Ein GSDMB Enhancer-driven HSV-Thymidin-Kinase-Expressionsvektor für okkulte Peritonealdialyse Verbreitung von Magenkrebs cells

A GSDMB
Enhancer-driven HSV-Thymidinkinase-exprimierenden Vektor Steuerung okkulten Peritonealdialyse Verbreitung von Magenkrebszellen
Zusammenfassung
zur Steuerung hintergrund und Magenkrebs (GC) ist eine der wichtigsten bösartigen Erkrankungen weltweit, vor allem in Asien und Japan und Korea haben die höchste Inzidenz in der Welt. Da die meisten der Fälle, die auf Therapien refraktär sind aufgrund peritoneal Verbreitung (PD) der Krebszellen sterben, PD Steuerung ist wichtig für das Überleben der Patienten. GSDMB
ist ein Mitglied der gasdermin Genfamilie. Weil GSDMB
in vielen Krebsarten exprimiert wird, einschließlich GC, ist es wahrscheinlich, dass das Gen eine regulatorische Region enthält, die für die Therapie von okkultem PD durch krebszellspezifische Expression von zytotoxischen Genen verwendet wird.
Methods
Wir führten Reporter Assays, die die regulatorische Region für die Krebszell-spezifische Expression zu identifizieren. Wir konstruierten auch ein lentiviraler therapeutischen Vektor, der Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (HSVtk) in einer GC zellspezifischen Weise exprimiert und getestet in einem Mausmodell der PD.
Ergebnisse
wir die regulatorische Region auf +496 identifiziert bis 989 von der Transkriptionsstartstelle
GSDMB und als GSDMB
Enhancer bezeichnet. Die lentiviralen therapeutische Vektor unterdrückt Proliferation einer GC-Zelllinie, 60As6, in vitro
in Gegenwart von Ganciclovir und intraperitoneale Verabreichung des Vektors verlängerte die Überlebensdauer-Mäuse, die intraperitoneal mit 60As6 einer Woche zur Verabreichung vor inokuliert wurden.
Schlussfolgerungen
der GSDMB
-driven HSVtk Expressionsvektor eine therapeutische Wirkung auf den okkulten PD-Modell Mäuse hatten. Diese Strategie kann möglicherweise verwendet werden, um GC Patienten mit PD behandeln.
Schlüsselwörter Magentumoren Peritonealhöhle Genetische Therapie HSV-Thymidin-Kinase-hintergrund und Magenkrebs (GC) eine der wichtigsten bösartigen Erkrankungen, vor allem in Asien, und die zweithäufigste Ursache von Krebs-assoziierten Todesfälle weltweit [1]. Es wird in der Regel in zwei Typen (Lauren-Klassifikation) eingestuft [2], Darm- und diffuse, die ihre Pathogenese sind gedacht zu reflektieren [3]. Der diffuse Typ GC (DGC) ist-sub klassifiziert als schlecht differenzierten GC (nicht festen Typ) oder undifferenzierte GC in der japanischen Gastric Cancer Association Klassifikationssystem [4]. DGC ist infiltrative und zeigt oft aggressive Invasion in die Magenwand, bei der Metastasierung und die Ausbreitung von GC-Zellen in die Bauchhöhle resultierenden (Peritonealdialyse Verbreitung, PD). Die disseminierte GC-Zellen in der Bauchhöhle
verursachen Peritonealkarzinose ( PC) [5]. PC verursacht Magen-Darm-Symptome, wie Bauchschmerzen, Übelkeit und Erbrechen, sowie systemische Symptome wie Gewichtsverlust und Aszites. PC verschlechtert nicht nur stark die Lebensqualität von Patienten, GC, aber es ist auch die häufigste Todesursache in GC [6]. Mit unterstützende Pflege die mediane Überlebenszeit von Patienten mit PC allein, ist 3-6 Monate [7]. Wenn mit systemischer Chemotherapie behandelt werden, in der gleichen Weise wie für andere metastatischen Läsionen, PC zeigt eine schlechtere Reaktion auf die Therapie als andere Arten von Metastasierung in GC, hauptsächlich wegen der schlechten Verteilung des chemotherapeutischen Mittels in der Bauchhöhle. Aus diesem Grund haben die jüngsten Bemühungen auf innovative PC Therapeutika konzentriert, wie von onkologischer Chirurgie kombiniert, Wärmetherapie und intraperitoneale Chemotherapie. Diese kombinierten Ansätze leicht die Prognose von PC verbessert, auch wenn die mittlere Überlebenszeit ist immer noch weniger als 12 Monate, so dass es klar, dass es eine praktische Grenze für die Wirksamkeit der chirurgischen Zytoreduktion [8, 9]. Neuere Studien legen nahe, dass es wichtig ist, GC Patienten mit okkultem PD zu identifizieren, indem eine zytologische Untersuchung der peritonealen Spülflüssigkeit durchgeführt wird, weil solche Fälle verbesserte Prognose zeigten, wenn sie Umwandlung in negativer Zytologie durch extensive intra Peritoneallavage durch intraperitoneale Chemotherapie [10] folgt erhalten.
das Konzept der "Selbstmord-Gen" Krebstherapie, Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (HSVtk) unter Verwendung von in den 1980er Jahren entstanden [11]. HSVtk katalysiert die Phosphorylierung des Guanosin analogen Ganciclovir (GCV) in eine Monophosphats, das anschließend durch zelluläre Kinasen Nucleotid in hochgiftige Ganciclovir-Triphosphat phosphoryliert werden [12]. Ganciclovirtriphosphat blockiert die DNA-Replikation, was zu Zellzyklusarrest und Zelltod [13]. Therapie HSVtk Transfer in Krebszellen beteiligt, durch GCV Verwaltung gefolgt, als Suizid-Gentherapie bekannt ist, und diese Technik vor kurzem wurde in einer klinischen Phase-III-Studie an Glioblastom verwendet [12].
In dieser Studie entwickelten wir eine therapeutische Vektor, der HSVtk in Krebszellen, unter Verwendung einer regulatorischen Region des gasdermin B-Gens (GSDMB
) drückt. GSDMB
Mitglied des gasdermin ist (GSDM
) Familie, die aus vier Genen besteht, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC
und GSDMD
[14, 15], und ist in proliferierenden Zellen von normalem Epithel und auch in vielen Arten von Krebs, einschließlich Speiseröhren-, Magen-, Leber-, Kolon-, Gebärmutterhals und Mammakarzinomen exprimiert [14, 16-18]. GSDMB
Ausdruck wird von zwei Promotoren gesteuert, die zelluläre Promotor und LTR-Promotor abgeleitet [19-21]. Der LTR-abgeleitete Promotor (LTR-Promotor) ist in den meisten normalen Geweben, mit Ausnahme des Magens und in vielen Krebszelllinien, während die zelluläre Promotor aktiv in normalem Magengewebe und in einigen Krebszelllinien [20]. In dieser Studie identifizierten wir eine Region in stromabwärts des LTR-Promotor, die starke transkriptionale Aktivität in GC-Zellinien zeigten. Wir nutzten diese Region einen HSVtk-Ausdruck viralen Vektor zur Steuerung okkulten PD zu konstruieren.
Methoden
Menschliche Gewebe
Magenkrebs (GC) Gewebe durch das National Cancer Center Hospital zur Verfügung gestellt wurden, nachdem sie von jeder schriftliche Einverständniserklärung zu erhalten Patienten, die von der National Cancer Center Institutional Review Board (ID: No.17-030) genehmigt wurde. Gewebeproben wurden sofort mit flüssigem Stickstoff nach der chirurgischen Extraktion eingefroren und gelagert bei -80 ° C bis zur Verwendung.
Gesamt RNA
Microarray-Analyse wurde isoliert, indem die Zellen in ISOGEN Lysepuffer suspendiert (Nippon Gene, Toyama, Japan) gefolgt von Fällung mit Isopropanol. Wir führten Expressionsanalysen nach menschlichen Ausdruck Array U95A Version 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA) mit zu der Lieferanten-Protokolle. Der Ausdruck Wert (mittlere Differenz: AD) jedes Gen wurde mit Version GenChip Analysis Suite 4.0 Software (Affymetrix) berechnet. Hierarchical Clustering von Microarray-Daten wurde mit Genespring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), Microsoft Excel und Cluster & TreeView [22, 23]. Alle Microarray-Daten wurden in einer MIAME kompatiblen Datenbank, GEO (Zugangsnummer; GSE47007) hinterlegt. Mit dem Wilcoxon u
-test (p
< 0,05) und durch eine 2-fache Veränderung zeigt, spezifisch exprimierten Gene in diffusen Typ GC wurden ausgewählt [22]
Zelllinien und Primärkultur der Maus. Mesothelzellen
Drei Magenkrebszelllinien, HSC-57, abgeleitet vom Darm-Typ GC und HSC-59 und HSC-60, abgeleitet sowohl aus diffusen Typ GC wurden gegründet und wird von einem der Autoren gekennzeichnet [24 ]. SNU16, abgeleitet aus diffusen Typ GC, wurde von der American Type Culture Collection (ATCC) zur Verfügung gestellt, zwei weitere Zelllinien mit Effizienz in PD-Mäuse produzieren, 60As6 und 60As6GFP (60As6 grüne Fluoreszenz-Protein exprimieren), die von den Autoren von den etablierten wurden diffuse-Typ GC abgeleitet HSC-60-Zelllinie nach mehreren Passagen von intraperitoneale Transplantation bei Mäusen [25]. CC-2511, ein Fibroblasten-Zelllinie wurde von Lonza, Japan (Tokio, Japan) erworben. Alle Zellinien wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium gehalten. Maus-Mesothelzellen wurden durch Injektion von 10 ml erwärmt 0,25% Trypsin /EDTA-Lösung in die Bauchhöhle [26] geerntet. Die Zellen wurden 3 Tage lang in RPMI-1640 mit L-Glutamin, Phenolrot und HEPES (WAKO, Tokyo, Japan) ergänzt, inkubiert. Met-5A, eine menschliche Mesothelzellen Zelllinie wurde von ATCC und gepflegt in Medium 199 (Life Technologies, Tokyo, Japan) zur Verfügung gestellt, ergänzt mit 3,3 nM EGF (Life Technologies), 400 nM Hydrocortison (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA), 870 nM Insulin (Life Technologies) und 10% FBS.
RT-PCR
Gesamt-RNAs aus menschlichen normalen Organen wurden aus BioChain, Hayward, CA gekauft Gesamt-RNAs wurden unter Verwendung eines RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Tokyo, Japan) extrahiert. cDNA des ersten Stranges von Gesamt-RNA unter Verwendung von thermo RT-PCR-System (Life Technologies, Tokyo Japan), PCR wurde mit AccuPrime ™ Pfx
DNA-Polymerase (Life Technologies) unter folgenden Zyklusbedingungen entweder 35 (LTR-Transkripte Nach der Erzeugung durchgeführt ) oder 25 Zyklen (andere): 95 ° C für 1 min; 56 ° C (β-Actin) bzw. 58 ° C (andere) für 1 min; und 72 ° C für 1 min. Die folgenden Primer-Sets wurden verwendet: für die zelluläre Promotor-Transkript, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'und 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; für LTR-Promotor-abgeleitete Transkripte, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'und 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; für die "Seite des GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3 '3 und 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3'; für MYH11
, 5 'CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3' und 5 'CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; und für β-Actin
, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'und 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3'.
Reporter Assay
Ein genomische Fragment, -1.080-1053 von GSDMB
und enthält unter Verwendung von LA Taq Hot Start DNA Polymerase (Takara) in 35 Zyklen von 96 ° C für 30 s und 68 ° C für 2 min die LTR-Promotor, wurde durch PCR amplifiziert, unter Verwendung von Primer-Sets: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'und 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', und in einen pGL3 Basisvektor (Promega, Madison, WI). Es wurde unter Verwendung der Restriktionsstellen abgeschnitten: NheI
I und Eco
R ich das -1.035-1053 Fragment zu erzeugen; Kpn
I und Eco
R I für -426 bis 1053; NHE
I und Afl
II für -61 bis 1053; NHE
I und Eco
81 I für 129-1053; und NheI
I und Stu
ich für 496-1053. Der 496-1053 Reporterkonstrukt wurde weiter verkürzten mit Restriktionsenzymen: NheI
I und Swa
ich für 757-1053; NHE
I und Pvu
II für 860-1053; NHE
I und Bst
X I für 989-1053; Xho
I und Bst
I X für 496-989; Xho
I und Pvu
II für 496-860; und Xho
I und Swa
ich für 496-757. Zur weiteren Verkürzung des 496-989-Fragment, wurde eine PCR mit dem Fragment als Matrize unter Verwendung von Ex Taq DNA-Polymerase (Takara) in 35 Zyklen von 95 ° C für 1 min, 58 ° C für 1 min durchgeführt, und 72 ° C für 1 min, unter Verwendung der folgenden Primer-Sets: für 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'und 5' AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3 '; und 649 bis 989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'und 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Nach der Amplifikation wurden Fragmente in pGL4.12 [luc2CP
] Vektor (Promega) eingefügt. Die -1 kb stromaufwärts Regionen CXCR4
und CXCR7 Videos genomische PCR unter Verwendung MightyAmp DNA-Polymerase (Takara) in 35 Zyklen von 98 ° C für 10 s hergestellt wurden, 62 ° C für 15 s und 68 ° C für 2 min unter Verwendung der folgenden Primer-Sets: für CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'und 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; und für CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'und 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Diese Fragmente wurden in die pGL4.12 eingefügt [luc2CP
] Vektor. Ein Mikrogramm jedes Konstrukt und die Renilla-Luciferase-Reportervektor Steuer (pRL-SV40-Vektor, Promega) wurden kotransfiziert in 1 x 10 5 Zellen unter Verwendung von SuperFect Transfektionsreagenz (QIAGEN). Die Luciferase-Assay wurde 24 Stunden nach der Einführung Reporter durchgeführt wird, einen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) verwendet. Der Test wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt.
GSDMB
Enhancer-HSVtk Lentivirusvektor
Ein pMFG-HSVtk Vektor von RIKEN BRC durch die National Bio-Ressource-Projekt des MEXT, Japan zur Verfügung gestellt wurde, mit freundlicher Genehmigung von Dr. Hirofumi Hamada., und eine HSVtk cDNA wurde von ihm als Nco
I-Bam
HALLO-Fragment ausgeschnitten. Um das GSDMB
Enhancer-HSVtk Lentivirus-Vektor zu konstruieren, zuerst das 496-989 Fragment (GSDMB
Enhancer) wurde in pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) zwischen Nhe
I und Hind
III-Stellen, und dann HSVtk cDNA wurde in den Vektor an einer Bam
HALLO-Stelle im Vorlauf (für Sense-Strang Ausdruck) eingefügt oder rückwärts (für Antisense-Strang Ausdruck) Richtung. Als nächstes GSDMB
Enhancer-HSVtk Sinn und GSDMB
Enhancer-HSVtk Antisense-Fragmente wurden aus den Vektoren Plasmid ausgeschnitten als NHE
I-Not I
Fragmente und eingefügt in pLVSIN-CMV neo Vektoren zwischen dem Xba
I und Not I-Stellen
. Schließlich wurde ein CMV Promotor aus dem lentiviralen Konstrukte entfernt. Zur Erzeugung viralen Partikel, die die Vektoren enthalten, wurden die Konstrukte eingeführt in Lenti-X ™ 293-T-Zellen (Takara) unter Verwendung von Lenti-X ™ HTX-Verpackungssystem (Takara). Nach 72 h'-Inkubation wurde das Medium gesammelt und die Virustiter (cfu /ml) wurde durch Transduktion in HT-1080-Zellen in Gegenwart von Polybren (5 &mgr; g /mL in Kulturmedium, Sigma-Aldrich) bestimmt. Die Partikel wurden zu Met-5A und 60As6 aufgebracht (1 x 10 5 Zellen pro Schale, in dreifacher Ausführung) in vitro
in Gegenwart von Polybren (5 &mgr; g /ml), und die Zellen wurden in Medium inkubiert, enthaltend Gancicrovir (GCV, 5 ug /ml, WAKO) für 5 Tage für Assays Zellwachstum. Die Assays wurden dreifach durchgeführt und P
-Wertes von Student t
-test zwischen den kultivierten Zellen mit (+) und ohne (-) GCV berechnet wurde
Behandlung von PD-Maus-Modell mit GSDMB Enhancer-HSVtk Vektoren kaufen Wir zuvor eine Maus PD-Modell (PD-Mäuse) berichtet, die durch intraperitoneale Injektion von 60As6 Zellen [25] hergestellt. 60As6GFP Zellen (1 × 10 6 Zellen pro Maus) wurden in die Peritonealhöhle von 18 Mäusen injiziert (6 Wochen alten Mäusen CB17 /ICR-Prkdc < scid > /CrlCrlj Genotype: scid /scid, Charles River, Yokohama Japan) am Tag 1. Die Mäuse wurden in zwei Gruppen aufgeteilt; eine Gruppe wurde mit dem Antisense-Expressionsvektor injiziert, und die andere Gruppe wurde mit dem Erfassungsvektor injiziert; Beide Gruppen wurden dann intraperitoneal mit 2 ml PBS-Lösung, die Viruspartikel (5 × 10 5 cfu) und Ganciclovir (2 mg) bei 8, 10 und 12 Tage injiziert. Die mittlere Überlebenszeit von jeder Gruppe und die P
-Wertes von Student t
-test zwischen den beiden Gruppen wurden berechnet. Die Studie des National Cancer Center Kommission für Tierversuche genehmigt wurde.
Ergebnisse | Identifizierung eines Enhancer-Region in GSDMB
, die die Genexpression in GC-Zellen antreibt
den Promotor /Enhancer-Regionen zu identifizieren, würde bei der Entwicklung eines therapeutischen Vektor für die Peritonealdialyse Verbreitung (PD) wirksam zu sein, suchten wir zunächst mehr für Gene häufig in diffusem-Typ GC ausgedrückt als in GC Darm-Typ vergleichende Genexpressionsanalyse zwischen 12 primären diffusen Typen und 18 Darm mit -Typen, weil PD wird häufiger in diffuse-type GC gesehen als im Darm-Typ [22]. Wir haben festgestellt, dass vier von zehn Affymetrix Genechip Sonde setzt höchste fold change für die Genexpression in diffusen Typ GC im Vergleich zu Darm-Typ zeigt, waren Sondensätze für MYH11
(Myosin schwere Kette 11, der glatten Muskulatur Gen, zusätzliche Datei 1: Tabelle S1). Nach der Bestätigung, dass das Gen nicht Mesothelzellen in der immortalisierten humanen Zelllinie 5A-MeT exprimiert wird (Daten nicht gezeigt), wählten wir MYH11
als starke Kandidaten für das Gen, dessen Promotor diffuse-type GC spezifische Expression von HSVtk ermöglicht. Jedoch ist das Gen nicht in 60As6 Zellen exprimiert, die zur Herstellung PD Modell Mäuse verwendet (Zusatzdatei 2: Abbildung S1). Es ist wahrscheinlich, dass MYH11
in Krebs-assoziierte Fibroblasten exprimiert wird, die besonders reichlich in diffusen Typ GC Gewebe. Als nächstes aus dem Microarray Datenanalyse gehen, verschoben wir unsere Aufmerksamkeit auf vorgelagerten Regionen von CXCR4
(Chemokin (CXC-Motiv) -Rezeptor-4-Gen) und CXCR7
(Chemokin (CXC-Motiv) Rezeptor 7-Gen), da beide werden in vielen Arten von Krebs und spielen eine wichtige Rolle bei der Metastasierung exprimiert [27]. Allerdings Reporter-Assays verwendet, fanden wir, dass die vorgelagerten Bereiche dieser Gene sowohl die MeT-5A und den 60As6 Zellen (Zusätzliche Datei 2: Abbildung S2) in transkriptionell aktiv waren, was bedeutet, dass die Regionen, die Expression von HSVtk in menschlichen Mesothelzellen fahren in vivo
. Schließlich haben wir uns auf die GSDMB
Gen, wie unsere früheren Studie zeigte, dass es stark in GC Geweben und Zelllinien exprimiert wird [14].
GSDMB
wird von zwei Promotoren transkribiert, zellulärer und LTR-Promotoren ( Fig. 1a), und die letztere wird hauptsächlich in normalen Geweben und in Tumorzelllinien verwendet [19-21]. Wir bestätigten diese Ergebnisse durch Ausführen RT-PCR aus verschiedenen Arten von normalen Geweben auf RNA-Analysen (Fig. 1b). RT-PCR auf GC chirurgischen Proben zeigten, dass der LTR-Promotor in 14 von 15 Darm-Typ GCs und 15 in 11 von diffusen Typ GCs verwendet wurde (Abb. 1c). Feige. 1 GSDMB
Gen wird durch die zellulären und LTR-Promotoren transkribiert. (A) Eine schematische Darstellung der beiden Promotoren. (B) Expression von zwei Transkripte, eines durch zelluläre Promotor und die andere von LTR, in normalen menschlichen Geweben (RT-PCR). Vier Varianten der menschlichen GSDMB Transkript sind in GenBank registriert; Variante 1 (NM_001042471), Variante 2 (NM_018530), Variante 3 (NM_001165958) und Variante 4 (NM_001165959). Transcription von Varianten 1, 3 und 4 wird durch die zelluläre Promotor angetrieben und die der Variante 2 wird durch den LTR-Promotor. Die 3'-Seite der Transkripte GSDMB
ist üblich, für jeden. (C) Expression von LTR-Transkripte in Magenkrebsgewebe, 15 Darm-Typ und 15 diffus-Typ-Proben (RT-PCR auf chirurgischen Proben)-Mail an einen Bereich von entscheidender Bedeutung für die Transkriptionsaktivität in GC-Zellen zu identifizieren, ein DNA-Fragment, das -1.080-1053 bp, die Position von einer Transkriptionsstartstelle für den LTR-Promotor, wurde isoliert (Abb. 2a). Die Reporterassays auf verkürzten DNA-Fragmenten unter Verwendung von zwei GC-Zelllinien, HSC-57 und HSC-59, zeigte, daß ein 496 bis 989 Region starke Transkriptionsaktivität hatte, sogar stärker als die des ursprünglichen -1.080-1053 Fragment und daß eine weitere Verkürzung des 496-989-Fragment, führte zu einer signifikanten Verringerung der Transkriptionsaktivität (Fig. 2b). Die Region auf diesem Fragment mit starken Transkriptionsaktivität entsprach, wurde GSDMB
Enhancer genannt. Feige. 2 Identifizierung von GSDMB
Enhancer. (A) eine schematische Darstellung Reporterkonstrukten in den Luciferase-Assays verwendet. Long terminal repeat (LTR) Element des menschlichen endogenen Retrovirus wird durch einen Doppelpfeil dargestellt ist. Die Position ist von der Transkriptionsstartstelle für das Transkript des LTR-Promotors. (B) Luziferase-Assays unter Verwendung von zwei Magenkrebszelllinien, HSC-57 und HSC-59, zeigte eine Region mit starker Transkriptionsaktivität, Spanning 496-989, die als GSDMB
Enhancer bezeichnet wurde. Vektor, leere Reportervektor, Bar, Standardabweichung
Aufbau eines GSDMB
Enhancer-driven HSVtk Lentivirusvektor kaufen Wir zuvor eine Maus PD-Modell (PD-Mäuse) berichtet, die durch intraperitoneale Injektion von 60As6 Zellen produziert wurde [ ,,,0],25]; in dieser Studie entwickelten wir eine virales therapeutisches Vektor zur Behandlung von PD-Mäusen. Für die Prüfung der Festigkeit der Transkriptionsaktivität von GSDMB
Enhancer in 60As6, Reporter-Assays wurden durchgeführt, unter Verwendung der Reporter für den stromaufwärtigen Regionen von CXCR4 konstruieren
und CXCR7
zum Vergleich. Die GSDMB
Enhancer zeigte stärkere Transkriptionsaktivität in 60As6 Zellen als die CXCR4 oder in dem vorgeschalteten Regionen
CXCR7, und, wichtiger, die GSDMB
Enhancer hatte sehr schwache Transkriptionsaktivität in peritonealen Maus-Mesothelzellen und in met-5A, eine menschliche Mesothelzellen Zelllinie (Fig. 3). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die GSDMB
Enhancer ermöglicht fast ausschließlich HSVtk Expression in 60As6 aber nicht in Mesothelzellen der Bauchhöhle der Mäuse PD, und wahrscheinlich nicht in menschlichen peritonealen Mesothel. Feige. 3 GSDMB
Enhancer hat eine starke Transkriptionsaktivität in einer 60As6-Zelllinie. Luciferase-Assays mit drei Arten von kultivierten Zellen: 60As6 Zellen, die zur Herstellung von peritonealen Verbreitung (PD) Modell Mäuse in dieser Studie primären Kulturzellen von Maus peritoneale Mesothelzellen und etablierte humane Zelllinie mesotherial Met-5A verwendet wurden. Bar, Standardabweichung
Als nächstes wir die Wirkung des HSVtk /GCV-Therapie untersucht die GSDMB
Enhancer-driven Verwendung HSVtk Lentivirus-Vektor auf 60As6 in vitro
(Fig. 4a). Die Anzahl der 60As6 Zellen mit dem Lentivirus-Vektor transduziert wurde signifikant verringert, wenn sie in Medium mit GCV ergänzt inkubiert; auf der anderen Seite das gleiche HSVtk /GCV-Behandlung hatte keine Wirkung auf die Zellzahl von Met-5A (Fig. 4b). Feige. 4 HSVtk /GCV-Therapie der GSDMB
Enhancer-driven Lentivirus-Vektor unter Verwendung verbessert die Überlebensrate von PD-Mäusen. (A) ein lentiviraler Vektor für therapeutische GSDMB
Enhancer (Enh) -driven Expression von Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase (HSVtk). (B) Zellproliferationsassays auf 60As6 und Met-5A mit der therapeutischen Vektor transduziert, durch Inkubation in dem Medium durchgeführt wird mit (+) /ohne (-) Ganciclovir (GCV). (C) einem Regime von HSVtk /GCV-Therapie für PD-Mäusen. Bar, Standardabweichung, P
, P
-Wertes von Student t
-test zwischen den kultivierten Zellen mit (+) und ohne (-) GCV. (D) Die mikroskopische Untersuchung zeigte eine kleine Population von 60As6GFP Zellen (grüne Fluoreszenz) implantiert in Maus Peritoneum am Tag 10. (e) Anzahl der überlebenden Mäuse nach HSVtk /GCV-Therapie mit dem Sense-Strang-exprimierenden Vektor (rot) und mit einem Antisense -Strang exprimierenden Vektor als Referenz (blau). Die mittlere Überlebenszeit von jeder Gruppe wird auf der rechten Seite mit P
gezeigt - Wert von Student t
-test zwischen den beiden Gruppen
HSVtk /GCV-Therapie von okkultem PD Mäuse kaufen Wir HSVtk /GCV angewendet Therapie PD Mäusen. In diesem therapeutischen Assay, bereiteten wir zwei Typen von GSDMB
Enhancer-driven lentivirus vector: einen Vektor, der das Sense-Strang von HSVtk cDNA exprimiert und wurde für die Behandlung von PD-Mäuse verwendet, während der andere Vektor, der die Antisense-Strang exprimiert und wurde als Kontrolle verwendet. Die Therapie wurde sieben Tage nach intraperitoneale Inokulation von 60As6-Zellen, die grün fluoreszierendes Protein (60As6GFP) gestartet. Dieses Regime wurde für die Behandlung von okkulten PD-Modell entwickelt, in dem 60As6GFP Zellen in die Bauchhöhle diffus transplantiert wurden (Abb. 4c, d). Nach drei Dosen der Behandlung, am Tag 36, keine der neun Mäuse behandelt mit HSVtk Sinnesexpressionsvektor war gestorben, während zwei der neun Referenz Mäuse waren bereits gestorben. Keiner der neun Referenz Mäuse am Leben waren am Tag 57, das heißt, acht Wochen nach der Injektion von 60As6GFP Zellen; jedoch vier von neun therapeutischen Vektor-behandelten Mäuse noch am Leben waren (Abb. 4e). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Therapie die Prognose von okkulten PD Mäuse verbessern kann.
Diskussion
Die GSDMB
Enhancer treibt die Genexpression in GC-Zellen
wir bereits berichtet, dass GSDMB
in allen GC ausgedrückt wird Geweben und Zelllinien untersucht [14], und in dieser Studie zeigten wir, dass der LTR-Promotor GSDMB
Expression in 25 von 30 Proben GC (Fig. 1c) antreibt. Die transkriptionelle Aktivität des LTR-Region (Fig. 2a), wurde zuvor durch Reporter-Assays in nicht-GC-Zellinien demonstriert [20, 21]. Allerdings haben wir eine deutliche Region mit starker Transkriptionsaktivität in der stromabwärts des LTR-Region, und als GSDMB
Enhancer bezeichnet. Zusätzlich zu den beiden GC-Zellinien, HSC-57 und HSC-59 wurde die Transkriptionsaktivität dieser Region durch Reporter-Assays in anderen GC-Zellinien nachgewiesen, einschließlich MKN74 (relative Luciferaseaktivität betrug etwa 1,9), HSC-60 (29,4 ), HSC-42 (2,5) und HSC-44 (4.6), aber nicht in HSC-58 oder MKN28 (Daten nicht gezeigt) [14]. Somit muss der GSDMB
Enhancer nicht Genexpression in einigen GC-Zellen fahren.
Kürzungs einer Region Spanning 496-562 signifikant die Transkriptionsaktivität des GSDMB
Enhancer reduziert (Abb. 2b, +562 bis 989). In der Region 496-562, fanden wir Konsensus-Bindungsstellen mehrerer Transkriptionsfaktoren, einschließlich GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 und NFY-A und Basensubstitution in jeder dieser Konsensussequenzen haben nicht die transkriptionelle Aktivität des Enhancers beeinflussen (Daten nicht gezeigt). Der Transkriptionsfaktor, der mit dem Verstärker zusammenwirkt, und trägt zu seiner Transkriptionsaktivität identifiziert wurde noch nicht.
Anwendung des therapeutischen Lentivirus-Vektor zur Behandlung von menschlichen okkulten PD
kurative Therapie wurde für PD nicht etabliert. GC Patienten mit makroskopischen PD haben schlechte Prognosen, mit einem medianen Gesamtüberlebenszeit von 3-6 Monaten. Diejenigen mit nur mikroskopisch PD auch eine schlechte Prognose haben; ihre 5-Jahres-Überlebensrate beträgt 0-18% [28]. Daher ist es wichtig, okkulte PD durch zytologische Untersuchung der peritonealen Spülflüssigkeit zu erfassen und vollständig von Krebszellen in die Bauchhöhle zu beseitigen. Meta-Analysen von Cabalag et al
. zeigten, dass umfangreiche intraperitoneale Lavage (EIPL, physiologische Kochsalzlösung 1 Liter /Dosis, 10-mal) und intraoperative intraperitoneale Chemotherapie (IIPC) mit Cisplatin 5-Jahres-Gesamtüberlebenszeit um mehr als 40% deutlich verbessert [28]. Die Ergebnisse unserer Studie zeigen, dass HSVtk /GCV-Therapie die Lentivirusvektor verbessert die Prognose von Patienten unabhängig verwenden, und wir davon ausgehen, wird es als Konsolidierungstherapie verwendet werden. Solide Tumoren mit diffusem Wachstum bestehen aus vielen Myofibroblasten und einige Gefäße (z.B. diffus-Typ GCs, Bauchspeicheldrüsenkrebs und szirrhösen Art von Brustkrebs). Je nach den Bedingungen der Mikroumgebung, wie beispielsweise Nährstoffmangel zeigen diese Tumoren eine hohe Prävalenz von selten proliferativen Tumorzellen. Somit diffuse-type GC-Zellen in der Bauchhöhle disseminierte kann aus einer Population bestehen, die die zytotoxische Wirkung von Cisplatin widerstehen kann. Die Lentiviren therapeutische Vektor kann HSVtk in beide wuchernden und nicht-wuchernden Zellen einzuführen. Darüber hinaus ermöglicht die GSDMB
Enhancer GC zellspezifische Expression HSVtk. Diese eingeschränkte Ausdruck minimiert mesothelial Zellschädigung, was bedeutet, dass die Gentherapie unter Verwendung von Dosen hoch genug durchgeführt werden können, um vollständig GC-Zellen zu beseitigen, auch diejenigen, resistent gegen Cisplatin, in okkulten PD. Es ist wahrscheinlich, dass die Kombinationstherapie, EIPL und IIPC, gefolgt von HSVtk /GCV-Therapie die Lentivirusvektor verwenden, wird die Prognose von okkulten PD stärker als die EIPL und IIPC Kombinationstherapie allein verbessern. Wir glauben, dass dieses Regime würdig ist auf klinischen Studien platziert zu werden. Obwohl es, dass der Verstärker
GSDMB erscheint nicht in einigen GC-Zellen funktioniert, mit dem Ziel weitere Studien an weiteren GC-spezifischen Enhancer identifiziert, wird dieses Problem zu beheben.
Schlussfolgerungen
Der GSDMB
-driven HSVtk Ausdruck Vektor hatte eine therapeutische Wirkung auf den okkulten PD-Modell-Mäusen. Diese Strategie kann potentiell verwendet werden GC-Patienten zu verhindern, dass PD Contracting und auch mit PD zur Behandlung von GC-Patienten verwendet.
Erklärungen
Bestätigung
Diese Studie wurde von einem Grants-in-Aid unterstützt für wissenschaftliche Forschung (C .) von der japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (JSPS KAKENHI Grantnummer 23501322)
Zusätzliche Dateien Weitere Datei 1: Artikel Tabelle S1. Top-Ten-Sondensätze zeigen Ausdruck spezifisch diffundieren-Typ Magenkrebs. Weitere Datei 2: Abbildung S1. MYH11
ist nicht in Magenkrebs-Zelllinien exprimiert wird. Eine Promotorregion sowohl von CXCR4
und CXCR7
Gene zeigt eine Transkriptionsaktivität sowohl in 60As6 und MeT-5A-Zellen. Konkurrierende Interessen
Die Autoren erklären, sie haben keine Interessenkonflikte.
Beiträge der Autoren
NS und HS entworfen und leitete diese Studie. NS durchgeführt biologische Analysen und Tierversuche mit Unterstützung von RK, FC und KY. Alle Autoren gelesen und genehmigt haben das endgültige Manuskript.

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