Un vettore GSDMB enhancer-driven HSV-timidina chinasi che esprime per il controllo occulto disseminazione peritoneale di cellule di cancro gastrico

Un GSDMB
vettore enhancer-driven HSV-timidina chinasi che esprime per il controllo occulto disseminazione peritoneale di cellule di cancro gastrico
Abstract
sfondo
cancro gastrico (GC) è una delle principali malattie maligne in tutto il mondo, soprattutto in Asia e il Giappone e la Corea hanno la più alta incidenza nel mondo. Poiché la maggior parte dei casi che sono refrattari alle terapie muoiono per diffusione peritoneale (PD) delle cellule tumorali, controllo PD è importante per la sopravvivenza del paziente. GSDMB
è un membro della famiglia genica gasdermin. Perché GSDMB
è espresso in molti tipi di cancro, tra cui GC, è probabile che il gene contiene una regione regolatoria che viene utilizzata per la terapia del PD occulta attraverso specifiche cellule del cancro espressione di geni citotossici.
Metodi
Abbiamo eseguito i test giornalista per identificare la regione regolatoria per l'espressione specifica delle cellule del cancro. Abbiamo costruito anche un vettore lentivirale terapeutica che esprime l'herpes simplex virus di timidina chinasi (HSVtk) in maniera specifica delle cellule GC, e testato in un modello murino di PD.
Risultati
Abbiamo identificato la regione regolatoria a 496 a 989 dal GSDMB portale di inizio della trascrizione e designato come un GSDMB
enhancer. Il vettore lentivirale terapeutica soppressa la proliferazione di una linea cellulare GC, 60As6, in vitro
in presenza di ganciclovir, e somministrazione intraperitoneale del vettore prolungato il termine sopravvivenza dei topi che sono stati inoculati per via intraperitoneale con 60As6 una settimana prima della somministrazione.
Conclusioni
Il GSDMB
driven HSVtk vettore di espressione ha avuto un effetto terapeutico sulle occulte topi modello PD. Questa strategia può potenzialmente essere usato per il trattamento di pazienti con CG PD.
Parole
neoplasie dello stomaco peritoneale cavità terapia genetica HSV timidina chinasi Sfondo
cancro gastrico (GC) è una delle principali malattie maligne, in particolare in Asia, e la seconda causa di decessi per cancro-associata in tutto il mondo [1]. Di solito è classificata in due tipi (classificazione di Lauren) [2], intestinale e diffusa, che si pensa per riflettere la sua patogenesi [3]. La diffusa di tipo GC (DGC) è sub-classificati come poco GC differenziati (di tipo non-solido) o GC indifferenziata nel sistema di classificazione giapponese cancro gastrico associazione [4]. DGC è infiltrativa e spesso mostra l'invasione aggressiva nella parete gastrica, con conseguente metastasi e la diffusione delle cellule GC nella cavità peritoneale (diffusione peritoneale, PD).
Le cellule GC disseminate nella cavità peritoneale dare luogo a carcinosi peritoneale ( PC) [5]. PC provoca sintomi gastrointestinali, come dolori addominali, nausea e vomito, così come i sintomi sistemici, come la perdita di peso e ascite. PC non deteriora solo fortemente la qualità della vita dei pazienti GC, ma è anche la causa principale di morte in GC [6]. Con la sola terapia di supporto, la sopravvivenza mediana dei pazienti con PC è di 3-6 mesi [7]. Se trattati con chemioterapia sistemica, nello stesso modo come per altre lesioni metastatiche, PC mostra una scarsa risposta alla terapia di altri tipi di metastasi in GC, soprattutto a causa della cattiva distribuzione dell'agente chemioterapico nella cavità peritoneale. Pertanto, gli sforzi recenti si sono concentrati su terapie innovative per PC, come ad esempio la combinazione di chirurgia citoriduttiva, terapia termale, e la chemioterapia intraperitoneale. Questi approcci combinati hanno leggermente migliorato la prognosi di PC, anche se il periodo di sopravvivenza media è ancora inferiore a 12 mesi, rendendo chiaro che vi è un limite pratico alla efficacia di citoriduzione chirurgica [8, 9]. Studi recenti suggeriscono che è importante identificare pazienti GC con PD occulta eseguendo un esame citologico del liquido di lavaggio peritoneale, perché tali casi mostravano migliore prognosi se ottenuti conversione alla citologia negativa vasta lavaggio peritoneale intraoperatoria seguita da chemioterapia intraperitoneale [10].
Il concetto di terapia del cancro "gene suicida", usando herpes simplex virus di timidina chinasi (HSVtk), emerso nel 1980 [11]. HSVtk catalizza la fosforilazione del ganciclovir guanosina analogico (GCV) in una forma monofosfato che viene successivamente fosforilata dalle chinasi cellulari nucleotide in trifosfato ganciclovir altamente tossico [12]. blocchi ganciclovir trifosfato replicazione del DNA, portando ad arresto del ciclo cellulare e la morte cellulare [13]. La terapia che comportano un trasferimento HSVtk in cellule tumorali, seguita dalla somministrazione GCV, è conosciuta come la terapia genica suicidio, e questa tecnica è stata recentemente utilizzata in uno studio clinico di fase III sul glioblastoma multiforme [12].
In questo studio, abbiamo sviluppato un terapeutica vettore che esprime HSVtk nelle cellule tumorali, utilizzando una regione regolatoria del gene gasdermin B (GSDMB
). GSDMB
è un membro del gasdermin (GSDM
) famiglia che si compone di quattro geni, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC
e GSDMD
[14, 15], ed è espresso in cellule proliferanti dell'epitelio normale e anche in molti tipi di cancro, tra cui esofageo, gastrico, fegato, del colon, della cervice uterina e tumori al seno [14, 16-18]. GSDMB
espressione è guidato da due promotori, il promotore cellulari e promotore LTR-derivato [19-21]. Il promotore LTR-derivato (LTR promotore) è attivo nella maggior parte dei tessuti normali, tranne lo stomaco, e in molte linee cellulari tumorali, mentre il promotore cellulare è attivo nel tessuto normale stomaco e in alcune linee cellulari tumorali [20]. In questo studio, abbiamo identificato una regione a valle del promotore LTR, che ha mostrato forte attività trascrizionale in linee cellulari GC. Abbiamo usato questa regione per costruire un HSVtk espressione vettore virale per il controllo PD occulto.
Metodi
tessuti umani
cancro gastrico (GC) i tessuti sono stati forniti dal Cancer Center National Hospital dopo aver ottenuto il consenso informato scritto da ciascun il paziente, che è stato approvato dal National Cancer center Institutional Review Board (ID: No.17-030). I campioni di tessuto sono stati immediatamente congelati con l'azoto liquido dopo l'estrazione chirurgica, e conservati a -80 ° C fino al momento dell'uso.
microarray analisi
RNA totale è stato isolato sospendendo le cellule in tampone di lisi ISOGEN (Nippon Gene, Toyama, Giappone) seguita da precipitazione con isopropanolo. Abbiamo eseguito espressione analisi utilizzando Expression Array umana U95A versione 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA) secondo i protocolli dei fornitori. Il valore di espressione (differenza media: AD) di ogni gene è stato calcolato utilizzando il software versione 4.0 GeneChip Analysis Suite (Affymetrix). clustering gerarchico dei dati di microarray è stata effettuata utilizzando GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), Microsoft Excel e Cluster & TreeView [22, 23]. Tutti i dati di microarray sono stati depositati in un database compatibile MIAME, GEO (numero di accesso; GSE47007). Con Wilcoxon u
-test (p
< 0,05) e mostrando una variazione di 2 volte, i geni espressi in particolare nella diffusa di tipo GC sono stati selezionati [22]
linee cellulari e colture primarie di mouse. cellule mesoteliali
Tre linee cellulari di cancro gastrico, HSC-57, derivato dal tipo intestinale GC e HSC-59 e HSC-60, entrambi derivati ​​dal diffuso tipo GC, sono stati stabiliti e caratterizzati da uno degli autori [24 ]. SNU16, derivato dalla diffusa di tipo GC, è stato fornito dalla American Type Culture Collection (ATCC), le altre due linee cellulari con l'efficienza nella produzione di topi PD, 60As6 e 60As6GFP (60As6 che esprime la proteina di fluorescenza verde), sono stati stabiliti dalla dalla autori diffusa di tipo GC deriva linea di cellule HSC-60 dopo vari passaggi di trapianto intraperitoneale a topi [25]. CC-2511, una linea cellulare di fibroblasti, è stato acquistato da Lonza, Giappone (Tokyo, Giappone). Tutte le linee cellulari sono state mantenute in Modified Eagle Medium di Dulbecco. cellule mesoteliali topo furono raccolte a iniezione di 10 ml di 0,25% soluzione /EDTA tripsina riscaldato nella cavità peritoneale [26]. Le cellule sono state incubate per 3 giorni in RPMI-1640 integrato con L-glutammina, rosso fenolo e HEPES (WAKO, Tokyo, Giappone). Met-5A, una linea di cellule mesoteliali umane, è stato fornito da ATCC e mantenuto in media 199 (Life Technologies, Tokyo, Giappone) integrato con 3,3 nM EGF (Life Technologies), 400 Nm idrocortisone (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO stati Uniti d'America), 870 nM insulina (Life Technologies) e il 10% FBS.
RT-PCR
totale RNA da organi normali umani sono stati acquistati da BIOCHAIN, Hayward, CA. Gli RNA totali sono stati estratti utilizzando un RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Tokyo, Giappone). Dopo aver generato cDNA primo filamento di RNA totale usando Thermoscript sistema RT-PCR (Life Technologies, Tokyo, Giappone), la PCR è stata eseguita con AccuPrime ™ PFX
DNA polimerasi (Life Technologies) nelle seguenti condizioni di ciclismo su entrambi 35 (trascrizioni LTR ) o 25 cicli (altro): 95 ° C per 1 min; 56 ° C (β-actina) o 58 ° C (gli altri) per 1 min; e 72 ° C per 1 min. I seguenti set di primer sono stati utilizzati: per cellulari promotore trascrizione, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'e 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; per LTR trascritti promotore derivato, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'e 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; per 'lato GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3' il 3 e 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3 '; per MYH11
, 5'- CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'e 5'-CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; e per β-actina
, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'e 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3'
. Reporter Assay
Un frammento genomico, -1.080-1053 di GSDMB
e contenente il promotore LTR, è stato amplificato mediante PCR utilizzando polimerasi Taq lA Hot DNA Start (Takara) in 35 cicli di 96 ° C per 30 s e 68 ° C per 2 min, utilizzando set di primer: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'e 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', e inserita in un vettore di pGL3 base (Promega, Madison, WI). E 'stato troncato utilizzando i siti di restrizione: Nhe
I e Eco
R I per generare il frammento -1.035-1053; Kpn
I e Eco
io R per -426 a 1053; Nhe
I e II Afl
per -61 a 1053; Nhe
I e Eco
81 I per 129-1053; e Nhe
io e Stu
I per 496-1053. Il costrutto 496-1053 giornalista è stata ulteriormente troncato con enzimi di restrizione: Nhe
I e Swa
I per 757-1053; Nhe
I e II Pvu
per 860-1053; Nhe
I e Bst
X I per 989-1053; Xho
I e Bst
X I per 496-989; Xho
I e II Pvu
per 496-860; e Xho
I e Swa
I per 496-757. Per ulteriori troncamento del 496-989 frammento PCR è stata effettuata con il frammento come modello utilizzando polimerasi Ex Taq DNA (Takara) in 35 cicli di 95 ° C per 1 min, 58 ° C per 1 minuto, e 72 ° C per 1 minuto, utilizzando i seguenti set di primer: per 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'e 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; e 649-989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'e 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Dopo l'amplificazione, frammenti sono stati inseriti in pGL4.12 [luc2CP
] vettore (Promega). I -1 regioni kb a monte di CXCR4
e CXCR7
sono stati preparati dalla genomica PCR usando polimerasi MightyAmp DNA (Takara) in 35 cicli di 98 ° C per 10 s, 62 ° C per 15 s, e 68 ° C per 2 minuti, utilizzando i seguenti set di primer: per CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'e 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; e per CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'e 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Questi frammenti sono stati inseriti nel [luc2CP
] vettore pGL4.12. Un microgrammo di ogni costrutto ed il controllo della luciferasi giornalista vettore Renilla (PRL-SV40 vettore, Promega) sono stati co-trasfettato in 1 × 10 5 cellule utilizzando SuperFect Transfection Reagent (QIAGEN). Il saggio luciferasi è stata eseguita 24 ore dopo l'introduzione giornalista, utilizzando un sistema di analisi Reporter Dual-luciferasi (Promega). Il test è stato effettuato in triplicato.
GSDMB
enhancer-HSVtk lentivirus vettore
Un vettore PMFG-HSVtk è stato fornito da BRC RIKEN attraverso il progetto nazionale di bio-risorse del MEXT, Giappone, per gentile concessione di Dr . Hirofumi Hamada, e un HSVtk cDNA è stato asportato da esso come un sottufficiale
I-Bam HI
frammento. Per costruire il GSDMB
enhancer-HSVtk lentivirus vettore, prima del 496-989 frammento (GSDMB
enhancer) è stato inserito nella pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) tra Nhe
I e Hind
siti III, e quindi HSVtk cDNA è stato inserito nel vettore in un sito Bam HI
in avanti (per l'espressione senso-filamento) o inversa (per l'espressione antisenso-strand) direzione. Avanti, GSDMB
senso enhancer-HSVtk e GSDMB
frammenti antisenso enhancer-HSVtk sono stati asportati dai vettori plasmidici come Nhe
I-Non
i frammenti e inseriti in pLVSIN-CMV vettori neo tra il Xba
I e non
i siti. Infine, un promotore CMV è stato rimosso dai costrutti lentivirali. Per generare particelle virali contenenti i vettori, i costrutti sono stati introdotti in lenti-X ™ 293 T Cells (Takara) utilizzando Lenti-X System ™ HTX Packaging (Takara). Dopo 72 H'-incubazione, il mezzo è stato raccolto e il titolo virale (cfu /ml) è stato determinato trasduzione in cellule HT-1080 in presenza di polibrene (5 mg /ml in terreno di coltura, Sigma-Aldrich). Le particelle sono state applicate per Met-5A e 60As6 (1 × 10 5 cellule per piatto, in triplice copia) in vitro
in presenza di polibrene (5 mg /ml), e le cellule sono state incubate in terreno contenente Gancicrovir (GCV, 5 mg /ml, WAKO) per 5 giorni per saggi di crescita cellulare. I saggi sono stati eseguiti in triplice copia e P
-value di t di Student
-test tra le cellule in coltura con (+) e senza (-) GCV è stato calcolato
Trattamento di modello di topo con PD GSDMB vettori enhancer-HSVtk
abbiamo riportato in precedenza un modello PD del mouse (topi PD) che è stato prodotto mediante iniezione intraperitoneale di cellule 60As6 [25]. 60As6GFP cellule (1 × 10 6 celle per il mouse) sono stati iniettati nella cavità peritoneale di 18 topi (6 settimane di età topi di CB17 /ICR-Prkdc < SCID > /CrlCrlj genotipo: SCID /SCID, Charles River, Yokohama in Giappone) al giorno 1. I topi sono stati divisi in due gruppi; un gruppo è stato iniettato con il vettore di espressione antisenso, e l'altro gruppo è stato iniettato con il vettore senso; entrambi i gruppi sono stati poi intraperitoneale iniettati con 2 mL di soluzione PBS contenente particella virale (5 × 10 5 cfu) e Ganciclovir (2 mg) a 8, 10 e 12 giorni. Il tempo medio di sopravvivenza di ogni gruppo e il P
-value di Student t-test
tra i due gruppi sono stati calcolati. Lo studio è stato approvato dal Comitato Nazionale Cancer Center sulla sperimentazione animale.
Risultati
Identificazione di una regione enhancer in GSDMB
, che guida l'espressione genica in cellule di GC
per identificare le regioni promotore /enhancer che sarebbe efficace nello sviluppo di un vettore terapeutico per diffusione peritoneale (PD), abbiamo prima cercato per geni più frequentemente espressi in diffuse di tipo GC rispetto tipo intestinale GC utilizzando comparativa analisi di espressione genica tra 12 diffuse tipi primari e 18 intestinale -Tipi, perché PD è più spesso visto in diffusa di tipo GC rispetto al tipo intestinale [22]. Abbiamo notato che quattro su dieci Affymetrix GeneChip set di sonde che mostra la più alta pieghevole cambiamento per l'espressione genica in diffusa di tipo GC rispetto al tipo intestinale erano set sonda per MYH11
(miosina, catena pesante 11, gene della muscolatura liscia, sui file 1: Tabella S1). Dopo aver confermato che il gene non viene espresso nella immortalato linea di cellule mesoteliali umane Met-5A (dati non riportati), abbiamo selezionato MYH11
come un candidato forte per il gene che ha come promotore consente diffusa di tipo GC espressione specifica del HSVtk. Tuttavia, il gene non è espresso in 60As6 cellule che sono stati utilizzati per la fabbricazione topi modello PD (file aggiuntivo 2: Figura S1). E 'probabile che MYH11
è espresso in fibroblasti cancro associati che sono particolarmente abbondanti nei tessuti GC diffuso tipo. Poi, uscendo dalla analisi dei dati microarray, abbiamo spostato la nostra attenzione alle regioni a monte di CXCR4
(chemochine (CXC motivo) receptor 4 gene) e CXCR7
(chemochine (motivo CXC) del recettore 7 gene), sia come sono espressi in molti tipi di cancro e di avere un ruolo importante nella metastasi [27]. Tuttavia, utilizzando saggi Reporter, abbiamo scoperto che le regioni a monte di questi geni erano trascrizionalmente attivo sia il Met-5A e le cellule 60As6 (file aggiuntivo 2: Figura S2), il che implica che le regioni guidano l'espressione di HSVtk nelle cellule mesoteliali umane in vivo
. Infine, ci siamo concentrati sulla GSDMB
gene, come il nostro precedente studio ha indicato che è fortemente espressa nei tessuti GC e linee cellulari [14].
GSDMB
viene trascritto da due promotori, cellulari e promotori LTR ( Fig. 1a), e il secondo è utilizzato principalmente nei tessuti normali e nelle linee di cellule di cancro [19-21]. Abbiamo confermato questi risultati eseguendo RT-PCR analisi su RNA da diversi tipi di tessuti normali (Fig. 1b). RT-PCR su GC campioni chirurgici dimostrato che il promotore LTR è stato utilizzato in 14 dei 15 tipo intestinale GC e in 11 dei 15 GC diffuse di tipo (Fig. 1c). Figura. 1 GSDMB
gene è trascritto dai promotori cellulari e LTR. (A) Una illustrazione schematica dei due promotori. (B) Espressione dei due trascritti, uno dal promotore cellulare e l'altra da LTR, in tessuti umani normali (RT-PCR). Quattro varianti di trascrizione GSDMB umana sono registrati in GenBank; Variante 1 (NM_001042471), la variante 2 (NM_018530), variante 3 (NM_001165958) e la variante 4 (NM_001165959). Trascrizione di varianti 1, 3 e 4 è guidato dal promotore cellulare e quella della variante 2 è dal promotore LTR. Il lato 3 'del GSDMB
trascrizioni è comune a ciascuno. (C) Espressione dei trascritti LTR nei tessuti di cancro gastrico, 15 di tipo intestinale e 15 campioni diffuse di tipo (RT-PCR su campioni chirurgici)
Per identificare una regione critica per l'attività trascrizionale in cellule di GC, un frammento di DNA che attraversa -1080 al +1053 bp, la posizione da un sito di inizio della trascrizione per il promotore LTR, è stato isolato (Fig. 2a). I saggi reporter su frammenti di DNA troncati utilizzando due linee di cellule GC, HSC-57 e HSC-59, ha indicato che una regione 496-989 avuto una forte attività trascrizionale, ancora più forte di quello dell'originale -1.080-1053 frammento, e che ulteriori troncamento del 496-989 frammento comportato significativa riduzione dell'attività trascrizionale (Fig. 2b). La regione corrispondente a questo frammento con forte attività trascrizionale è stato nominato GSDMB
enhancer. Figura. 2 Identificazione GSDMB
enhancer. (A) Una illustrazione schematica che mostra costrutti reporter utilizzati nei saggi di luciferasi. Lungo elemento terminal repeat (LTR) del retrovirus endogeno umano è indicato da una freccia a due punte. La posizione è dal sito di inizio della trascrizione per la trascrizione del promotore LTR. (B) saggi di luciferasi utilizzando due linee di cellule di cancro gastrico, HSC-57 e HSC-59, ha rivelato una regione con una forte attività trascrizionale, che vanno 496-989, che è stato designato come GSDMB
enhancer. Vector, vettore giornalista vuoto, Bar, deviazione standard
Costruzione di un GSDMB
enhancer-driven HSVtk lentivirus vettore
Abbiamo precedentemente riportato un modello di PD del mouse (topi PD) che è stato prodotto mediante iniezione intraperitoneale di cellule 60As6 [ ,,,0],25]; in questo studio, abbiamo sviluppato un vettore virale terapeutica per il trattamento di topi PD. Per esaminare la forza della attività trascrizionale di GSDMB
enhancer in 60As6, saggi giornalista sono stati eseguiti, utilizzando il giornalista costrutto per le regioni a monte di CXCR4
e CXCR7
per il confronto. Il GSDMB
enhancer ha mostrato forte attività trascrizionale nelle cellule 60As6 rispetto al
CXCR4 o CXCR7
regioni a monte, e, soprattutto, il GSDMB
enhancer aveva attività trascrizionale molto debole nel topo cellule mesoteliali peritoneali e in Met-5A, una linea cellulare umana mesoteliali (Fig. 3). Questo risultato suggerisce che l'GSDMB
enhancer consente espressione HSVtk quasi esclusivamente in 60As6 ma non nelle cellule mesoteliali della cavità peritoneale di topi PD, e probabilmente non in mesotelio peritoneale umana. Figura. 3 GSDMB
enhancer ha una forte attività trascrizionale in una linea cellulare 60As6. saggi di luciferasi con tre tipi di cellule in coltura: cellule 60As6 che sono stati utilizzati per la fabbricazione topi modello peritoneale diffusione (PD) in questo studio, le cellule colture primarie di topo cellule mesoteliali peritoneali e consolidata linea di cellule umane mesotherial Met-5A. Bar, deviazione standard
Successivamente, abbiamo esaminato l'effetto della terapia HSVtk /GCV utilizzando il GSDMB
enhancer-driven HSVtk lentivirus vettoriale su 60As6 in vitro
(Fig. 4a). Il numero di cellule 60As6 trasdotte con il vettore lentivirus era significativamente ridotta quando incubati in medium supplementato con GCV; d'altra parte, lo stesso trattamento HSVtk /GCV avuto alcun effetto sul numero di cellule di Met-5A (Fig. 4b). Figura. 4 terapia HSVtk /GCV utilizzando il GSDMB
enhancer-driven vettore lentivirus migliorato il tasso di sopravvivenza dei topi PD. (A) Un vettore terapeutico lentivirali per GSDMB
enhancer (Enh) espressione -driven di herpes simplex virus di timidina chinasi (HSVtk). (B) saggi di proliferazione cellulare su 60As6 e Met-5A trasdotte con il vettore terapeutica, eseguita da incubazione nel mezzo con (+) /senza (-) ganciclovir (GCV). (C) un regime di terapia HSVtk /GCV per topi PD. Bar, deviazione standard, P
, P
-value di t di Student
-test tra le cellule in coltura con (+) e senza (-) GCV. (D) l'osservazione microscopica esposto una piccola popolazione di cellule 60As6GFP (fluorescenza verde) impiantati in peritoneo del mouse al giorno 10. (e) numero di topi sopravvissuti dopo la terapia HSVtk /GCV con senso filamento che esprimono vettore (rosso) e con una antisenso -strand esprimendo vettore come riferimento (blu). Il tempo medio di sopravvivenza di ogni gruppo viene mostrato sul lato destro con P
- il valore di Student t-test
tra i due Gruppi in terapia HSVtk /GCV di topi PD occulte
Abbiamo applicato HSVtk /GCV terapia per topi PD. In questo saggio terapeutica, abbiamo preparato due tipi di GSDMB
enhancer-driven vettore lentivirus: un vettore esprime il senso filamento di cDNA HSVtk ed è stato usato per il trattamento di topi PD, mentre l'altro vettore espresso l'antisenso-strand ed è stato usato come controllo. La terapia è stata iniziata sette giorni dopo l'inoculazione intraperitoneale di cellule che esprimono la proteina 60As6 fluorescenza verde (60As6GFP). Questo regime è stato progettato per il trattamento del modello PD occulta in cui le cellule sono state diffusamente 60As6GFP innestate nella cavità peritoneale (Figg. 4c, d). Dopo tre dosi di trattamento, al giorno 36, nessuno dei nove topi trattati con HSVtk senso-vettore di espressione era morto, mentre due dei topi di riferimento nove erano già morti. Nessuno dei topi di riferimento nove erano vivi al giorno 57, vale a dire, otto settimane dopo l'iniezione di cellule 60As6GFP; tuttavia, quattro dei nove topi trattati con vettore terapeutiche erano ancora vivi (Fig. 4e). Questo risultato suggerisce che la terapia può migliorare la prognosi di topi PD occulte.
Discussione
Il GSDMB
enhancer spinge l'espressione genica in cellule di GC
In precedenza abbiamo riportato che GSDMB
si esprime in tutta la GC tessuti e linee cellulari esaminati [14], e in questo studio abbiamo dimostrato che il promotore LTR spinge GSDMB
espressione in 25 su 30 campioni GC (Fig. 1c). L'attività trascrizionale della regione LTR (Fig. 2a) è stato precedentemente dimostrato mediante saggi giornalista in linee cellulari non-GC [20, 21]. Tuttavia, abbiamo trovato una regione distinta con una forte attività trascrizionale nella valle della regione LTR, e lo ha designato come GSDMB
enhancer. Oltre alle due linee cellulari GC, HSC-57 e HSC-59, l'attività trascrizionale di questa regione è stata rilevata mediante saggi giornalista in altre linee cellulari GC, tra MKN74 (relativa attività della luciferasi è stato di circa 1,9), HSC-60 (29.4 ), HSC-42 (2,5) e HSC-44 (4,6), ma non in HSC-58 o MKN28 (dati non mostrati) [14]. Così, il GSDMB
enhancer non guidare l'espressione genica in alcune cellule GC.
Troncamento di una regione si estende 496-562 ha ridotto significativamente l'attività trascrizionale del GSDMB
enhancer (Fig. 2b, 562 a 989). Nella regione 496-562, abbiamo trovato un consenso-siti di legame di diversi fattori di trascrizione, tra cui GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 e NFY-A, e la base di sostituzione in una di queste sequenze di consenso ha fatto non influenza l'attività trascrizionale del enhancer (dati non mostrati). Il fattore di trascrizione che interagisce con il potenziatore e contribuisce alla sua attività trascrizionale non è stato ancora identificato.
Applicazione del lentivirus vettore terapeutico per il trattamento di occulto PD umana
terapia curativa non è stata stabilita per il PD. pazienti GC con PD macroscopico hanno prognosi poveri, con una sopravvivenza globale mediana di 3-6 mesi. Quelli con solo PD microscopica hanno anche una prognosi infausta; il loro tasso di sopravvivenza a 5 anni è 0-18% [28]. Pertanto, è importante rilevare PD occulto mediante esame citologico del liquido di lavaggio peritoneale e completamente eradicare cellule tumorali nella cavità peritoneale. Le meta-analisi di Cabalag et al
. hanno indicato che ampia il lavaggio intraperitoneale (EIPL, fisiologica salina 1 lettiera /dose 10 volte) e intraoperatoria chemioterapia intraperitoneale (IIPC) con cisplatino significativamente migliorato a 5 anni la sopravvivenza globale a oltre il 40% [28]. I risultati del nostro studio suggeriscono che la terapia HSVtk /GCV utilizzando il vettore lentivirus migliora la prognosi di pazienti indipendentemente, e supponiamo che verrà utilizzato come terapia di consolidamento. tumori solidi con crescita diffusa sono composti da molti miofibroblasti e poche navi (ad esempio, diffuso tipo GC, tumori pancreatici e tipo scirrhous di cancro al seno). A seconda delle condizioni del microambiente, come carenza di nutrienti, questi tumori mostrano una elevata prevalenza di cellule tumorali raramente-proliferativi. Così, cellule di GC diffuso tipo diffusi nella cavità peritoneale possono consistere di una popolazione che può resistere l'effetto citotossico del cisplatino. Il vettore lentivirus terapeutica può introdurre HSVtk in entrambe le cellule proliferanti e non proliferanti. Inoltre, il GSDMB
enhancer consente specifica delle cellule espressione GC HSVtk. Questa espressione ristretta riduce al minimo i danni delle cellule mesoteliali, il che implica che la terapia genica può essere eseguita utilizzando dosi sufficientemente elevate per sradicare completamente le cellule GC, anche quelli resistenti al cisplatino, nel PD occulto. E 'probabile che la terapia di combinazione, EIPL e IIPC, seguita da terapia HSVtk /GCV utilizzando il vettore lentivirus, migliorerà la prognosi del PD occulta più significativo rispetto alla EIPL e terapia di combinazione IIPC solo. Noi crediamo che questo regime è degno di essere immessi sulle sperimentazioni cliniche. Anche se sembra che il GSDMB
enhancer non funziona in alcune cellule GC, ulteriori studi volti ad individuare ulteriori esaltatori specifici GC, saranno risolvere questo problema.
Conclusioni
Il GSDMB
-driven HSVtk espressione vettore ha avuto un effetto terapeutico sulle occulte topi modello PD. Questa strategia può potenzialmente essere usato per prevenire i pazienti GC di contrarre PD e anche usato per il trattamento di pazienti con CG PD.
Dichiarazioni
Riconoscimento
Questo studio è stato sostenuto da un Grants-in-Aid per la ricerca scientifica (C .) dalla Società giapponese per la promozione della Scienza (JSPS KAKENHI Concessione numero 23.501.322)
file aggiuntivi
sui file 1: Tabella S1. I dieci set di sonde che mostrano un'espressione specifica per diffondere-tipo di cancro gastrico. file aggiuntivo 2: Figura S1. MYH11
non si esprime in linee cellulari di cancro gastrico. Una regione promotore di entrambi CXCR4
e CXCR7
geni mostra una attività trascrizionale sia 60As6 e le cellule Met-5A. Conflitto di interessi
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.
autori contributi
NS e HS progettato e diretto questo studio. NS eseguito analisi biologiche e gli esperimenti sugli animali con il supporto di RK, FC e KY. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

• cancro gastrico in un ospedale di insegnamento universitario nel nord-ovest della Tanzania: una revisione retrospettiva di 232 casi
• L'impatto della diagnosi di ammissione in svuotamento gastrico in condizioni critiche patients