklusive MKN74 (relativa luciferasaktiviteten var ca 1,9), HSC-60 (29,4 ), HSC-42 (2,5) och HSC-44 (4,6), men inte i HSC-58 eller MKN28 (data ej visade) [14]. Således innebär den GSDMB
förstärkare inte köra genuttryck i vissa GC-celler.
Trunke av en region som spänner över 496-562 minskade signifikant den transkriptionella aktiviteten av GSDMB
förstärkaren (fig. 2b, 562 till 989). I 496-562 region, fann vi konsensusbindningsställen för flera transkriptionsfaktorer, inklusive GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 och NFY-A, och bas-substitution i någon av dessa konsensussekvenser gjorde inte påverkar den transkriptionella aktiviteten av förstärkaren (data ej visade). Transkriptionsfaktom som interagerar med förstärkaren och bidrar till dess transkriptionsaktivitet har ännu inte identifierats.
Tillämpning av den terapeutiska lentivirus-vektor för att behandling av human ockult PD
Kurativ behandling har inte fastställts för PD. GC patienter med makroskopisk PD har dålig prognos, med en medianöverlevnaden av 3-6 månader. De med bara mikroskopiska PD har också en dålig prognos; deras 5-års överlevnad är 0-18% [28]. Därför är det viktigt att upptäcka ockult PD genom cytologisk undersökning av peritoneal lavage och fullständigt utrota cancerceller i bukhålan. Metaanalyser av Cabalag et al
. indikerade att omfattande intraperitoneal sköljning (EIPL, fysiologisk saltlösning en kull /dos, 10 gånger) och intraoperativ intraperitoneal kemoterapi (IIPC) med cisplatin förbättrades 5-års överlevnad betydligt mer än 40% [28]. Resultaten av vår studie tyder på att HSVtk /GCV behandling med hjälp av lentivirus vektor förbättrar prognosen för patienter oberoende, och vi antar att det kommer att användas som en konsolideringsbehandling. Solida tumörer med diffus tillväxt är sammansatta av många myofibroblaster och få fartyg (t ex diffus-typ GC, pankreatiska cancrar och scirrhous typ av bröstcancer). Beroende på villkoren för mikro, såsom näringsbrist, dessa tumörer visar en hög förekomst av sällan proliferativa tumörceller. Sålunda kan diffus-typ GC-celler som spridits i den peritoneala håligheten består av en befolkning som kan motstå den cytotoxiska effekten av cisplatin. Lentivirus terapeutisk vektor kan introducera HSVtk i både prolifererande och icke-prolifererande celler. Dessutom möjliggör GSDMB
förstärkare GC cellspecifika HSVtk uttryck. Denna begränsade expressionen minimerar mesotelcell skador, vilket innebär att genterapi kan utföras med användning doser som är tillräckligt höga för att fullständigt utrota GC-celler, till och med sådana som är resistenta mot cisplatin, i ockult PD. Det är troligt att kombinationsterapi, EIPL och IIPC, följt av HSVtk /GCV behandling med hjälp av lentivirus vektor, kommer att förbättra prognosen för ockult PD mer påtagligt än EIPL och IIPC kombinationsbehandling ensam. Vi tror att denna regim är värd att placeras på kliniska prövningar. Även om det verkar som om GSDMB
förstärkare fungerar inte i vissa GC-celler, ytterligare studier som syftar till att identifiera ytterligare GC specifika förstärkare, kommer lösa det här problemet.
Slutsatser
GSDMB
driven HSVtk uttryck vektor hade en terapeutisk effekt på de ockulta PD modellmöss. Denna strategi kan potentiellt användas för att förhindra GC patienter från upphandlande PD och även används för att behandla GC patienter med PD.
Förklaringar
Bekräftelse
Denna studie stöddes av en Grants-i-Stöd för vetenskaplig forskning (C .) av Japan Society för främjande av Science (JSPS KAKENHI licensnummer 23.501.322) katalog Ytterligare filer
Ytterligare fil 1: Tabell S1. Topp tio probuppsättningar visar uttryck specifikt för diffusa-typ magsäckscancer. Ytterligare fil 2: Figur S1. MYH11
uttrycks inte i gastric cancercellinjer. En promotorregion av både CXCR4 Mössor och CXCR7
gener visar en transkriptionsaktivitet i både 60As6 och Met-5A celler. Konkurrerande intressen
Författarna förklarar de har inga konkurrerande intressen.
Författarnas bidrag
NS och HS utformade och riktade denna studie. NS utförde biologiska analyser och djurförsök med stöd av RK, FC och KY. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Gastric cancer vid ett universitet universitetssjukhus i nordvästra Tanzania: en retrospektiv granskning av 232 fall
• Effekterna för antagning diagnos på magtömning i kritiskt sjuka patienter