Un vecteur GSDMB activateur-driven thymidine kinase de HSV exprimant pour contrôler la dissémination peritoneale occulte dans des cellules cancéreuses gastriques

le vecteur commandé par activateur-HSV thymidine kinase exprimant d'un GSDMB pour contrôler occulte diffusion péritonéale des cellules cancéreuses gastriques
Résumé de l'arrière-plan
cancer gastrique (GC) est l'une des principales maladies malignes dans le monde entier, en particulier dans Asie, et le Japon et la Corée ont la plus forte incidence dans le monde. Parce que la plupart des cas qui sont réfractaires aux thérapies meurent en raison de la diffusion péritonéale (DP) des cellules cancéreuses, le contrôle PD est important pour la survie des patients. GSDMB
est un membre de la famille des gènes gasdermin. Étant donné que GSDMB
est exprimé dans de nombreux types de cancer, y compris GC, il est probable que le gène contient une région de régulation qui est utilisée pour le traitement de la PD occulte par l'expression spécifique des cellules de cancer de gènes cytotoxiques.
Méthodes
Nous avons effectué des dosages de rapporteur pour identifier la région régulatrice pour l'expression spécifique des cellules de cancer. Nous avons également construit un vecteur thérapeutique lentiviral qui exprime l'herpès simplex virus thymidine kinase (HSVtk) d'une manière spécifique à la cellule GC, et testé dans un modèle murin de PD.: Résultats
Nous avons identifié la région régulatrice à 496 à 989 à partir du site de début de transcription de l'GSDMB et désigné comme l'activateur d'un GSDMB. Le vecteur thérapeutique prolifération lentiviral supprimé d'une lignée de cellules de GC, 60As6, in vitro
en présence de ganciclovir et de l'administration intrapéritonéale du vecteur prolonge la durée de survie des souris qui ont été intrapéritonéale inoculés avec 60As6 une semaine avant l'administration.
Conclusions
Le GSDMB
-Driven vecteur d'expression HSVtk avait un effet thérapeutique sur les souris modèles de PD occultes. Cette stratégie peut potentiellement être utilisé pour traiter les patients du GC avec PD.
Mots-clés
néoplasmes de l'estomac thérapie génétique de la cavité péritonéale HSV thymidine kinase Contexte
cancer gastrique (GC) est l'une des principales maladies malignes, en particulier en Asie, et la deuxième principale cause de décès associés au cancer dans le monde [1]. Il est généralement classés en deux types (la classification de Lauren) [2], intestinal et diffus, qui sont pensés pour refléter sa pathogenèse [3]. Le type diffus GC (DGC) est sous-classée comme mal GC différenciée (type non-solide) ou GC indifférenciée dans le système de classification Cancer Association japonaise gastrique [4]. DGC est infiltrant et montre souvent invasion agressive dans la paroi gastrique, ce qui entraîne dans les métastases et la propagation des cellules de GC dans la cavité péritonéale (diffusion péritonéale, PD).
Les cellules GC disséminées dans la cavité péritonéale donner lieu à une carcinose péritonéale ( CP) [5]. PC provoque des symptômes gastro-intestinaux, tels que des douleurs abdominales, des nausées et des vomissements, ainsi que des symptômes systémiques tels que la perte de poids et ascite. PC ne se détériore que fortement la qualité de vie des patients du GC, mais elle est aussi la principale cause de décès dans le GC [6]. Avec des soins de soutien seuls, la médiane de survie des patients atteints de PC est de 3-6 mois [7]. Si elle est traitée avec une chimiothérapie systémique, de la même manière que pour d'autres lésions métastatiques, CP montre une réponse plus faible à la thérapie que d'autres types de métastases en GC, principalement en raison d'une mauvaise répartition de l'agent chimiothérapeutique dans la cavité péritonéale. Par conséquent, les efforts récents ont mis l'accent sur les thérapies de PC innovants, tels combinant la chirurgie cytoreductive, traitement thermique, et la chimiothérapie intrapéritonéale. Ces approches combinées ont légèrement amélioré le pronostic du PC, bien que la période médiane de survie est encore inférieure à 12 mois, ce qui en fait clair qu'il ya une limite pratique à l'efficacité de cytoréduction chirurgicale [8, 9]. Des études récentes suggèrent qu'il est important d'identifier les patients du GC avec PD occulte en effectuant un examen cytologique du liquide de lavage péritonéal, parce que de tels cas ont amélioré le pronostic s'ils ont obtenu la conversion à la cytologie négative par une vaste lavage péritonéal peropératoire suivie d'une chimiothérapie intrapéritonéale [10].
Le concept de la thérapie du cancer "gène suicide", en utilisant l'herpès simplex virus thymidine kinase (HSVtk), a émergé dans les années 1980 [11]. HSVtk catalyse la phosphorylation du ganciclovir guanosine analogique (GCV) en une forme monophosphate, qui est ensuite phosphorylée par des kinases cellulaires en nucléotides hautement toxiques ganciclovir triphosphate [12]. blocs ganciclovir triphosphate réplication de l'ADN, conduisant à un arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire [13]. La thérapie impliquant le transfert HSVtk dans les cellules cancéreuses, suivie par l'administration de GCV, est connue comme la thérapie génique de suicide, et cette technique a récemment été utilisé dans un essai clinique de phase III sur le glioblastome [12].
Dans cette étude, nous avons développé une thérapeutique HSVtk vecteur qui exprime dans les cellules cancéreuses, en utilisant une région régulatrice du gène gasdermin B (GSDMB de
). GSDMB
est un membre de la gasdermin (GSDM
) famille qui se compose de quatre gènes, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC
et GSDMD
[14, 15], et est exprimée dans des cellules en prolifération de l'épithélium normal et également dans de nombreux types de cancer, y compris l'oesophage, de l'estomac, du foie, du côlon, du col de l'utérus et le cancer du sein [14, 16-18]. GSDMB de l'expression est entraînée par deux promoteurs, le promoteur cellulaire et promoteur LTR dérivé [19-21]. Le promoteur LTR dérivé (promoteur LTR) est actif dans la plupart des tissus normaux, à l'exception de l'estomac, et dans de nombreuses lignées de cellules cancéreuses, tandis que le promoteur cellulaire est actif dans le tissu de l'estomac normal et dans certaines lignées cellulaires de cancer [20]. Dans cette étude, nous avons identifié une région en aval du promoteur LTR, qui a montré une activité transcriptionnelle forte dans des lignées cellulaires de GC. Nous avons utilisé cette région pour construire un vecteur viral HSVtk expression pour contrôler PD occulte.
Méthodes
tissus humains
cancer gastrique (GC) tissus ont été fournis par le National Hospital Cancer Center après avoir obtenu le consentement éclairé de chaque le patient, qui a été approuvé par le Conseil national Review Cancer Center institutionnel (ID: No.17-030). Les échantillons de tissus ont été immédiatement congelés dans l'azote liquide après l'extraction chirurgicale, et conservés à -80 ° C jusqu'à utilisation. L'ARN total
microréseau analyse a été isolé par mise en suspension des cellules dans un tampon de lyse ISOGEN (Nippon Gene, Toyama, Japon) suivie d'une précipitation à l'isopropanol. Nous avons effectué des analyses d'expression en utilisant Array Human Expression version U95A 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA) selon les protocoles des fournisseurs. La valeur d'expression (différence moyenne: AD) de chaque gène a été calculé en utilisant la version 4.0 du logiciel GeneChip Analysis Suite (Affymetrix). classification hiérarchique des données de puces à ADN a été réalisée en utilisant GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), Microsoft EXCEL, et Cluster & TreeView [22, 23]. Toutes les données de puces à ADN ont été déposés dans une base de données compatible MIAME, GEO (numéro d'accession; GSE47007). Par Wilcoxon u
-test (p
< 0,05) et en montrant un changement de 2 fois, les gènes exprimés spécifiquement dans le type diffus GC ont été sélectionnés [22]
lignées cellulaires et de la culture primaire de la souris. les cellules mésothéliales Trois lignées cellulaires de cancer gastrique, HSC-57, dérivé du type intestinal GC et HSC-59 et HSC-60, tous deux dérivés de type diffus GC, ont été établies et caractérisées par l'un des auteurs [24 ]. SNU16, dérivé de type diffus GC, a été fourni à partir de la American Type Culture Collection (ATCC), deux autres lignées cellulaires avec efficacité dans la production de souris PD, 60As6 et 60As6GFP (60As6 exprimant la protéine de fluorescence verte), ont été établis par les auteurs de la diffuse de type GC dérivé HSC-60 lignée cellulaire après plusieurs passages de la transplantation intrapéritonéale à des souris [25]. CC-2511, une lignée cellulaire de fibroblastes, a été achetée auprès de Lonza, Japon (Tokyo, Japon). Toutes les lignées cellulaires ont été maintenues dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco. les cellules mésothéliales souris ont été récoltées par injection de 10 ml d'une solution chauffée à 0,25% de trypsine /EDTA dans la cavité péritonéale [26]. Les cellules ont été incubées pendant 3 jours dans du RPMI-1640 additionné de L-glutamine, le rouge de phénol et d'HEPES (Wako, Tokyo, Japon). Met-5A, une lignée de cellules mésothéliales humaines, a été fourni par l'ATCC et maintenues dans un milieu 199 (Life Technologies, Tokyo, Japon) supplémenté avec 3,3 nM EGF (Life Technologies), 400 nM hydrocortisone (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA), 870 nM insuline (Life Technologies) et 10% de FBS.
total ARNs de RT-PCR à partir d'organes humains normaux ont été achetés auprès de BioChain, Hayward, CA. Les ARN totaux ont été extraits à l'aide d'un kit RNeasy mini (QIAGEN, Tokyo, Japon). Après la génération d'ADNc premier brin de l'ARN total en utilisant le système ThermoScript RT-PCR (Life Technologies, Tokyo Japon), la PCR a été réalisée avec l'ADN polymérase de AccuPrime ™ Pfx (Life Technologies) dans les conditions de cyclisme suivantes soit 35 (transcription LTR ) ou 25 cycles (d'autres): 95 ° C pendant 1 min; 56 ° C (β-actine) ou 58 ° C (autres) pendant 1 min; et 72 ° C pendant 1 min. Les ensembles d'amorces suivantes ont été utilisées: pour la transcription du promoteur cellulaire, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'et 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; pour la transcription du promoteur LTR dérivé, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'et 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; pour 'côté de GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3' et 5'-3 ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3 '; MYH11 pour
, 5'- CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'et 5'- CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; et pour la β-actine
, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'et 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3' Reporter Assay de.
Un fragment génomique, -1080-1053 de GSDMB
et contenant le promoteur LTR a été amplifié par PCR en utilisant lA Taq DNA Hot Start polymerase (Takara) dans 35 cycles de 96 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 2 min, en utilisant des jeux d'amorces: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'et 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', et inséré dans un vecteur de base pGL3 (Promega, Madison, WI). Il a été tronquée en utilisant les sites de restriction Nhel:
R I et Eco I pour générer le fragment de -1035 à 1053; Kpn
I et Eco 'R I pour -426 à 1053; Nhe
II I et Afl pour -61 à 1053; Nhe
I et Eco
81 I pour 129-1053; et Nhe
I et Stu
I pour 496-1053. La construction 496-1053 rapporteur a en outre été tronquée avec des enzymes de restriction: Nhe
I et Swa
I pour 757-1053; Nhe
I et Pvu
II 860-1053; Nhe
I et Bst
X I pour 989-1053; I et Bst de Xho
X I pour 496-989; Xho I et de Pvu
II pour 496-860; et I et Swa
Xho I pour
496-757. Pour de plus amples troncature du fragment 496-989, PCR a été réalisée avec le fragment comme matrice en utilisant l'ADN polymerase Taq Ex (Takara) dans 35 cycles de 95 ° C pendant 1 min, 58 ° C pendant 1 min et 72 ° C pendant 1 min, en utilisant les jeux d'amorces suivants: pour 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'et 5'- AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; et 649-989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'et 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Après amplification, les fragments ont été insérés dans pGL4.12 [luc2CP
] vecteur (Promega). Les régions de -1 kb en amont du CXCR4 hôtels et CXCR7
ont été préparées par PCR génomique en utilisant MightyAmp ADN polymerase (Takara) dans 35 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 62 ° C pendant 15 s et 68 ° C pendant 2 minutes, en utilisant les jeux d'amorces suivants: pour le CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'et 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; et CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'et 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Ces fragments ont été insérés dans le [luc2CP
] vecteur pGL4.12. Un microgramme de chaque construction et le vecteur reporter de luciférase de Renilla contrôle (PRL-vecteur SV40, Promega) ont été co-transfectés dans 1 x 10 5 cellules en utilisant le réactif de transfection SuperFect (QIAGEN). Le dosage de la luciférase a été effectuée 24 h après l'introduction reporteur, en utilisant un système à double Reporter Luciferase Assay (Promega). L'essai a été réalisé en triple.
GSDMB
enhancer-HSVtk vecteur lentivirus
Un vecteur pMFG-HSVtk a été fourni par RIKEN BRC à travers le Projet national de Bio-ressources du MEXT, le Japon, par la courtoisie du Dr . Hirofumi Hamada, et un ADNc HSVtk a été excisé comme un Nco
I-Bam
fragment HI. Pour construire le vecteur lentivirus enhancer-HSVtk du GSDMB, d'abord le 496-989 fragment (GSDMB de l'activateur) a été inséré dans pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) entre Nhe
I et Hind
III des sites, puis HSVtk ADNc a été inséré dans le vecteur à une Bam place
HI dans l'avant (pour l'expression de brin sens) ou inverse (pour l'expression antisens brin) direction. Ensuite, le sens de l'amplificateur-HSVtk GSDMB et des fragments anti-sens amplificateur-HSVTK GSDMB ont été excisés des vecteurs de plasmide Nhe
I-Not I
fragments et insérés dans des vecteurs CMV-pLVSIN neo entre le Xba
I et Not I
sites. Enfin, un promoteur du CMV a été retiré des constructions lentivirales. Pour générer des particules virales contenant les vecteurs, les constructions ont été introduites dans Lenti-X ™ 293 cellules T (Takara) utilisant Lenti-X Système HTX ™, d'emballage (Takara). Après 72 H'-incubation, le milieu a été recueilli et le titre viral (cfu /ml) a été déterminé par transduction dans des cellules HT-1080, en présence de polybrène (5 pg /ml dans du milieu de culture, Sigma-Aldrich). Les particules ont été appliquées à la Met-5A et 60As6 (1 x 10 5 cellules par boîte, en triple exemplaire)
in vitro en présence de polybrène (5 pg /ml) et les cellules ont été incubées dans un milieu contenant Gancicrovir (GCV, 5 pg /ml, WAKO) pendant 5 jours pour les tests de croissance cellulaire. Les essais ont été réalisés en triple et P
-value de t de Student
-test entre les cellules cultivées avec (+) et sans (-) GCV a été calculée de traitement du modèle PD de la souris avec GSDMB vecteurs enhancer-HSVTK
Nous avons précédemment rapporté un modèle de PD de la souris (souris PD) qui a été produit par injection intrapéritonéale de cellules 60As6 [25]. 60As6GFP cellules (1 x 10 6 cellules par souris) ont été injectés dans la cavité péritonéale de 18 souris (6 week-souris âgées de CB17 /Icr-Prkdc < scid > /CrlCrlj Génotype: scid /scid, Charles River, Yokohama Japon) au jour 1. Les souris ont été divisés en deux groupes; un groupe a été injecté avec le vecteur d'expression anti-sens, et l'autre groupe a été injecté avec le vecteur de détection; les deux groupes ont ensuite été injectés par voie intrapéritonéale avec 2 ml d'une solution de PBS contenant des particules virales (5 x 10 5 ufc) et le ganciclovir (2 mg) à 8, 10 et 12 jours. Le temps de survie moyen de chaque groupe et le P
-value des étudiants de t
-test entre les deux groupes ont été calculés. Les résultats de l'étude a été approuvé par le Comité National Cancer Center sur l'expérimentation animale.
identification d'une région d'activateur dans GSDMB
, qui entraîne l'expression des gènes dans les cellules du GC
Pour identifier les régions promoteur /enhancer serait efficace dans le développement d'un vecteur thérapeutique pour la diffusion péritonéale (DP), nous avons d'abord cherché des gènes plus fréquemment exprimées dans de type diffus GC que dans-type intestinal GC à l'aide de l'analyse comparative de l'expression des gènes entre 12 diffuses-types primaires et 18 intestinale -types, parce que PD est plus souvent vu dans de type diffus GC que dans le type intestinal [22]. Nous avons remarqué que quatre des dix Affymetrix GeneChip ensembles de sondes montrant le changement de pli le plus élevé pour l'expression des gènes dans le type diffus GC par rapport au type intestinal étaient ensembles de sondes pour MYH11
(myosine, chaîne lourde 11, gène de muscle lisse, les fichiers supplémentaires 1: Tableau S1). Après avoir confirmé que le gène est pas exprimé dans la lignée de cellules mésothéliales humaines immortalisées MeT-5A (données non présentées), nous avons sélectionné MYH11
comme un candidat pour le gène dont le promoteur permet de type diffus GC expression spécifique de HSVtk. Cependant, le gène est pas exprimé dans 60As6 cellules qui ont été utilisées pour la fabrication de souris modèles de PD (fichier supplémentaire 2: Figure S1). Il est probable que MYH11
est exprimé dans les fibroblastes associés au cancer, qui sont particulièrement abondantes dans les tissus du GC de type diffus. Ensuite, sortant de l'analyse des données de puces à ADN, nous avons réorienté notre attention vers les régions en amont du (de la chimiokine (CXC motifs) du récepteur 4 du gène) de CXCR4 et (chimiokine (CXC du motif) récepteur 7 du gène) de CXCR7, à la fois sont exprimés dans de nombreux types de cancer et ont un rôle important dans les métastases [27]. Cependant, en utilisant des dosages de rapporteur, nous avons constaté que les régions en amont de ces gènes étaient transcriptionnellement actif tant dans le MeT-5A et les cellules 60As6 (fichier supplémentaire 2: Figure S2), ce qui implique que les régions conduisent l'expression de HSVtk dans les cellules mésothéliales humaines in vivo
. Enfin, nous nous sommes concentrés sur le gène de la GSDMB, comme notre étude précédente a indiqué qu'il est fortement exprimé dans les tissus du GC et des lignées cellulaires [14].
GSDMB
est transcrit par deux promoteurs, cellulaires et promoteurs LTR ( Fig. 1a), et celui-ci est principalement utilisé dans les tissus normaux et dans des lignées cellulaires de cancer [19-21]. Nous avons confirmé ces résultats en effectuant des analyses de RT-PCR sur l'ARN à partir de plusieurs types de tissus normaux (Fig. 1b). RT-PCR sur des échantillons chirurgicaux GC a montré que le promoteur du LTR a été utilisé dans 14 des 15 type intestinal CG et dans 11 des 15 glucocorticoïdes de type diffus (fig. 1c). Figue. le gène de 1 GSDMB est transcrit par les promoteurs cellulaires et LTR. (A) une illustration schématique des deux promoteurs. (B) Expression de deux produits de transcription, par une promoteur cellulaire et l'autre par RLT dans les tissus humains normaux (RT-PCR). Quatre variantes de transcription de GSDMB humaine sont enregistrés dans GenBank; variante 1 (NM_001042471), variante 2 (NM_018530), la variante 3 (NM_001165958) et la variante 4 (NM_001165959). La transcription des variantes 1, 3 et 4 est entraîné par le promoteur cellulaire et celui de la variante 2 est le promoteur LTR. côté 3 'des transcriptions du GSDMB est commune à chacun. (C) l'expression de transcrits RLT dans les tissus du cancer de l'estomac, 15 l'intestin et de type 15 échantillons de type diffus (RT-PCR sur des échantillons chirurgicaux)
Pour identifier une région critique pour l'activité de transcription dans des cellules GC, un fragment d'ADN recouvrant -1080 à 1053 pb, dont la position à partir d'un site de démarrage de transcription du promoteur LTR a été isolé (Fig. 2a). Les dosages de rapporteur sur les fragments d'ADN tronqués en utilisant deux lignées cellulaires GC, HSC-57 et HSC-59, a indiqué qu'une région 496-989 a eu une forte activité transcriptionnelle plus forte que celle de l'original -1080 à 1053 fragments, et que la suite troncature du fragment 496-989 a donné lieu à une réduction significative de l'activité de transcription (Fig. 2b). La région correspondant à ce fragment avec une activité transcriptionnelle forte a été nommé GSDMB de l'activateur. Figue. 2 Identification de GSDMB de l'activateur. (A) une illustration schématique montrant constructions rapporteurs utilisés dans les dosages de la luciférase. Longue élément répétition terminale (LTR) du retrovirus endogène humain est représentée par une double flèche. La position est à partir du site de début de transcription pour la transcription du promoteur LTR. (B) des analyses de luciférase en utilisant deux lignées cellulaires de cancer gastrique, HSC-57 et HSC-59, a révélé une région ayant une forte activité de transcription, allant de 496 à 989, qui a été désignée comme GSDMB de l'activateur. Vector, journaliste vecteur vide, bar, déviation standard
Construction de lentivirus de vecteur HSVtk entraîné enhancer-un GSDMB
Nous avons précédemment rapporté un modèle de PD de la souris (PD souris) qui a été produit par injection intrapéritonéale de cellules 60As6 [ ,,,0],25]; dans cette étude, nous avons développé un vecteur thérapeutique viral pour le traitement de souris PD. Pour l'examen de la force de l'activité transcriptionnelle de GSDMB de l'activateur dans 60As6, des dosages de rapporteur ont été effectuées, en utilisant la construction de rapporteur pour les régions en amont de CXCR4
et CXCR7
pour la comparaison. L'activateur du GSDMB a montré une activité transcriptionnelle plus forte dans les cellules 60As6 que les
CXCR4 ou régions en amont de la CXCR7 de, et, surtout, l'activateur du GSDMB avait une très faible activité de transcription dans les cellules mésothéliales péritonéales de souris et Met-5A, une lignée de cellules mésothéliales humaines (Fig. 3). Ce résultat suggère que l'activateur du GSDMB permet l'expression HSVtk presque exclusivement dans 60As6 mais pas dans les cellules mésothéliales de la cavité péritonéale des souris PD, et probablement pas dans le mésothélium péritonéal humain. Figue. 3 GSDMB
activateur présente une activité transcriptionnelle forte dans une lignée cellulaire 60As6. essais luciférase avec trois types de cellules cultivées: les cellules 60As6 qui ont été utilisées pour la fabrication de souris diffusion péritonéale (DP) du modèle dans cette étude, les cellules de culture primaire de cellules mésothéliales péritonéales de souris et la lignée cellulaire mesotherial humaine établie Met-5A. Bar, écart-type
Ensuite, nous avons examiné l'effet de la thérapie HSVtk /GCV utilisant lentivirus le vecteur HSVtk entraîné enhancer-du GSDMB sur 60As6 in vitro
(Fig. 4a). Le nombre de cellules transduites 60As6 avec le vecteur lentiviral a été réduite de manière significative lors d'une incubation dans du milieu supplémenté avec GCV; d'autre part, le même traitement HSVtk /GCV n'a eu aucun effet sur le nombre de cellules de Met-5A (fig. 4b). Figue. 4 thérapie HSVtk /GCV utilisant entraîné activateur vecteur lentivirus du GSDMB a amélioré le taux de souris PD de survie. (A) Un vecteur thérapeutique lentiviral pour GSDMB de l'activateur (Enh) Expression -Driven de l'herpès simplex virus thymidine kinase (HSVtk). (B) des analyses de prolifération cellulaire sur 60As6 et Met-5A transduites avec le vecteur thérapeutique, réalisée par incubation dans le milieu avec du (+) /sans (-) ganciclovir (GCV). (C) Un régime de traitement HSVtk /GCV pour les souris PD. Bar, écart-type, P
, P
-value de t de Student
-test entre les cellules cultivées avec (+) et sans (-) GCV. (D) L'observation microscopique a montré une petite population de cellules 60As6GFP (fluorescence verte) implantées dans le péritoine de la souris au jour 10. (e) Nombre de souris survécu après la thérapie HSVtk /GCV avec le brin sens exprimant vecteur (rouge) et avec un antisens vecteur exprimant brin ß comme référence (bleu). La durée moyenne de survie de chaque groupe est représenté sur le côté droit avec P
- valeur des étudiants de t
-test entre la thérapie HSVtk /GCV, les deux groupes de souris PD occultes
Nous avons appliqué HSVtk /GCV le traitement des souris PD. Dans cet essai thérapeutique, nous avons préparé deux types de conduit activateur vecteur lentivirus du GSDMB: un vecteur exprimé le brin sens de HSVtk ADNc et a été utilisé pour le traitement de souris PD, tandis que l'autre vecteur exprimé antisens brin et a été utilisé comme témoin. La thérapie a commencé sept jours après l'inoculation intrapéritonéale de cellules 60As6 exprimant la protéine de fluorescence verte (60As6GFP). Ce schéma a été conçu pour le traitement du modèle PD occulte dans laquelle les cellules ont été 60As6GFP diffusément greffées dans la cavité péritonéale (fig. 4c, d). Après trois doses de traitement, au jour 36, aucun des neuf souris traitées avec HSVtk vecteur sens-expression était mort, alors que deux des souris de référence neuf étaient déjà morts. Aucune des souris de référence neuf étaient vivants au jour 57, à savoir, huit semaines après l'injection de cellules 60As6GFP; Cependant, quatre des neuf souris traitées par le vecteur thérapeutique étaient encore en vie (Fig. 4E). Ce résultat suggère que la thérapie peut améliorer le pronostic des souris PD occultes. Du Rapport
activateur du GSDMB entraîne l'expression des gènes dans les cellules du GC
Auparavant nous avons signalé que GSDMB
est exprimée dans tous les GC des tissus et des lignées cellulaires examinées [14], et dans cette étude, nous avons démontré que le promoteur LTR du conduit GSDMB de l'expression dans 25 des 30 échantillons de CG (fig. 1c). L'activité transcriptionnelle de la région LTR (fig. 2a) a déjà été démontrée par des essais de rapporteurs dans les lignées cellulaires non GC [20, 21]. Cependant, nous avons trouvé une région distincte avec une forte activité transcriptionnelle en aval de la région LTR, et désigné comme GSDMB de l'activateur. Outre les deux lignées cellulaires GC, HSC-57 et HSC-59, l'activité de transcription de cette région a été détectée par des dosages de rapporteur dans d'autres lignées cellulaires GC, y compris MKN74 (activité relative de luciférase a été d'environ 1,9), HSC-60 (29.4 ), HSC-42 (2.5) et HSC-44 (4.6), mais pas dans HSC-58 ou MKN28 (données non présentées) [14]. Ainsi, l'activateur du GSDMB ne conduit pas l'expression génique dans des cellules GC.
Troncature d'une région enjambant 496-562 a significativement réduit l'activité de transcription de l'activateur du GSDMB (fig. 2b, 562 à 989). Dans le 496-562 région, nous avons trouvé un consensus des sites de liaison de plusieurs facteurs de transcription, y compris GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 et NFY-A, et la base de substitution dans aucune de ces séquences consensus fait pas d'incidence sur l'activité de transcription de l'amplificateur (données non présentées). Le facteur de transcription qui interagit avec l'activateur et contribue à son activité de transcription n'a pas encore été identifié.
Application du vecteur de lentivirus thérapeutique pour le traitement du PD occulte humain
thérapie curative n'a pas été établie pour la maladie de Parkinson. patients du GC avec PD macroscopique ont un mauvais pronostic, avec une survie globale médiane de 3-6 mois. Ceux avec seulement PD microscopique ont aussi un mauvais pronostic; leur taux de survie à 5 ans est 0-18% [28]. Par conséquent, il est important de détecter PD occulte par examen cytologique d'un fluide de lavage peritoneal et complètement éradiquer les cellules cancéreuses dans la cavité péritonéale. Les méta-analyses par Cabalag et al
. ont indiqué que la vaste lavage intrapéritonéale (EIPL, sérum physiologique 1 litre /dose, 10 fois) et de la chimiothérapie intrapéritonéale peropératoire (IIPC) avec le cisplatine amélioré de manière significative la survie globale à 5 ans à plus de 40% [28]. Les résultats de notre étude suggèrent que la thérapie HSVtk /GCV utilisant le vecteur lentivirus améliore le pronostic des patients indépendamment, et nous supposons qu'il sera utilisé en tant que traitement de consolidation. Les tumeurs solides avec une croissance diffuse sont composés de nombreux myofibroblastes et quelques vaisseaux (par exemple, de type diffus GCS, les cancers du pancréas et le type squirrheuse du cancer du sein). En fonction des conditions du microenvironnement, telles que la carence en nutriments, ces tumeurs montrent une prévalence élevée de cellules tumorales rarement prolifératives. Ainsi, les cellules de type GC diffus disséminés dans la cavité peritoneale peut être constitué d'une population qui peut résister à l'effet cytotoxique du cisplatine. Le vecteur thérapeutique lentivirus peut introduire HSVtk dans les deux cellules en prolifération et de non-prolifération. De plus, l'activateur du GSDMB permet GC HSVtk expression spécifique des cellules. Cette expression restreinte minimise les dommages aux cellules mésothéliales, ce qui implique que la thérapie génique peut être réalisée en utilisant des doses suffisamment élevées pour éliminer complètement les cellules GC, y compris ceux résistant au cisplatine, dans la PD occulte. Il est probable que la thérapie de combinaison, EIPL et IIPC, suivi d'un traitement HSVtk /GCV en utilisant le vecteur lentivirus, permettra d'améliorer le pronostic de PD occulte plus significative que la EIPL et la thérapie de combinaison IIPC seul. Nous croyons que ce régime est digne d'être placé sur les essais cliniques. Bien qu'il semble que l'activateur du GSDMB ne fonctionne pas dans certaines cellules du GC, d'autres études visant à identifier des activateurs spécifiques-GC supplémentaires, vont résoudre ce problème.
Conclusions
Le GSDMB
-Driven HSVtk expression vecteur a eu un effet thérapeutique sur les souris modèles de PD occultes. La reconnaissance des Déclarations Cette stratégie peut potentiellement être utilisé pour prévenir les patients du GC de contracter PD et également utilisé pour traiter les patients du GC avec PD.
Cette étude a été soutenue par un Grants-in-Aid pour la recherche scientifique (C .) par la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS KAKENHI Nombre Grant 23501322)
fichiers supplémentaires
fichiers supplémentaires 1: Tableau S1. Les dix ensembles de sondes présentant une expression spécifique pour diffuser de type cancer gastrique. Fichier supplémentaire 2: Figure S1. MYH11
n'a pas été exprimé dans des lignées cellulaires de cancer gastrique. Une région de promoteur à la fois CXCR4 et
gènes de CXCR7 montre une activité de transcription dans les deux cellules et 60As6 Mét-5A. Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts. Les NS les contributions de
Auteurs et HS conçus et dirigés cette étude. NS effectué des analyses biologiques et des expérimentations animales avec le soutien de RK, FC et KY. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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