Un timidina HSV impulsado por el promotor de GSDMB quinasa-vector de expresión para controlar la diseminación peritoneal oculta de cáncer gástrico cells

Un GSDMB Gráficos vectoriales potenciador impulsada por HSV timidina quinasa-expresión para controlar la diseminación peritoneal oculta de células de cáncer gástrico
Resumen
antecedentes
cáncer gástrico (CG) es una de las principales enfermedades malignas en todo el mundo, especialmente en Asia, y Japón y Corea tienen la incidencia más alta en el mundo. Debido a que la mayoría de los casos que son refractarios a las terapias mueren debido a la diseminación peritoneal (PD) de las células cancerosas, el control de la EP es importante para la supervivencia del paciente. GSDMB
es un miembro de la familia de genes gasdermin. Debido GSDMB
se expresa en muchos tipos de cáncer, incluyendo el GC, es probable que el gen contiene una región reguladora que se utiliza para la terapia de la EP oculta través de la expresión específica de la célula del cáncer de genes citotóxicos.
Métodos
Hemos realizado ensayos de reportero para identificar la región reguladora de la expresión específica de las células del cáncer. También se construyó un vector lentiviral que expresa terapéutica del herpes simple timidina quinasa del virus (HSVtk) en una celda de manera específica GC, y lo probó en un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson.
: Resultados de la Identificamos la región reguladora en 496 a 989 de la GSDMB
sitio de inicio de la transcripción y designado como un potenciador GSDMB
. El vector lentiviral terapéutico proliferación suprimida de una línea celular GC, 60As6, in vitro
en presencia de ganciclovir, y administración intraperitoneal del vector prolongó el plazo de supervivencia de ratones que fueron inoculados por vía intraperitoneal con 60As6 una semana antes de la administración. Conclusiones
La Francia El GSDMB
impulsada vector de expresión HSVtk tuvo un efecto terapéutico en los ratones modelo PD ocultas. Esta estrategia puede utilizarse potencialmente para el tratamiento de pacientes con EP GC.
Palabras clave
neoplasias del estómago terapia genética cavidad peritoneal HSV timidina quinasa del fondo
cáncer gástrico (CG) es una de las principales enfermedades malignas, especialmente en Asia, y la segunda causa principal de muertes asociadas con el cáncer en todo el mundo [1]. Por lo general se clasifica en dos tipos (clasificación de Lauren) [2], intestinal y difuso, que se cree para reflejar su patogénesis [3]. El tipo difuso GC (DGC) es sub-clasificarse como mal diferenciada GC (tipo no sólido) o GC no diferenciado en el sistema de clasificación de la Asociación Japonesa del Cáncer Gástrico [4]. DGC es infiltrante y con frecuencia muestra agresiva invasión en la pared gástrica, lo que resulta en la metástasis y la propagación de células de GC en la cavidad peritoneal (diseminación peritoneal, PD). México La GC células diseminadas en la cavidad peritoneal dar lugar a la carcinomatosis peritoneal ( PC) [5]. PC provoca síntomas gastrointestinales, como dolor abdominal, náuseas y vómitos, así como los síntomas sistémicos, tales como pérdida de peso y ascitis. PC no se deteriora solamente fuertemente la calidad de vida de los pacientes de GC, pero también es la causa principal de muerte en GC [6]. Con la atención de apoyo sola, la supervivencia media de los pacientes con PC es de 3-6 meses [7]. Si se trata con quimioterapia sistémica, de la misma manera que para otras lesiones metastásicas, PC muestra una respuesta más pobre a la terapia que otros tipos de metástasis en GC, principalmente debido a la mala distribución del agente quimioterapéutico en la cavidad peritoneal. Por lo tanto, los esfuerzos recientes se han centrado en terapias innovadoras de PC, tales combinación de la cirugía citorreductora, termoterapia y quimioterapia intraperitoneal. Estos enfoques combinados han mejorado ligeramente el pronóstico de los PC, aunque el período de supervivencia media es todavía inferior a 12 meses, por lo que es evidente que hay un límite práctico a la eficacia de la citorreducción quirúrgica [8, 9]. Estudios recientes sugieren que es importante identificar a los pacientes GC con EP oculta mediante la realización de un examen citológico del líquido de lavado peritoneal, ante estos casos mostraron un mejor pronóstico si obtuvieron la conversión a la citología negativa por una amplia lavado peritoneal intraoperatorio seguida de quimioterapia intraperitoneal [10]. Francia El concepto de la terapia del cáncer "gen suicida", usando herpes simple timidina quinasa del virus (HSVtk), surgió en la década de 1980 [11]. HSVtk cataliza la fosforilación de la ganciclovir análogo de guanosina (GCV) en una forma monofosfato que posteriormente es fosforilado por quinasas celulares de nucleótidos en trifosfato de ganciclovir altamente tóxico [12]. bloques Ganciclovir trifosfato la replicación del ADN, lo que lleva a la detención del ciclo celular y la muerte celular [13]. Terapia que implica la transferencia HSVtk en células cancerosas, seguido de la administración de GCV, se conoce como terapia de gen suicida, y esta técnica se ha utilizado recientemente en un ensayo clínico de fase III sobre el glioblastoma multiforme [12].
En este estudio, hemos desarrollado un producto terapéutico vector que expresa HSVtk en células de cáncer, utilizando una región reguladora del gen gasdermin B (GSDMB
). GSDMB
es un miembro de la familia gasdermin (GSDM
) que consiste en cuatro genes, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC
y GSDMD
[14, 15], y es expresado en la proliferación de células de epitelio normal y también en muchos tipos de cáncer, incluyendo esofágico, gástrico, hígado, colon, cuello uterino y los cánceres de mama [14, 16-18]. GSDMB
expresión es impulsada por dos promotores, el promotor celular y promotor derivado-LTR [19-21]. El promotor derivado-LTR (promotor LTR) es activo en la mayoría de los tejidos normales, excepto el estómago, y en muchas líneas celulares de cáncer, mientras que el promotor celular está activa en el tejido de estómago normal y en algunas líneas celulares de cáncer [20]. En este estudio, hemos identificado una región en la corriente abajo del promotor de LTR, que mostró una fuerte actividad transcripcional en líneas celulares de GC. Utilizamos esta región para construir un vector viral HSVtk-expresión para controlar PD oculta.
Métodos
tejidos humanos
cáncer gástrico (CG) tejidos fueron proporcionados por el National Cancer Center Hospital después de obtener el consentimiento informado por escrito de cada paciente, el cual fue aprobado por el Comité Nacional de Revisión Institucional del Centro del cáncer (ID: No.17-030). Las muestras de tejido se congelaron inmediatamente con nitrógeno líquido después de la extracción quirúrgica, y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Se aisló el análisis de microarrays
ARN total mediante la suspensión de las células en tampón de lisis ISOGEN (Nippon Gene, Toyama, Japón) seguido de precipitación con isopropanol. Se realizó el análisis de expresión utilizando matriz de la expresión humana U95A versión 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA) de acuerdo con los protocolos de los proveedores. El valor de la expresión (diferencia media: AD) de cada gen se calculó utilizando el software GeneChip Analysis Suite versión 4.0 (Affymetrix). La agrupación jerárquica de los microarrays de datos se realizó mediante GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), Microsoft Excel y Cluster & TreeView [22, 23]. Todos los datos de microarrays se han depositado en una base de datos compatible con MIAME, GEO (número de acceso; GSE47007). Por Wilcoxon u
-test (p Hotel < 0,05) y mostrando un cambio de 2 veces, los genes expresados ​​específicamente en de tipo difuso GC fueron seleccionados [22] Las líneas celulares
y cultivo primario de ratón. las células mesoteliales
Tres líneas celulares de cáncer gástrico, HSC-57, derivados de tipo intestinal GC, y HSC-59 y HSC-60, ambos derivados de tipo difuso GC, se establecieron y se caracterizan por uno de los autores [24 ]. SNU16, derivado de tipo difuso GC, fue proporcionado por la American Type Culture Collection (ATCC), otras dos líneas celulares con la eficiencia en la producción de ratones PD, 60As6 y 60As6GFP (60As6 que expresa la proteína de fluorescencia verde), fueron establecidos por los autores de la difusa de tipo GC deriva HSC-60 línea celular después de varios pasajes del trasplante intraperitoneal a ratones [25]. CC-2511, una línea celular de fibroblastos, se adquirió de Lonza, Japón (Tokyo, Japón). Todas las líneas celulares se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle. células mesoteliales de ratón se recogieron por inyección de 10 ml de solución /EDTA 0,25% de tripsina calentado en la cavidad peritoneal [26]. Las células se incubaron durante 3 días en medio RPMI-1640 suplementado con L-glutamina, rojo de fenol y HEPES (WAKO, Tokio, Japón). Met-5A, una línea de células mesoteliales humana, fue proporcionado por la ATCC y se mantuvieron en medio 199 (Life Technologies, Tokio, Japón) suplementado con 3,3 nM de EGF (Life Technologies), 400 nM hidrocortisona (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO EE.UU.), 870 nM de insulina (Life Technologies) y 10% de FBS.
RT-PCR
total ARN de órganos normales humanos se adquirieron de BioChain, Hayward, CA. ARN totales se extrajeron usando un kit RNeasy Mini (QIAGEN, Tokio, Japón). Después de generar cDNA de primera cadena a partir de ARN total usando ThermoScript RT-PCR System (Life Technologies, Tokio, Japón), la PCR se realizó con AccuPrime Pfx ™
ADN polimerasa (Life Technologies) en las siguientes condiciones de ciclación de cualquiera de 35 (transcripciones LTR ) o 25 ciclos (otros): 95 ° C durante 1 min; 56 ° C (β-actina) o 58 ° C (otros) durante 1 min; y 72 ° C durante 1 min. Se utilizaron los siguientes conjuntos de cebadores: para celular promotor de transcripción, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'y 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; para LTR transcripciones promotor derivado, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'y 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; para el "lado de GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3 'y 5'-3 ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3'; para MYH11
, 5'-CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'y 5'-CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; y para la β-actina
, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'y 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3'.
Ensayo Reportero
Un fragmento genómico, -1080 a 1.053 de GSDMB
y que contiene el promotor LTR, se amplificó por PCR utilizando ADN Hot Start lA Taq polimerasa (Takara) en 35 ciclos de 96 ° C durante 30 s y 68 ° C durante 2 min, utilizando conjuntos de cebadores: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'y 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', y se inserta en un vector básico pGL3 (Promega, Madison, WI). Se trunca el uso de los sitios de restricción Nhe:
I I I y Eco
para generar el fragmento de -1.035 a 1053; Kpn
y Eco RI para
-426-1053; Nhe
I y Afl II
de -61 a 1053; Nhe I y Eco

81 I de 129 a 1.053; y Nhe I y Stu

yo por 496-1053. El constructo 496-1053 reportero fue más truncado con enzimas de restricción: Nhe I y Swa

I de 757 a 1.053; Nhe
I y Pvu II
de 860 a 1.053; Nhe I y Bst

X I de 989 a 1.053; Xho I y Bst

X yo por 496-989; Xho
I y Pvu II para
496-860; y Xho I y Swa

yo por 496-757. Para más truncamiento del fragmento de 496 a 989, se realizó una PCR con el fragmento como plantilla usando la ADN polimerasa Ex Taq (Takara) en 35 ciclos de 95 ° C durante 1 min, 58 ° C durante 1 min, y 72 ° C durante 1 min, usando los siguientes conjuntos de cebadores: de 562 a 989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'y 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; y para 649-989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'y 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Después de la amplificación, los fragmentos se insertaron en pGL4.12 vector [luc2CP
] (Promega). Los -1 kb regiones aguas arriba de CXCR4 Opiniones y CXCR7
fueron preparados por PCR utilizando ADN genómico MightyAmp polimerasa (Takara) en 35 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 62ºC durante 15 s, y 68 ° C durante 2 min, usando los siguientes conjuntos de cebadores: para CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'y 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; y para CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'y 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Estos fragmentos se insertaron en el [luc2CP
] vector pGL4.12. Un microgramo de cada construcción y el reportero de control de luciferasa Renilla vector (pRL-SV40 vector, Promega) fueron co-transfectadas en 1 × 10 5 células utilizando el reactivo de transfección SuperFect (QIAGEN). El ensayo de luciferasa se realizó 24 h después de la introducción reportero, usando un sistema de doble ensayo de luciferasa Reporter (Promega). El ensayo se llevó a cabo por triplicado.
GSDMB
potenciador-HSVtk vector lentiviral
Un vector pMFG-HSVtk fue proporcionado por RIKEN BRC a través del Proyecto Nacional de Recursos Bio-del MEXT, Japón, por cortesía del Dr. . Hirofumi Hamada, y un ADNc HSVtk se escindió de ella como un Nco
I-Bam HI fragmento
. Para construir el vector lentivirus GSDMB
potenciador-HSVtk, primero el fragmento 496-989 (GSDMB
potenciador) se insertó en pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) entre Nhe
I y Hind
III sitios, y luego HSVtk ADNc se insertó en el vector en un sitio Bam HI
en el delantero (para la expresión cadena sentido) o la marcha atrás (para la expresión antisentido de hebra) dirección. A continuación, GSDMB
sentido potenciador-HSVtk y GSDMB
fragmentos antisentido potenciador-HSVtk fueron extirpados de los vectores plásmidos como Nhe I-
No
I fragmentos y se insertan en pLVSIN-CMV vectores neo entre el Xba
I y Not I
sitios. Por último, un promotor de CMV fue retirado de los constructos de lentivirus. Para generar partículas virales que contienen los vectores, los constructos se introdujeron en Lenti-X ™ 293 células T (Takara) usando Lenti-X Sistema HTX ™ Packaging (Takara). Después de 72 H'-incubación, se recogió el medio y el título viral (ufc /ml) se determinó mediante la transducción en células HT-1080 en presencia de polibreno (5 mg /ml en medio de cultivo, Sigma-Aldrich). Las partículas se aplicaron a Met-5A y 60As6 (1 × 10 5 células por placa, por triplicado) in vitro
en presencia de polibreno (5 mg /ml), y las células se incubaron en medio que contenía Gancicrovir (GCV, 5 mg /ml, WAKO) durante 5 días para ensayos de crecimiento celular. Los ensayos se realizaron por triplicado y P-valor
de la t de Student-test
entre las células cultivadas con (+) y sin (-) GCV se calculó
El tratamiento de PD modelo de ratón con GSDMB vectores potenciador HSVtK
Hemos informado anteriormente de un modelo PD ratón (ratones PD) que fue producido por la inyección intraperitoneal de células 60As6 [25]. 60As6GFP células (1 × 10 6 células por ratón) se inyectaron en la cavidad peritoneal de 18 ratones (ratones 6 semanas de edad, de CB17 /ICR-Prkdc < scid > /CrlCrlj Genotipo: scid /scid, Charles River, Yokohama Japón) a día 1. Los ratones se dividieron en dos grupos; un grupo fue inyectado con el vector de expresión antisentido, y el otro grupo se inyectó con el vector de sentido; ambos grupos luego se inyectaron por vía intraperitoneal con 2 ml de solución de PBS que contiene partícula viral (5 × 10 5 ufc) y ganciclovir (2 mg) en 8, 10 y 12 días. Se calcularon el tiempo medio de supervivencia de cada grupo y el P-valor de
de t-test Student
entre los dos grupos. El estudio fue aprobado por el Comité Nacional del Centro del Cáncer en experimentos con animales.
Resultados
Identificación de una región potenciadora en GSDMB
, que dirige la expresión de genes en células de GC
Para identificar las regiones promotoras /potenciadoras que sería eficaz en el desarrollo de un vector terapéutico para la diseminación peritoneal (PD), que primero realizaron búsquedas de los genes expresados ​​con más frecuencia en de tipo difuso GC que en tipo intestinal GC utilizando el análisis de la expresión génica comparativa entre 12 difusas tipos primarios y 18 intestinal -Tipos, porque PD se observa con mayor frecuencia en de tipo difuso GC que en el tipo intestinal [22]. Nos dimos cuenta de que cuatro de diez conjuntos de sondas de Affymetrix GeneChip muestra el mayor factor de cambio para la expresión génica en el tipo difuso GC en comparación con el de tipo intestinal fueron sonda fija para MYH11 gratis (miosina, cadena pesada de 11, gen del músculo liso, la disposición 1: Tabla S1). Después de confirmar que el gen no se expresa en la línea celular humana inmortalizada mesotelial Met-5A (datos no mostrados), se seleccionaron MYH11
como un fuerte candidato para el gen cuyo promotor permite de tipo difuso GC expresión específica de HSVtk. Sin embargo, el gen no se expresa en las células 60As6 que fueron utilizados para la fabricación de ratones modelo de PD (archivo adicional 2: Figura S1). Es probable que MYH11
se expresa en fibroblastos asociados con el cáncer que son especialmente abundantes en los tejidos de GC de tipo difuso. A continuación, salir del análisis de datos de microarrays, hemos cambiado nuestra atención a las regiones aguas arriba de CXCR4 gratis (quimiocina (motivo CXC) receptor de 4 genes) y CXCR7 gratis (quimiocina (motivo CXC) del receptor 7 de genes), ya que ambos se expresan en muchos tipos de cáncer y tienen un papel importante en la metástasis [27]. Sin embargo, el uso de los ensayos de reportero, se encontró que las regiones aguas arriba de estos genes son transcripcionalmente activo tanto en el Met-5A y las células 60As6 (archivo adicional 2: Figura S2), lo que implica que las regiones impulsan la expresión de HSVtk en las células mesoteliales humanos
in vivo. Por último, nos centramos en la GSDMB
gen, como nuestro estudio anterior indicó que se expresa fuertemente en los tejidos GC y líneas celulares [14].
GSDMB
se transcribe por dos promotores, celulares y promotores de LTR ( Fig. 1a), y el último se utiliza principalmente en los tejidos normales y en líneas celulares de cáncer [19-21]. Se confirmó estos resultados mediante la realización de análisis de RT-PCR de ARN a partir de varios tipos de tejidos normales (Fig. 1B). RT-PCR en muestras quirúrgicas GC demostró que el promotor de LTR se utilizó en 14 de 15 de tipo intestinal GCs y en 11 de los 15 GCs de tipo difuso (Fig. 1c). Higo. 1 GSDMB
gen se transcribe por los promotores celulares y LTR. (A) una ilustración esquemática de los dos promotores. (B) Expresión de dos transcripciones, uno por promotor celular y el otro por LTR, en los tejidos normales humanos (RT-PCR). Cuatro variantes de transcripción GSDMB humana están registradas en GenBank; variante 1 (NM_001042471), variante 2 (NM_018530), variante 3 (NM_001165958) y la variante 4 (NM_001165959). La transcripción de las variantes 1, 3 y 4 es impulsada por el promotor celular y la de la variante 2 es por el promotor LTR. El lado 3 'de la GSDMB
transcripciones es común a cada uno. (C) Expresión de las transcripciones LTR en los tejidos de cáncer gástrico, intestinal 15 de tipo y 15 muestras de tipo difuso (RT-PCR en muestras quirúrgicas)
Para identificar una región crítica para la actividad transcripcional en las células de GC, un fragmento de ADN que abarca -1080 a 1053 pb, la posición de un sitio de inicio de transcripción para el promotor LTR, fue aislado (Fig. 2a). Los ensayos de reportero en fragmentos de ADN truncados utilizando dos líneas celulares de GC, HSC-57 y HSC-59, se indica que una región 496 a 989 tenía una fuerte actividad transcripcional, incluso más fuerte que la del original -1,080-1053 fragmento, y que más truncamiento del fragmento de 496 a 989 resultó en una reducción significativa de la actividad transcripcional (Fig. 2b). La región correspondiente a este fragmento con una fuerte actividad transcripcional fue nombrado GSDMB
potenciador. Higo. 2 Identificación de GSDMB
potenciador. (A) Una ilustración esquemática que muestra constructos indicadores utilizados en los ensayos de luciferasa. elemento de repetición terminal larga (LTR) de retrovirus endógeno humano se muestra mediante una flecha de dos puntas. La posición es desde el sitio de inicio de la transcripción de la transcripción del promotor LTR. (B) ensayos de luciferasa utilizando dos líneas celulares de cáncer gástrico, HSC-57 y HSC-59, revelaron una región con una fuerte actividad transcripcional, que abarca desde 496 hasta 989, que fue designado como GSDMB
potenciador. Vector, vacío vector indicador, Bar, desviación estándar
Construcción de un promotor de GSDMB
impulsada HSVtk vector lentiviral
Hemos informado anteriormente de un modelo de ratón PD (PD ratones) que fue producido por la inyección intraperitoneal de células 60As6 [ ,,,0],25]; En este estudio, hemos desarrollado un vector viral terapéutica para el tratamiento de los ratones con EP. Para examinar la resistencia de la actividad transcripcional del promotor de GSDMB
en 60As6, se realizaron ensayos de reportero, utilizando la construcción informadora de las regiones aguas arriba de CXCR4 Opiniones y CXCR7
para la comparación. El promotor de GSDMB
mostró actividad transcripcional más fuerte en las células 60As6 que el CXCR4 o el
cxcr7
regiones aguas arriba, y, sobre todo, la GSDMB
potenciador de la actividad transcripcional tenía muy débil en las células mesoteliales peritoneales de ratón y en Met-5A, una línea de células mesoteliales humana (Fig. 3). Este resultado sugiere que el promotor de GSDMB
permite la expresión HSVtk casi exclusivamente en 60As6 pero no en células mesoteliales de la cavidad peritoneal de los ratones con EP, y probablemente no en mesotelio peritoneal humano. Higo. 3 GSDMB
potenciador tiene actividad transcripcional fuerte en una línea celular 60As6. Los ensayos de luciferasa con tres tipos de células: células cultivadas 60As6 que fueron utilizados para la fabricación de ratones modelo de diseminación peritoneal (PD) en este estudio, las células de cultivo primario de células mesoteliales peritoneales de ratón y la línea celular humana establecida mesotherial Met-5A. Bar, desviación estándar
A continuación, se examinó el efecto de la terapia HSVtk /GCV usando el promotor de GSDMB
impulsada HSVtk vector lentiviral en 60As6 in vitro gratis (Fig. 4a). El número de células 60As6 transducidas con el vector lentivirus se redujo significativamente cuando se incubaron en medio suplementado con GCV; Por otro lado, el mismo tratamiento HSVtk /GCV no tuvo efecto sobre el número de células de Met-5A (Fig. 4b). Higo. 4 terapia HSVtk /GCV utilizando el GSDMB
vector lentiviral potenciador mejorado y conducido a la tasa de supervivencia de los ratones con EP. (A) Un vector lentiviral terapéutico para GSDMB
potenciador (ENH) expresión impulsada de herpes simplex timidina quinasa del virus (HSVtk). (B) ensayos de proliferación celular en 60As6 y Met-5A transducidas con el vector terapéutico, realizada por la incubación en el medio con (+) /sin (-) ganciclovir (GCV). (C) un régimen de terapia HSVtk /GCV para los ratones con EP. Bar, desviación estándar, P
, P
-valor de t-test de Student
entre las células cultivadas con (+) y sin (-) GCV. (D) La observación microscópica mostró una pequeña población de células 60As6GFP (fluorescencia verde) implantados en el peritoneo del ratón en el día 10. (e) Número de ratones sobrevivieron después de la terapia HSVtk /GCV con el sentido de hebra expresando vector (rojo) y con un antisentido beta diana que expresan vector como referencia (azul). El tiempo medio de supervivencia de cada grupo se muestra en el lado derecho con P CD - valor del Estudiante de t-test
entre los dos Grupos en la terapia HSVtk /GCV de los ratones con EP ocultas
Aplicamos HSVtk /GCV La terapia a ratones con EP. En este ensayo terapéutico, preparamos dos tipos de la GSDMB
vector lentivirus potenciador impulsada por: un vector expresa el sentido de hebra de cDNA HSVtk y se utilizó para el tratamiento de los ratones con EP, mientras que el otro vector expresa el antisentido de hebra y fue utilizado como el control. La terapia se inició siete días después de la inoculación intraperitoneal de células que expresan 60As6 proteína de fluorescencia verde (60As6GFP). Este régimen se diseña para el tratamiento de PD modelo oculto en el cual las células fueron arraigado 60As6GFP difusamente en la cavidad peritoneal (Figs. 4c, d). Después de tres dosis de tratamiento, en el día 36, ​​ninguno de los nueve ratones tratados con HSVtk vector sentido-expresión había muerto, mientras que dos de los ratones de referencia de nueve ya habían muerto. Ninguno de los ratones de referencia de nueve estaban vivos en el día 57, es decir, ocho semanas después de la inyección de las células 60As6GFP; Sin embargo, cuatro de los nueve ratones tratados con el vector terapéuticas todavía estaban vivos (Fig. 4e). Este resultado sugiere que la terapia puede mejorar el pronóstico de los ratones con EP ocultas.
Discusión Francia El GSDMB
potenciador conduce la expresión génica en células de GC
Anteriormente se informó de que GSDMB
se expresa en todos los GC tejidos y líneas celulares examinadas [14], y en este estudio hemos demostrado que el promotor LTR impulsa GSDMB
expresión en 25 de 30 muestras de GC (Fig. 1C). La actividad transcripcional de la región LTR (Fig. 2a) se demostró previamente por ensayos de reportero en líneas de células no-GC [20, 21]. Sin embargo, encontramos una región distinta, con una fuerte actividad transcripcional en la corriente abajo de la región LTR, y designó como GSDMB
potenciador. Además de las dos líneas celulares de GC, HSC-57 y HSC-59, la actividad transcripcional de esta región se detectó mediante ensayos de reportero en otras líneas celulares de GC, incluyendo MKN74 (actividad de luciferasa relativa fue de aproximadamente 1,9), HSC-60 (29,4 ), HSC-42 (2,5) y HSC-44 (4,6), pero no en HSC-58 o MKN28 (datos no mostrados) [14]. Por lo tanto, la GSDMB
potenciador no conduce la expresión génica en algunas células de GC.
Truncamiento de una región que abarca desde 496 hasta 562 redujo significativamente la actividad transcripcional del promotor de GSDMB
(Fig. 2b, 562 a 989). En la región de 496 a 562, encontramos consenso sitios de unión de varios factores de transcripción, incluyendo GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 y NFY-A, y la base de sustitución en cualquiera de estas secuencias de consenso hizo no afecta a la actividad transcripcional del promotor de (datos no mostrados). El factor de transcripción que interactúa con el potenciador y contribuye a su actividad transcripcional aún no ha sido identificado.
Aplicación del vector lentivirus terapéutica para el tratamiento de PD humana oculta
terapia curativa no se ha establecido para la EP. GC pacientes con EP macroscópica tienen peor pronóstico, con una supervivencia global media de 3-6 meses. Los que sólo tienen PD microscópica también tienen un mal pronóstico; su tasa de supervivencia a 5 años es de 0-18% [28]. Por lo tanto, es importante para detectar PD oculta por examen citológico de fluido de lavado peritoneal y completamente erradicar las células cancerosas en la cavidad peritoneal. Los meta-análisis por Cabalag et al
. indicaron que la extensa lavado intraperitoneal (EIPL, solución salina fisiológica 1 litro /dosis, 10 veces) y quimioterapia intraperitoneal intraoperatoria (IIPC) con cisplatino mejoraron significativamente la supervivencia global a los 5 años a más del 40% [28]. Los resultados de nuestro estudio sugieren que la terapia de HSVtk /GCV usando el vector de lentivirus mejora el pronóstico de los pacientes de forma independiente, y que asuma que se puede utilizar como un tratamiento de consolidación. Los tumores sólidos con crecimiento difuso se componen de muchas miofibroblastos y pocos vasos (por ejemplo, de tipo difuso GCs, cánceres pancreáticos y tipo escirro de cáncer de mama). Dependiendo de las condiciones del microentorno, tales como la deficiencia de nutrientes, estos tumores muestran una alta prevalencia de células tumorales raramente-proliferativas. Así, las células de GC de tipo difuso difundidos en la cavidad peritoneal pueden consistir en una población que puede resistir el efecto citotóxico de cisplatino. El vector terapéutico lentivirus puede introducir HSVtk en ambas células en proliferación y no proliferantes. Por otra parte, la GSDMB
potenciador permite la expresión HSVtk células específicas de GC. Esta expresión restringida minimiza el daño de células mesoteliales, lo que implica que la terapia génica puede realizarse utilizando dosis suficientemente altas para erradicar completamente las células de GC, incluso aquellos que son resistentes a cisplatino, en la EP oculto. Es probable que la terapia de combinación, EIPL y IIPC, seguida de terapia HSVtk /GCV usando el vector de lentivirus, mejorará el pronóstico de PD oculta más significativa que la EIPL y la terapia de combinación IIPC solo. Creemos que este régimen es digno de ser colocado en los ensayos clínicos. Aunque parece que el promotor de GSDMB
no funciona en algunas células de GC, nuevos estudios destinados a identificar los potenciadores adicionales GC-específica, resolverán este problema.
Conclusiones Francia El GSDMB
impulsada por la expresión HSVtk vector tenía un efecto terapéutico en los ratones modelo PD ocultas. Esta estrategia puede ser potencialmente y usados ​​para evitar que los pacientes contraigan GC PD y también se utiliza para tratar a pacientes con EP GC. Declaraciones
Reconocimiento
Este estudio fue apoyado por unas subvenciones-en-Ayudas a la Investigación Científica (C .) por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP KAKENHI la subvención Número 23501322) guía archivos adicionales
archivo adicional 1: Tabla S1. Las diez mejores conjuntos de sondas que muestran expresión específica para el cáncer gástrico difuso de tipo. la disposición 2: Figura S1. MYH11
no se expresa en líneas celulares de cáncer gástrico. Una región promotora de ambos CXCR4 y
cxcr7
genes muestra una actividad transcripcional en tanto 60As6 y células Met-5A. Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
autores NS y HS diseñadas y dirigidas este estudio. NS realizado los análisis biológicos y los experimentos con animales con el apoyo por RK, FC y KY. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

• El cáncer gástrico en un hospital universitario en el noroeste de Tanzania: una revisión retrospectiva de 232 casos
• El impacto del diagnóstico de ingreso en el vaciado gástrico en pacientes críticamente enfermos