GSDMB-ojačevalec poganja HSV timidin kinaza-izražanje vektor za nadzor okultno peritonealno razširjanje želodčnih rakavih celic

A GSDMB
-ojačevalec poganja HSV timidin kinaza-izražanje vektor za nadzor okultno peritonealno razširjanje želodčnih rakavih celic
Abstract
Ozadje
raka želodca (GC) je eden od glavnih malignih bolezni po vsem svetu, še posebej v Aziji in na Japonskem in v Koreji imajo največjo pojavnost v svetu. Ker je večina primerov, ki so odporne na terapije umre zaradi peritonealno razširjanje (PD) rakavih celic, nadzor PD je pomembno za preživetje bolnikov. GSDMB
je član gasdermin družini genov. Ker je GSDMB
izražena v mnogih vrstah raka, vključno z GC, je verjetno, da gen vsebuje regulativni regijo, ki je izkoriščen za zdravljenje okultnega PD z rakom specifično izražanje citotoksičnih genov.
Metode
smo izvedli reporterske teste za identifikacijo regulativnega regijo za ekspresijo raka celično specifična. Smo zgradili tudi lentivirusni terapevtsko vektor, ki izraža herpes simpleks virus timidin kinazo (HSVtk) v celični specifični način GC, in preizkušene v mišjem modelu PD.
Rezultati
Identificirali smo regulativnega regijo na +496 do +989, ki ga je GSDMB
prepis začetno stran in ga označi kot GSDMB
ojačevalec. Lentivirusni Terapevtsko Vektor zatreti širjenje GC celične linije, 60As6, vitro
v prisotnosti ganciklovirja in intraperitonealno dajanje vektorja podaljša trajanje preživetja miši, ki so bile intraperitonalno, cepljenih z 60As6 en teden pred uporabo.
Sklepi
GSDMB
-driven HSVtk izrazni vektor imelo terapevtski učinek na okultnih PD modela miši. Ta strategija se potencialno lahko uporablja za zdravljenje bolnikov GC s PD.
Ključne besede
želodcem novotvorbe trebušne votline Genska terapija HSV timidin kinaza Ozadje
raka želodca (GC) je eden od glavnih malignih bolezni, zlasti v Aziji, in drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka povezana po vsem svetu [1]. To je običajno razvrščene v dve vrsti (razvrstitev Lauren) [2], črevesne in razpršeno, ki so mislili, da odražajo njegovo patogenezo [3]. difuzna tipa GC The (DGC) se razvrščajo kot slabo diferencirane GC (non-solid tipa) ali nediferencirani GC v sistem razvrščanja japonski želodca Rak pridružitvenega [4]. DGC je infiltracijsko in pogosto kaže agresivni vdor v želodčni steni, zaradi metastaz in širjenje GC celic v peritonealno votlino (peritonealno razširjanje, PD).
Razširjajo GC celic v peritonealni votlini povzroči peritonealno karcinomatozo ( PC) [5]. PC povzroča gastrointestinalne simptome, kot so bolečine v trebuhu, slabost in bruhanje, pa tudi s sistemskimi simptomi, kot so hujšanje in ascite. PC ne le močno poslabša kakovost življenja bolnikov GC, prav tako pa je vodilni vzrok smrti v GC [6]. Samo s podpornim zdravljenjem, je bila mediana preživetja bolnikov z PC je 3-6 mesece [7]. Če obdelamo s sistemsko kemoterapijo, na enak način kot pri drugih metastatskih lezij računalnik kaže slabšo odziv na terapijo v primerjavi z drugimi vrstami metastaze v GC, predvsem zaradi slabe porazdelitve kemoterapevtika v peritonealno votlino. Zato so nedavna prizadevanja usmerjena na inovativne PC terapij, kot kombiniranje citoreduktivno kirurgije, toplotno terapijo in intraperitonealno kemoterapijo. Ti kombinirani pristopi so nekoliko izboljšalo prognozo računalnika, čeprav je srednja doba preživetja je še vedno manj kot 12 mesecev, pri čemer je jasno, da je praktična meja učinkovitosti kirurškega cytoreduction [8, 9]. Nedavne študije kažejo, da je treba odkriti bolnike GC z okultno PD, ki ga opravlja pregled citološka za peritonealno izpirku, ker taki primeri so pokazali boljšo prognozo če so pridobljeni pretvorbo negativnih citologijo obsežna intraoperativnim peritonealno lavažo sledi intraperitonealno kemoterapijo [10].
koncept "samomor genski" zdravljenja raka s pomočjo herpes simpleks virus timidin kinaze (HSVtk), so se pojavile leta 1980 [11]. HSVtk katalizira fosforilacijo v gvanozin analognega gancikloviru (GCV) v obliki monofosfatno, ki je nato fosforilirajo celičnih nukleotidnih kinaz v zelo strupene gancikloviru trifosfat [12]. Ganciklovir trifosfat bloki DNA replikacijo, kar vodi v ustavitev celičnega cikla in celične smrti [13]. Terapija vključuje HSVtk prenosa na rakave celice, ki mu sledi GCV uprave, ki je znan kot samomor genske terapije, in to tehniko je bil pred kratkim uporabljena v klinični raziskavi faze III na glioblastoma multiforme [12].
V tej študiji smo razvili terapevtski vektor, ki izraža HSVtk v rakavih celicah, z uporabo regulativnega regijo gena gasdermin B (GSDMB
). GSDMB
je član gasdermin (GSDM
) družina, ki je sestavljen iz štirih genov, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC
in GSDMD
[14, 15], in je izražene v proliferirajoče celice normalno epitelija in tudi v mnogih vrstah raka, vključno požiralnika, želodca, jeter, debelega črevesa, materničnega vratu in raka dojk [14, 16-18]. GSDMB
izraz poganja dva promotorji, celični promotor in LTR-izpeljane promotorja [19-21]. LTR-izvira promotor (LTR promotor) je dejavna v večini normalnih tkiv, razen v želodcu in v mnogih linijah rakavih celic, medtem ko je celični promotor je aktivna v normalnem želodcu tkivu in v nekaterih rakavih celic linij [20]. V tej študiji smo identificirali regijo v down-toku promotorja LTR, ki je pokazala močan transkripcijski aktivnost v celičnih linijah GC. Uporabili smo to območje za gradnjo HSVtk-izražanje virusni vektor za nadzor okultno PD.
Metode
Človeška tkiva
rak želodca (GC) tkiva so bili zagotovljeni državni bolnišnici Cancer Center po pridobitvi pisno privolitev iz vsake bolnik, ki je bil odobren s strani National Cancer Center Institutional Review Board (ID: No.17-030). Vzorci tkiva smo takoj zamrznemo s tekočim dušikom po kirurškem ekstrakciji in shranili pri -80 ° C do uporabe.
Mikromrežnem analizi
Celotno RNA smo izolirali s suspendiranje celic v ISOGEN liznega pufra (Nippon gen Toyama, Japonska) čemur sledi obarjanje z izopropanolom. izvedli smo izraz analizo z uporabo Human Expression Array U95A različica 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA), v skladu s protokoli dobaviteljev. Izraz vrednost (povprečna razlika: AD) vsakega gena bila izračunana na podlagi GeneChip Analysis Suite različice 4.0 (Affymetrix). Hierarhična povezovanje podatkov mikromrež je bila izvedena z GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), Microsoft Excel in grozd & TreeView [22, 23]. Vsi podatki mikromrež so shranjeni v skladen podatkovni bazi MIAME, GEO (število pristopu; GSE47007). Z Wilcoxonov u
-test (p
< 0,05) in kaže na 2-kratno spremembo, izraženi geni, posebej v difuzna tipa GC so bili izbrani [22]
Celične linije in primarne kulture miško. mesothelial celic
Tri želodčni rak celičnih linij, HSC-57, pridobljen iz intestinalnega tipa GC in HSC-59 in HSC-60, tako pridobljena iz difuzna tipa GC je bila določena in označena z enim od avtorjev [24 ]. SNU16, ki izhajajo iz difuzna tipa GC, je bila zagotovljena iz American Type Culture Collection (ATCC), dveh drugih celičnih linij z učinkovitostjo v proizvodnji PD miši, 60As6 in 60As6GFP (60As6 izražanje zeleni fluorescentni protein), so bile določene z avtorji iz difuzna tipa GC izhaja HSC-60 celične linije po več delov intraperitonealno presaditev miših [25]. CC-2511, fibroblastov celična linija, je bila kupljena od Lonza, Japonska (Tokio, Japonska). Vse celične linije smo ohranjali in Dulbeccovem spremenjenimi Eagle Medium. Mišje mesothelial celice požanjemo z vbrizganjem 10 ml segretega 0,25% tripsinom raztopine /EDTA v peritonealno votlino [26]. Celice inkubiramo 3 dni v RPMI-1640 dopolnjeni z L-glutaminom, fenol rdečega in HEPES (WAKO, Tokio, Japonska). Met-5A, človek mesothelial celično linijo, je bil zagotovljen z ATCC in vzdržujejo v Medium 199 (Life Technologies, Tokio, Japonska) z dodatkom 3,3 nM ESPG (Life Technologies), 400 nM hydrocortison (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ZDA), 870 nM Insulin (Life Technologies) in 10% FBS.
RT-PCR
Total RNA iz človeških normalnih organov so bile kupljene od BioChain, Hayward, CA. Skupaj RNA so bili pridobljeni z uporabo RNeasy Mini komplet (QIAGEN, Tokio, Japonska). Po generiranje prvi sklop cDNA iz celotne RNA s pomočjo ThermoScript RT-PCR System (Life Technologies, Tokio Japonska), je bil PCR izvedli z AccuPrime ™ PFX
DNK polimerazo (Life Technologies) pod naslednjimi kolesarske pogoji bodisi 35 (LTR transkriptov ) ali 25 ciklov (drugo): 95 ° C za 1 min; 56 ° C (β-aktin) ali 58 ° C (drugi) 1 minuto; in 72 ° C 1 min. Uporabljeni so bili naslednji primerji sklopov: za celični promotor prepis, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'in 5' CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3 '; Za LTR-promotor pridobljen transkriptov, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'in 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; za "stran GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3 '3'in 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3'; za MYH11
, 5'CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'in 5' CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; in P-aktina
, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'in 5' CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3 ".
Reporter Vsebnost
genomske fragment, od -1080 do +1053 od GSDMB
in vsebujejo promotor LTR, smo pomnožili s PCR z uporabo LA Taq Vroči zagon DNA polimerazo (Takara) v 35 ciklov 96 ° C za 30 sekund in 68 ° C za 2 min, ob uporabi začetnih oligonukleotidov nizov: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'in 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 'in vstavi v pGL3 osnovni vektor (Promega, Madison, WI). To je okrnjena je bila z uporabo restrikcijska mesta: NHE
sem in eko
R I za ustvarjanje fragment na -1035 do 1053; KPN
I in eko
R sem -426 do 1053; NHE
I in AFL
II za -61 do 1053; NHE
I in Eco
81 sem 129-1053; in NHE
I in Stu
sem +496 do +1053. 496-1053 novinar konstrukt je bil še bolj okrnjena z omejitvijo encimi: NHE
I in DSP
sem 757-1053; NHE
I in PVU
II za 860-1053; NHE
I in BST
X sem +989 do +1053; Xho
I in BST
x i za 496-989; Xho
I in PVU
II za 496-860; in Xho
I in DSP
sem +496 do +757. Za nadaljnje krajšanjem fragmenta 496 do 989, je PCR izvedemo z fragmenta kot predlogo uporablja Ex Taq DNA polimeraze (Takara) v 35 ciklov 95 ° C za 1 min, 58 ° C za 1 min in 72 ° C 1 minuto, z uporabo naslednjih oligonukleotidov sklope: za 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'in 5'- AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; in +649 do +989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'in 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Po pomnoževanju smo fragmente vstavili v pGL4.12 [luc2CP
] vektor (Promega). V -1 kb gorvodno regije CXCR4
in CXCR7
smo pripravili s genomske PCR z uporabo MightyAmp DNA polimerazo (Takara) v 35 ciklih 98 ° C za 10 sekund, 62 ° C za 15 sekund in 68 ° C 2 minuti, z uporabo naslednjih začetnih oligonukleotidov sklope: za CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'in 5' CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3 '; in CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'in 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Ti delci so bili vstavljeni v [luc2CP
] vektor pGL4.12. En mikrogram vsak konstrukt in Renilla luciferaza nadzorne Reporter prenašalec (PRL-SV40 vektor, Promega) so co-transfektirali v 1 × 10 5 celice, ki uporabljajo SuperFect transfekciji Reagent (QIAGEN). Luciferazni test smo izvedli 24 ur po vnosu reporterskega uporabo Dual-luciferaza reporterskega testa System (Promega). Test je bil izveden v treh izvodih.
GSDMB
ojačevalec-HSVtk lentivirusni vektor
pMFG-HSVtk vektor je zagotovila RIKEN BRC prek nacionalnega Bio-Resource Project v MEXT, na Japonskem, ki ga dovoljenjem dr . Hirofumi Hamada, in cDNA HSVtk smo izrezali iz nje kot Nco
I-Bam
HI fragment. Za izdelavo GSDMB
ojačevalec-HSVtk lentivirusom vektor, prvi fragment 496 do 989 (GSDMB
ojačevalec) je bil vstavljen v pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) med NHE
I in Hind
območij III, in potem smo HSVtk cDNA vstavljena v vektor pri Bam HI
mestu v naprej (za sense-sklop izražanja) ali obratno (za antisense-sklop izražanja) smeri. Nato je bilo GSDMB
ojačevalec-HSVtk občutek in GSDMB
ojačevalec-HSVtk protismiselne fragmenti izrezali iz vektorjev plazmida kot NHE
I-Not
I fragmente in vstavi v pLVSIN-CMV neo vektorjev med Xba
sem in ne
I strani. Končno je bil promotor CMV odstranjen iz lentivirusni konstruktov. Za ustvarjanje virusnih delcev, ki vsebujejo vektorji, so konstrukti uvedli v Lenti-X ™ 293 T celic (Takara) uporabo Lenti-X ™ HTX Embalaža System (Takara). Po 72 h'-inkubaciji smo medij zbrali in virusni titer (cfu /ml) je bila določena s transdukcijo v HT-1080 celic v prisotnosti polybrene (5 ug /ml v mediju kulture, Sigma-Aldrich). Delci so bili uporabljeni za Met-5A in 60As6 (1 x 10 5 celic na posodo, v treh izvodih) vitro
v prisotnosti polybrene (5 ug /ml), in celice inkubiramo v mediju, ki vsebuje Gancicrovir (GCV, 5 mg /ml, WAKO) 5 dni za teste rasti celica. Teste smo izvedli v treh izvodih in P
-vrednost iz Študentske t
-test med kultiviranih celic z (+) in brez (-) je bila GCV izračunano
Zdravljenje modela PD miške z GSDMB ojačevalec-HSVtk vektorji
smo že poročali, je PD modela miške (PD miši), ki je bil proizveden z intraperitonealno injekcijo 60As6 celic [25]. 60As6GFP celice (1 x 10 6 celic na miški) smo injicirali v peritonealno votlino 18 miši (6 tednov stare miši CB17 /ICR-Prkdc < SCID > /CrlCrlj Genotip: SCID /SCID, Charles River, Yokohama Japonska) na dan 1. miši so bile razdeljene v dve skupini; ena skupina injiciramo s protismiselno ekspresijskega vektorja, in druga skupina injiciramo s sense vektorja; Obe skupini smo nato intraperitonealno injicirali 2 ml PBS raztopino, ki vsebuje virusni delec (5 x 10 5 CFU) in ganciklovirja (2 mg) pri 8, 10 in 12 dan. so izračunali pomeni preživetje čas vsake skupine in P
-vrednost iz leta Student je t
-test med obema skupinama. Študijo je odobril nacionalni odbor Cancer Center za preskuse na živalih.
Rezultati
Identifikacija za ojačevalec regiji GSDMB
, ki poganja genske ekspresije v GC celicah
Za identifikacijo promotor /spodbujevalec regije, ki so bi bila učinkovita pri razvoju terapevtskega vektor za peritonealno razširjanje (PD), smo najprej iskali genov bolj pogosto izražene v difuzna tipa GC kot pri črevesnih tipa GC uporabo primerjalne analize izražanja genov med 12 osnovnih razpršenih vrstami in 18 črevesju -types, saj je PD pogosteje kaže v difuzni tipa GC kot v črevesni tipa [22]. Opazili smo, da štirje od desetih Affymetrix GeneChip kompleti sonda, ki prikazuje najvišjo kratna sprememba za genske ekspresije v difuzna tipa GC primerjavi s črevesno tipa so kompleti sonde za MYH11
(miozin, težke verige 11, gladka genov mišic, Dodatna datoteke 1: Tabela S1). Po potrditvi, da je gen ni izražen v imortalizirana človeška mesothelial celične linije Met-5A (podatki niso prikazani), smo izbrali MYH11
kot močan kandidat za gen S promotor omogoča difuzna tip GC poseben izraz HSVtk. Vendar pa je gen ni izražen v 60As6 celice, ki so bili uporabljeni za izdelavo PD modela miši (Dodatni datotek 2: Slika S1). Verjetno je, da se MYH11
izražen v povezanimi z rakom fibroblastov, ki so posebno bogata z difuzno tipa GC tkivih. Dalje, gredo ven iz analize podatkov mikromrež smo preusmerila našo pozornost do pridobivalnih območij CXCR4
(kemokinov (CXC motiv) receptor 4 gen) in CXCR7
(kemokinski (CXC motiv) receptorja 7 gen), kot tudi so izražene v mnogih vrstah raka in imajo pomembno vlogo pri metastaz [27]. Vendar pa uporaba reporter teste, smo ugotovili, da so bile v predhodnih regije teh genov transkripcijsko aktivna v Met-5A in 60As6 celic (Dodatni datotek 2: Slika S2), kar pomeni, da so regije pogon izražanje HSVtk v mesothelial celicami in vivo
. Na koncu smo se osredotočili na GSDMB
gena, kot je naša prejšnja raziskava je pokazala, da se je močno izražena v GC tkiv in celičnih linij [14].
GSDMB
je prepisal z dvema promotorjev, celičnih in promotorji LTR ( fig. 1a), slednji pa se uporablja predvsem v normalnih tkivih in rak celičnih linijah [19-21]. Te ugotovitve, ki jih opravlja RT-PCR analiz na RNK iz več vrst normalnih tkiv (sl. 1b), smo potrdili. RT-PCR na GC kirurški vzorci pokazali, da je predlagatelj LTR uporablja v 14 15 črevesne tipa GK in pri 11 od 15 GK difuzna tipa (sl. 1C). Fig. 1 GSDMB
gen je prepisal predlagatelji Cellular in LTR. (A) shematski prikaz obeh promotorjev. (B) Navedba dveh prepisov, enega pa celični promotor, drugo LTR, v človeških normalnih tkivih (RT-PCR). Štiri variante humane GSDMB prepisa so registrirane v GenBank; Varianta 1 (NM_001042471), varianta 2 (NM_018530), varianta 3 (NM_001165958) in varianta 4 (NM_001165959). Transkripcija variant 1, 3 in 4 poganja celični promotor in da variante 2, s promotorjem LTR. stran 3 'na GSDMB
transkriptov je skupna vsem. (C) Navedba LTR transkriptov v želodčnih tkivih rakom, 15 črevesne tipa in 15 vzorcev difuzna tipa (RT-PCR na kirurški osebkov)
Za identifikacijo regijo odločilnega pomena za transkripcijske aktivnosti v GC celic, DNA fragment segajo -1080 do +1053 bp, položaj od start mestu transkripcije za promotorjem LTR, smo izolirali (sl. 2a). Novinar testi na okrnjeni fragmentov DNA z uporabo dveh celičnih linij GC, HSC-57 in HSC-59, je pokazala, da je imel 496-989 regija močno transkripcijske aktivnosti, še bolj kot v prvotni -1.080-1053 fragment, in da nadaljnje krajšanje fragmenta 496 do 989 povzročila znatno znižanje transkripcijske aktivnosti (sl. 2b). Regija, ki ustreza odlomku z močnim transkripcijske aktivnosti je bil imenovan GSDMB
ojačevalec. Fig. 2. Identifikacija GSDMB
ojačevalec. (A) shematski prikaz, ki prikazuje reporterske konstrukte, ki se uporabljajo v luciferazne teste. Dokler terminalne ponovitve (LTR) element človeškega endogenim retrovirus kaže dvosmerno puščico. Je pozicija od zagona mestu transkripcije za transkript promotorja LTR. (B) luciferaza testi, ki uporabljajo dve želodčni rak celičnih linij, HSC-57 in HSC-59, je pokazala regijo z močnim transkripcijske aktivnosti, ki segajo od +496 do +989, ki je bil določen kot GSDMB
ojačevalec. Vector, prazna reporter vector, Bar, standardni odklon
gradnjo GSDMB
-ojačevalec poganja HSVtk lentivirusom vektorja
smo že poročali je miška PD modela (PD miši), ki je bil proizveden z intraperitonealno injekcijo 60As6 celic [ ,,,0],25]; V tej študiji, smo razvili virusni vektor terapevtsko za zdravljenje PD miši. Pri preučevanju moč transkripcijske aktivnosti GSDMB
ojačevalec v 60As6, so bile izvedene novinar teste, s pomočjo novinar gradnjo na zgornjem delu regije CXCR4
in CXCR7
za primerjavo. V GSDMB
ojačevalec pokazala večjo transkripcijske aktivnosti v 60As6 celicah kot v CXCR4
ali CXCR7
nabavnih regijah, in, kar je pomembno, je bilo v GSDMB
ojačevalec zelo šibko transkripcijske aktivnosti v mišjih peritonealno mesothelial celic in v met-5A, humana mesothelial celična linija (sl. 3). Ta rezultat kaže, da v GSDMB
ojačevalec omogoča HSVtk ekspresijo skoraj izključno v 60As6 vendar ne v mesothelial celicah trebušne votline miši PD, in verjetno ni v človeški peritonealno mesothelium. Fig. 3 GSDMB
ojačevalec ima močan transkripcijski aktivnost v celični liniji 60As6. Luciferazne teste s tremi vrstami gojenih celic: 60As6 celic, ki so bile uporabljene za izdelavo peritonealno razširjanje (PD) modela miši v tej študiji, primarna kultura celice z miško peritonealno mesothelial celic in določiti človeški mesotherial celične linije Met-5A. Bar, standardni odklon
Nato smo pregledali učinek terapije HSVtk /GCV Uporaba GSDMB
-ojačevalec poganja HSVtk lentivirusom vektor na 60As6 in vitro
(sl. 4a). Število 60As6 celic transduciranih z lentivirusom vektorja se je bistveno zmanjšala, ko inkubirali v gojišču z dodatkom GCV; Po drugi strani pa so imeli enako obravnavanje HSVtk /GCV nobenega učinka na števila celic Met-5A (sl. 4b). Fig. 4 terapija HSVtk /GCV Uporaba GSDMB
-ojačevalec poganja lentivirusom vektor izboljšala stopnjo preživetja PD miši. (A) lentivirusni terapevtsko vektor GSDMB
ojačevalec (ENH) -driven ekspresijo herpes simpleks virus timidin kinaze (HSVtk). (B) analize celične proliferacije na 60As6 in Met-5A transduciramo s terapevtskim vector, z inkubacijo izvedli v mediju s (+) /brez (-) gancikloviru (GCV). (C) režim zdravljenja HSVtk /GCV za za PD miši. Bar, standardni odklon, P
, P
-vrednost iz Študentske t
-test med kultivirane celice z (+) in brez (-) GCV. (D) mikroskopsko opazovanje pokazal majhno populacijo 60As6GFP celic (zelene fluorescence), vsajenih v miške potrebušnice na dan 10. (e) Število preživelih miši po terapiji HSVtk /GCV s sense-sklop izražanje vektorja (rdeča) in z antisense -strand izražanje vektor kot referenčno (modro). Pomeni, je čas preživetja vsake skupine je prikazano na desni strani z P
- vrednost Student je t
-test med obema skupinama
HSVtk /GCV terapije okultnih PD miši
smo se uporablja HSVtk /GCV terapija za PD miši. V tej terapevtski testu smo pripravili dve vrsti področij GSDMB
-ojačevalec poganja lentivirusom vektorja: en vektor izražen čut-pramen HSVtk cDNA in je bila uporabljena za zdravljenje PD miši, medtem ko je drugi vektor izražen v antisense-pramen in je bila uporabljena kot kontrolo. Terapija je začelo sedem dni po intraperitonealno inokulacijo 60As6 celic, ki izražajo zeleni fluorescentni protein (60As6GFP). Ta režim je bil zasnovan za zdravljenje okultna modela PD v kateri so 60As6GFP celice difuzno engrafted v peritonealno votlino (sl. 4c, d). Po treh odmerkih zdravljenja, na dan 36, nobena od devetih miših, zdravljenih s HSVtk občutek, izraz vektor je umrl, medtem ko sta dva od devetih referenčnih miši že umrl. Nobeden od devetih referenčnih miših so bili živi na dan 57, tj osem tednov po injiciranju 60As6GFP celic; Vendar pa so bili štirje devetih terapevtskih miši prenašalci obdelamo še živ (sl. 4e). Ta rezultat kaže, da lahko zdravljenje izboljša prognozo okultnimi PD miši.
Razprava
GSDMB
ojačevalec poganja izražanje genov v GC celicah
Prej smo poročali, da je GSDMB
izražena v vseh GC tkiva in celične linije pregleda [14], in v tej študiji smo dokazali, da je promotor LTR vozi GSDMB
izraz v 25 od 30 GC vzorcev (sl. 1c). Transkripcijski dejavnost regije LTR (sl. 2a) je bil prej dokazujejo reporterskih testih v ne-GC celičnih linij [20, 21]. Vendar pa smo ugotovili posebno območje z močnim transkripcijske aktivnosti v nadaljnji regije LTR, in ga označi kot GSDMB
ojačevalec. Poleg dveh celičnih linij GC, HSC-57 in HSC-59, je transkripcijski dejavnost te regije zazna reporterskih testih v drugih GC celičnih linij, vključno MKN74 (relativna luciferazno aktivnost je približno 1,9), HSC-60 (29,4 ) HSC-42 (2,5) in HSC-44 (4,6), vendar ne v HS-58 ali MKN28 (podatki niso prikazani) [14]. Tako, na GSDMB
ojačevalec ne vozi izražanje genov v nekaterih GC celicah.
Krajšanje regije segajo +496 do +562 bistveno zmanjšala transkripcijski dejavnost GSDMB
ojačevalec (sl. 2b, 562 do +989). Na območju 496 do 562, smo našli soglasje veže mesta za več transkripcijskih faktorjev, vključno GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 in NFY-A, in bazno zamenjavo v kateri koli od teh konsenza sekvenc storil ne vpliva na transkripcijsko aktivnost ojačevalec (podatki niso prikazani). Transkripcijski faktor, ki sodeluje s ojačevalec in prispeva k še ni bila ugotovljena njegova transkripcijski dejavnost.
Uporaba terapevtske lentivirusom vektorja zdravljenje človeškega okultnega PD
zdravilni terapiji ni bila dokazana za PD. GC bolniki z makroskopski PD slabe prognoze, z mediano celokupno preživetje 3-6 mesecev. Tiste, ki imajo samo mikroskopskim PD imajo tudi slabo prognozo; njihovo 5-letno preživetje je 0-18% [28]. Zato je pomembno, da zazna okultna PD s pregledom citološka peritonealno izpirku in popolno izkoreninjenje rakavih celic v peritonealni votlini. Meta-analize, ki jih Cabalag et al
. je pokazala, da obsežna intraperitonealno izpiranje (EIPL, fiziološka raztopina 1 legla /odmerek, 10-krat) in med operacijo intraperitonealno kemoterapijo (IIPC) s cisplatinom bistveno izboljšala 5-letno skupno preživetje več kot 40% [28]. Rezultati naše raziskave kažejo, da je terapija HSVtk /GCV pomočjo lentivirusom vektorja izboljša prognozo bolnikov neodvisno, in predpostavljamo, da se bo uporabljal kot konsolidacijsko zdravljenje. Solidnih tumorjev z razpršeno rasti so sestavljeni iz številnih myofibroblasts in nekaj plovil (npr, difuzna tipa GK, trebušne slinavke, raka in scirrhous vrsto raka na dojki). Odvisno od pogojev mikrookolja, kot pomanjkanja hranil, ti tumorji kažejo visoko razširjenost redko proliferativnih tumorskih celic. Tako lahko GC celice difuzno tipa razširjajo v peritonealni votlini sestavljen iz populacije, ki lahko upreti citotoksični učinek cisplatina. Lentivirusni terapevtski vektor lahko uvede HSVtk v obeh razraščajo in ne razraščajo celic. Poleg tega so v GSDMB
ojačevalec omogoča GC celic specifične HSVtk izraz. Ta omejena izraz zmanjšuje mesothelial poškodbe celic, kar pomeni, da se genska terapija lahko izvede z uporabo odmerkov dovolj visoke, da popolnoma izkoreniniti GC celic, tudi tistih, ki so odporne proti cisplatinom, pri prikriti PD. Verjetno je, da kombinirano zdravljenje, EIPL in IIPC, sledi terapija HSVtk /GCV pomočjo lentivirusom vektor, bo izboljšala prognozo okultnega PD precej bolj kot na EIPL in IIPC kombinirano terapijo sam. Menimo, da je ta režim vredna, da jo dajo na kliničnih preskušanjih. Čeprav se zdi, da v GSDMB
ojačevalec ne deluje v nekaterih GC celicah, nadaljnje študije za prepoznavanje dodatne GC-specifične ojačevalcev, bo ta problem rešiti.
Sklepi
GSDMB
-driven HSVtk izraz vektor imela terapevtski učinek na okultnih PD modela miši. Ta strategija se potencialno lahko uporablja za preprečevanje bolnikov GC pred okužbo s PD in tudi uporablja za zdravljenje bolnikov GC s PD.
Deklaracij
Potrditev
Ta študija je bila podprta z Grants v obliki pomoči za znanstvene raziskave (C .), ki ga na Japonskem društvo za promocijo znanosti (JSP KAKENHI Grant številka 23501322)
Dodatne datoteke
Dodatne datoteke 1: Tabela S1. Top deset sklopov sonda, ki kažejo izraz posebno za posredovanje tipa raka želodca. Dodatna datoteka 2: Slika S1. MYH11
ni izražena v želodcu raka celičnih linijah. Predlagatelj regija tako CXCR4
in CXCR7
genov kaže transkripcijske aktivnosti v obeh 60As6 in Met-5A celic. Konkurenčni interesi
Avtorji izjavi nimajo konkurenčnih interesov. Prispevkov
avtorjev
NS in HS zasnovan in usmerjen to študijo. NS izvaja biološke analize in poskusi na živalih ob podpori RK, FC in KY. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• želodčni rak na pedagoški univerzitetni bolnišnici v severovzhodni Tanzaniji je: retrospektiva pregled 232 cases
• Vpliv uvoza diagnozo na praznjenje želodca pri kritično bolnih patients