En GSDMB enhancer-drevet HSV-thymidinkinase-udtrykkende vektor til styring okkult peritoneal udbredelse af mavekræft cells

A GSDMB
enhancer-drevet HSV-thymidinkinase-udtrykkende vektor til styring okkult peritoneal formidling af gastriske cancerceller
Abstract Salg Baggrund
Gastrisk cancer (GC) er en af ​​de store maligne sygdomme i hele verden, især i Asien, og Japan og Korea har den højeste forekomst i verden. Fordi de fleste af de sager, der er refraktære over for terapier dør på grund af peritoneal formidling (PD) i kræftcellerne, kontrollerende PD er vigtigt for patienten at overleve. GSDMB
er et medlem af gasdermin genfamilien. Fordi GSDMB
udtrykkes i mange typer cancer, herunder GC, er det sandsynligt, at genet indeholder en regulatorisk region, der er udnyttet til terapi af okkult PD gennem cancer cellespecifik ekspression af cytotoksiske gener.
Metoder
Vi udførte reporter assays for at identificere den regulatoriske region for cancer cellespecifik ekspression. Konstruerede vi også en lentiviral terapeutisk vektor, som udtrykker herpes simplex virus thymidinkinase (HSVtk) i en GC celle-specifik måde, og testede det i en musemodel for PD.
Resultater
Vi identificerede den regulatoriske region på 496 til 989 fra GSDMB
transkriptionsstartstedet og udpeget den som en GSDMB
forstærker. Den lentivirale terapeutiske vektor undertrykt proliferation af en GC-cellelinie, 60As6, in vitro
i nærvær af ganciclovir og intraperitoneal administration af vektoren forlængede overlevelsen sigt af mus, som blev intraperitonealt inokuleret med 60As6 en uge før administrationen.
konklusioner
GSDMB
-driven HSVtk ekspressionsvektoren havde en terapeutisk virkning på den okkulte PD model mus. Denne strategi kan potentielt anvendes til behandling af GC patienter med PD.
Nøgleord
Mave neoplasmer bughulen Genetisk terapi HSV thymidinkinase Baggrund
Gastric kræft (GC) er en af ​​de store maligne sygdomme, især i Asien, og den anden hyppigste årsag til kræft-associerede dødsfald på verdensplan [1]. Det er normalt klassificeres i to typer (Laurens klassifikation) [2], intestinal og diffus, som menes at afspejle dens patogenese [3]. Den diffuse type GC (DGC) er sub-klassificeret som dårligt differentieret GC (ikke-fast type) eller udifferentieret GC i systemet den japanske Gastric Cancer Association klassificering [4]. DGC er infiltrativ og ofte viser aggressiv invasion ind i mavevæggen, hvilket resulterer i metastase og spredning af GC-celler i peritonealhulen (peritoneal formidling, PD).
Den formidlede GC celler i bughulen give anledning til peritoneal carcinomatose ( PC) [5]. PC forårsager gastrointestinale symptomer, såsom mavesmerter, kvalme og opkastning samt systemiske symptomer såsom vægttab og ascites. PC ikke blot stærkt forringer livskvaliteten for GC patienter, men det er også den mest almindelige dødsårsag i GC [6]. Med understøttende behandling alene, den mediane overlevelse af patienter med PC er 3-6 måneder [7]. Hvis de behandles med systemisk kemoterapi, på samme måde som for andre metastatiske læsioner, PC udviser en dårligere respons på terapien end andre typer af metastaser i GC, primært på grund af dårlig fordeling af det kemoterapeutiske middel i det peritoneale hulrum. Derfor har de seneste bestræbelser fokuseret på innovative pc-lægemidler, såsom kombination af cytoreduktive kirurgi, termisk terapi, og intraperitoneal kemoterapi. Disse kombinerede tilgange har lidt bedre prognosen for PC, selvom den mediane overlevelse periode er stadig mindre end 12 måneder, hvilket gør det klart, at der er en praktisk grænse for effekten af ​​kirurgisk cytoreduktion [8, 9]. Nylige undersøgelser tyder på, at det er vigtigt at identificere GC patienter med okkult PD ved at udføre en cytologisk undersøgelse af peritoneal lavage væske, fordi sådanne tilfælde viste forbedret prognose, hvis de opnåede omdannelse til negativ cytologi ved omfattende intraoperativ peritoneal lavage efterfulgt af intraperitoneal kemoterapi [10].
begrebet "selvmordsgen" cancerterapi under anvendelse herpes simplex virus thymidinkinase (HSVtk), opstod i 1980'erne [11]. HSVtk katalyserer phosphorylering af guanosin analog ganciclovir (GCV) til en monophosphatformen, som efterfølgende phosphoryleres af cellulære nucleotid kinaser i meget giftigt ganciclovirtriphosphat [12]. Ganciclovirtriphosphat blokke DNA-replikation, hvilket fører til cellecyklusstop og celledød [13]. Terapi involverer HSVtk overførsel til kræftceller, efterfulgt af GCV administration, der er kendt som selvmord genterapi, og denne teknik blev for nylig brugt i et klinisk fase III forsøg på glioblastoma multiforme [12].
I denne undersøgelse har vi udviklet en terapeutisk vektor, som udtrykker HSVtk i cancerceller ved anvendelse af en regulatorisk region af gasdermin B genet (GSDMB
). GSDMB
er medlem af gasdermin (GSDM
) familie, der består af fire gener, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC
og GSDMD
[14, 15], og er udtrykt i prolifererende celler i normalt epitel og også i mange typer af cancer, herunder esophageal, gastrisk, lever, colon, cervix uteri og brystcancer [14, 16-18]. GSDMB
udtryk er drevet af to initiativtagere, det cellulære promotor og LTR-afledt promotor [19-21]. LTR-afledte promotor (LTR-promotor) er aktiv i de fleste normale væv, bortset maven, og i mange cancercellelinier, mens den cellulære promotor er aktiv i normal mave væv og i nogle cancercellelinier [20]. I denne undersøgelse identificerede vi en region i down-stream af LTR-promotoren, der udviste stærk transkriptionsaktivitet i GC-cellelinier. Vi brugte denne region til at konstruere en HSVtk-udtryk viral vektor til styring okkult PD.
Metoder
Humane væv
mavekræft (GC) væv blev leveret af National Cancer Center Hospital efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke fra hver patient, som blev godkendt af National Cancer center Institutional Review Board (ID: No.17-030). Vævsprøver blev straks frosset med flydende nitrogen efter kirurgisk ekstraktion og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.
Microarray analyse
Totalt RNA blev isoleret ved at suspendere cellerne i ISOGEN lysepuffer (Nippon Gene, Toyama, Japan) efterfulgt af udfældning med isopropanol. Vi udførte udtryk analyser ved hjælp af menneskelige Expression Array U95A version 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA) i henhold til leverandørens protokoller. Udtrykket værdi (gennemsnitlig forskel: AD) af hvert gen blev beregnet ved hjælp GeneChip Analyse Suite version 4.0 software (Affymetrix). Hierarkisk gruppering af microarray data blev udført ved hjælp GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), Microsoft Excel, og Cluster & TreeView [22, 23]. Alle microarray data er deponeret i en MIAME kompatibel database, GEO (tiltrædelse nummer, GSE47007). Ved Wilcoxon u
-test (p
< 0,05) og ved at vise en 2-gange ændring, gener udtrykkes specifikt i diffus type GC blev udvalgt [22]
cellelinjer og primære kultur af mus. mesotelceller Salg Tre gastriske cancercellelinjer, HSC-57, afledt fra intestinal-typen GC, og HSC-59 og HSC-60, begge afledt fra diffus-typen GC, blev etableret og karakteriseret ved en af ​​forfatterne [24 ]. SNU16, der stammer fra diffuse type GC, blev tilvejebragt fra American Type Culture Collection (ATCC), To andre cellelinjer med effektivitet i at producere PD mus, 60As6 og 60As6GFP (60As6 udtrykker grøn fluorescens protein), blev etableret af forfatterne fra diffus-typen GC afledt HSC-60 cellelinien efter flere passager af intraperitoneal transplantation til mus [25]. CC-2511, en fibroblast cellelinje, blev købt hos Lonza, Japan (Tokyo, Japan). Alle cellelinier blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium. Muse mesotelceller blev høstet ved injektion af 10 ml opvarmet 0,25% trypsin /EDTA-opløsning i peritonealhulen [26]. Cellerne blev inkuberet i 3 dage i RPMI-1640 suppleret med L-glutamin, phenolrødt og HEPES (Wako, Tokyo, Japan). Met-5A, en human mesotelial cellelinie blev tilvejebragt ved ATCC og opretholdt i medium 199 (Life Technologies, Tokyo, Japan) suppleret med 3,3 nM EGF (Life Technologies), 400 nM hydrokortison (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA), 870 nM insulin (Life Technologies) og 10% FBS.
RT-PCR
totale RNA'er fra humane normale organer blev indkøbt fra BioChain, Hayward, CA. Totale RNA'er blev ekstraheret under anvendelse af et RNeasy Mini kit (QIAGEN, Tokyo, Japan). Efter at generere første cDNA fra totalt RNA ved hjælp af Thermoscript RT-PCR System (Life Technologies, Tokyo Japan), blev PCR udført med AccuPrime ™ Pfx
DNA Polymerase (Life Technologies) under følgende cykelforhold af enten 35 (LTR udskrifter ) eller 25 cykler (andre): 95 ° C i 1 min; 56 ° C (β-actin) eller 58 ° C (andre) i 1 min; og 72 ° C i 1 min. De følgende primersæt blev anvendt: til cellulær promotor transkript, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'og 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; for LTR-promotor-afledte transkripter, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'og 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; for 3'-siden af ​​GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3 'og 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3'; for MYH11
, 5'CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'og 5'CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; og for β-actin
, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'og 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3'.
Reporter Assay
En genomisk fragment fra -1080 til at 1053 af GSDMB
og indeholder LTR-promotoren, blev amplificeret ved PCR under anvendelse LA Taq Hot Start DNA-polymerase (Takara) i 35 cykler ved 96 ° C i 30 s og 68 ° C i 2 min, under anvendelse af primersæt: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'og 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', og indsættes i en pGL3 basic Vector (Promega, Madison, WI). Det blev afkortet ved hjælp af restriktionssteder: Nhe
I og Eco
R jeg til at generere -1035 til 1053 fragment; Kpn
I og Eco
R jeg for -426 til 1053; Nhe
I og Afl
II for -61 til 1053; Nhe
I og Eco
81 Jeg for 129-1053; og Nhe
I og Stu
jeg for 496-1053. Det 496-1053 reporter konstruktion blev yderligere afkortet med restriktionsenzymer: Nhe
I og Swa
jeg for 757-1053; Nhe
I og Pvu
II for 860-1053; Nhe
I og Bst
X jeg for 989-1053; Xho
I og Bst
X jeg for 496-989; Xho
I og Pvu
II for 496-860; og Xho
I og Swa
jeg for 496-757. For yderligere trunkering af 496-989 fragment, blev PCR udført med fragmentet som template under anvendelse af Ex Taq DNA-polymerase (Takara) i 35 cykler ved 95 ° C i 1 min, 58 ° C i 1 min og 72 ° C i 1 min, ved hjælp af følgende primer sæt: til 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'og 5'AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; og for 649-989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'og 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Efter amplifikation blev fragmenterne indsat i pGL4.12 [luc2CP
] vektor (Promega). De -1 kb opstrøms regioner af CXCR4
og CXCR7
blev fremstillet ved genomisk PCR ved anvendelse MightyAmp DNA-polymerase (Takara) i 35 cykler ved 98 ° C i 10 s, 62 ° C i 15 s, og 68 ° C i 2 minutter, ved anvendelse af følgende primersæt: for CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'og 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; og for CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'og 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Disse fragmenter blev indsat i pGL4.12 [luc2CP
] vektor. Et mikrogram af hver konstruktion og Renilla luciferase kontrol reporter vektor (pRL-SV40-vektor, Promega) blev co-transficeret ind i 1 x 10 5 celler under anvendelse SuperFect Transfection Reagent (QIAGEN). Luciferase-assayet blev udført 24 timer efter reporter introduktion, under anvendelse af en Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Analysen blev udført i tre eksemplarer.
GSDMB
forstærker-HSVtk lentivirus vektor
En pMFG-HSVtk vektor blev leveret af Riken BRC gennem National Bio-Resource Project i MEXT, Japan, stillet til rådighed af Dr. . Hirofumi Hamada, og en HSVtk cDNA blev udskåret fra det som et Nco
I-Bam
-fragment. For at konstruere GSDMB
forstærker-HSVtk lentivirusvektor, først 496-989 fragment (GSDMB
forstærker) blev indsat i pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) mellem Nhe I og Hind <
br> III sites, og derefter HSVtk cDNA blev indsat i vektoren ved en Bam
HI-sted i den forreste (for sense-strengen ekspression) eller tilbage (til antisense-strengen ekspression) retning. Dernæst blev GSDMB
forstærker-HSVtk fornuft og GSDMB
forstærker-HSVTK antisense fragmenter udskåret fra plasmidvektorer som Nhe
I-Ikke
jeg fragmenter og indsat i pLVSIN-CMV neo vektorer mellem XbaI
I og Not
jeg sites. Endelig blev en CMV-promotor fjernet fra lentivirale konstruktioner. For at generere virale partikler indeholdende vektorerne, blev konstruktionerne indføres i Lenti-X ™ 293 T-celler (Takara) under anvendelse Lenti-X ™ HTX Packaging System (Takara). Efter 72 H'-inkubering blev mediet opsamlet, og virale titer (cfu /ml) blev bestemt ved transduktion i HT-1080-celler i nærvær af polybren (5 ug /ml i dyrkningsmedium, Sigma-Aldrich). Partiklerne blev påført Met-5A og 60As6 (1 × 10 5 celler pr skål i tre eksemplarer) in vitro Salg i nærvær af polybren (5 ug /ml), og cellerne blev inkuberet i medium indeholdende Gancicrovir (GCV, 5 ug /ml, WAKO) i 5 dage for cellevækst assays. Analyserne blev udført tre gange og P
-værdi på Students t
-test mellem de dyrkede celler med (+) og uden (-) GCV blev beregnet
Behandling af PD musemodel med GSDMB enhancer-HSVtk vektorer
Vi har tidligere rapporteret en mus PD model (PD mus), blev fremstillet ved intraperitoneal injektion af 60As6 celler [25]. 60As6GFP celler (1 x 10 6 celler per mus) blev injiceret i peritonealhulen af ​​18 mus (6 uger gamle mus af CB17 /ICR-Prkdc < SCID > /CrlCrlj Genotype: scid /scid, Charles River, Yokohama Japan) på dag 1. musene blev delt i to grupper; En gruppe blev injiceret med antisense-ekspressionsvektoren, og den anden gruppe blev injiceret med sense vektoren; begge grupper blev derefter injiceret intraperitonealt med 2 ml PBS-opløsning indeholdende viruspartikel (5 x 10 5 CFU) og ganciclovir (2 mg) ved 8, 10 og 12 døgn. Den gennemsnitlige overlevelsestid for hver gruppe og P
-værdi af Students t
-test mellem de to grupper blev beregnet. Undersøgelsen blev godkendt af National Cancer Center Udvalg om dyreforsøg.
Resultater
Identifikation af en forstærker region i GSDMB
, som driver genekspression i GC celler
identificere initiativtageren /enhancer regioner, ville være effektive i udviklingen af ​​en terapeutisk vektor til peritoneal formidling (PD), vi først søgte efter gener hyppigere udtrykt i diffust-typen GC end i intestinal type GC under anvendelse sammenlignende genekspressionsanalyse mellem 12 primære diffuse-typer og 18 intestinal -types, fordi PD oftere ses i diffust-typen GC end i den intestinale-typen [22]. Vi har bemærket, at fire af ti Affymetrix GeneChip probe sæt viser den højeste fold-ændring for genekspression i diffust-typen GC i forhold til tarm-typen var probe sæt til MYH11
(myosin, tung kæde 11, glat muskulatur gen, Ekstra fil 1: tabel S1). Efter bekræftelse, at genet ikke udtrykkes i udødeliggjort human mesothelial cellelinie Met-5A (data ikke vist), valgte vi MYH11
som en stærk kandidat til gen, hvis promotor muliggør diffus type GC ekspression af HSVtk. Imidlertid er genet ikke udtrykkes i 60As6 celler, der blev brugt til at lave PD model mus (Yderligere fil 2: Figur S1). Det er sandsynligt, MYH11
udtrykkes i cancerassocierede fibroblaster, som er særligt rigelige i diffust-type GC væv. Dernæst går af microarray dataanalyse, skiftede vi vores opmærksomhed på opstrøms regioner af CXCR4
(chemokin (CXC motiv) receptor 4 gen) og CXCR7
(chemokin (CXC motiv) receptor 7-gen), som begge udtrykkes i mange typer cancer og har en vigtig rolle i metastase [27]. hjælp reporter assays Vi fandt imidlertid, at de opstrøms regioner af disse gener var transkriptionelt aktive i både Met-5A og 60As6 celler (Yderligere fil 2: Figur S2), hvilket indebærer, at regionerne drive ekspressionen af ​​HSVtk i humane mesotelceller in vivo
. Endelig har vi fokuseret på GSDMB
gen, som vores tidligere undersøgelse viste, at den er stærkt udtrykt i GC væv og cellelinjer [14].
GSDMB
er transskriberet af to initiativtagere, cellulære og LTR initiativtagere ( fig. 1a), og sidstnævnte anvendes hovedsagelig i normale væv og cancer cellelinjer [19-21]. Vi bekræftede disse resultater ved at udføre RT-PCR-analyser på RNA fra flere typer af normale væv (fig. 1b). RT-PCR på GC kirurgiske prøver viste, at LTR-promotor blev anvendt i 14 af 15 intestinal-type, GC'er og i 11 af 15 diffus-type GCS (fig. 1c). Fig. 1 GSDMB
gen transskriberes af Cellular og LTR initiativtagere. (A) En skematisk illustration af de to promotorer. (B) Ekspression af to transkripter, et for cellulær promotor og den anden af ​​LTR, i humane normale væv (RT-PCR). Fire varianter af menneskelig GSDMB udskrift er registreret i GenBank; variant 1 (NM_001042471), variant 2 (NM_018530), variant 3 (NM_001165958) og variant 4 (NM_001165959). Transkription af varianter 1, 3 og 4 drives af cellulær promotor og af variant 2 er ved LTR-promotor. 3'-siden af ​​GSDMB
transkripter er fælles for hver. (C) Ekspression af LTR-transkripter i gastrisk cancer væv, 15 intestinal-type og 15 diffus-type prøver (RT-PCR på kirurgiske prøver)
For at identificere en region kritisk for den transkriptionelle aktivitet i GC-celler, et DNA-fragment, der spænder over -1080 til +1053 bp, den stilling fra en transkriptionsstartstedet for LTR-promotoren, blev isoleret (fig. 2a). Reporter assays på trunkerede DNA-fragmenter under anvendelse af to GC cellelinjer, HSC-57 og HSC-59, indikerede, at en 496-989 region havde stærk transkriptionel aktivitet, endnu stærkere end den oprindelige -1080 til +1053 fragment, og at yderligere trunkering af 496-989 fragment resulterede i signifikant reduktion af den transkriptionelle aktivitet (fig. 2b). Området svarende til dette fragment med stærk transkriptionsaktivitet blev navngivet GSDMB
enhancer. Fig. 2 Identifikation af GSDMB
forstærker. (A) En skematisk illustration, der viser reporterkonstruktioner anvendes i luciferaseassays. Lang terminal repeat (LTR) del af den menneskelige endogene retrovirus er vist med en pil med to hoveder. Stillingen er fra transkriptionsstartstedet for udskrift af LTR promotoren. (B) luciferaseassays bruger to gastrisk cancer cellelinjer, HSC-57 og HSC-59, afslørede en region med stærk transkriptionel aktivitet, der spænder fra 496 til 989, der blev udpeget som GSDMB
forstærker. Vector, tom reporter vektor, Bar, standardafvigelse
Opførelse af en GSDMB
forstærker-drevne HSVtk lentivirus vektor
Vi har tidligere rapporteret en mus PD model (PD mus), blev produceret af intraperitoneal injektion af 60As6 celler [ ,,,0],25]; i denne undersøgelse, har vi udviklet en viral terapeutisk vektor til behandling af PD-mus. For at undersøge styrken af ​​den transkriptionelle aktivitet af GSDMB
forstærker i 60As6 blev reporter analyser udført ved hjælp af reporter konstruere de opstrøms regioner CXCR4
og CXCR7
til sammenligning. Den GSDMB
forstærker udviste stærkere transkriptionsaktivitet i 60As6 celler end CXCR4
eller CXCR7
opstrøms regioner, og, vigtigst, GSDMB
forstærker havde meget svag transkriptionsaktivitet i muse peritoneale mesotelceller og i Met-5A, en human mesothelial cellelinie (fig. 3). Dette resultat antyder, at GSDMB
enhancer muliggør HSVtk-ekspression næsten udelukkende i 60As6 men ikke i mesoteliale celler fra bughulen af ​​PD-mus, og sandsynligvis ikke i human peritoneal mesothelium. Fig. 3 GSDMB
enhancer har stærke transkriptionsaktivitet i en 60As6 cellelinie. Luciferaseassays med tre typer af dyrkede celler: 60As6 celler, som blev anvendt til fremstilling af peritoneal formidling (PD) modelmus i denne undersøgelse, primær kultur celler af muse peritoneale mesotelceller og etableret human mesotherial cellelinie Met-5A. Bar, standardafvigelse
Dernæst undersøgte vi effekten af ​​HSVtk /GCV behandling med den GSDMB
enhancer-drevne HSVtk lentivirusvektor på 60As6 in vitro
(fig. 4a). Antallet af 60As6 celler transduceret med lentivirus vektor blev signifikant reduceret, når de inkuberes i medium suppleret med GCV; på den anden side den samme HSVtk /GCV behandling havde ingen virkning på cellen antallet af Met-5A (fig. 4b). Fig. 4 HSVtk /GCV behandling med den GSDMB
forstærker drevet lentivirus vektor forbedrede overlevelsesraten for PD-mus. (A) En lentiviral terapeutisk vektor til GSDMB
enhancer (Enh) -driven ekspression af herpes simplex virus thymidinkinase (HSVtk). (B) celleproliferation assays på 60As6 og Met-5A transduceret med den terapeutiske vektor, udføres ved inkubering i medium med (+) /uden (-) ganciclovir (GCV). (C) et regime af HSVtk /GCV-terapi for PD mus. Bar, standardafvigelse, P
, P
-værdi på Students t
-test mellem de dyrkede celler med (+) og uden (-) GCV. (D) Mikroskopisk observation udviste en lille population af 60As6GFP celler (grøn fluorescens) implanteret i mus peritoneum på dag 10. (e) Antal overlevede mus efter HSVtk /GCV-terapi med sense-strengen udtrykkende vektor (rød) og med et antisense -streng udtrykkende vektor som reference (blå). Gennemsnitlige overlevelsestid for hver gruppe er vist i højre side med P
- værdien af ​​Students t
-test mellem de to grupper
HSVtk /GCV terapi af okkulte PD mus
Vi anvendte HSVtk /GCV terapi til PD-mus. I denne terapeutiske assay fremstillede vi to typer af den GSDMB
enhancer-drevet lentivirusvektor: én vektor udtrykte sense-strengen af ​​HSVtk-cDNA og blev anvendt til behandling af PD-mus, mens den anden vektor udtrykte antisense-strengen og blev brugt som kontrol. Terapien blev startet syv dage efter intraperitoneal podning af 60As6 celler, der udtrykker grønt fluorescensprotein (60As6GFP). Dette regime blev designet til behandling af okkult PD model, hvor 60As6GFP celler blev diffust inkorporeret ind i bughulen (fig. 4c, d). Efter tre doser af behandling, på dag 36, havde ingen af ​​de ni mus behandlet med HSVtk sense-ekspressionsvektor døde, mens to af de ni referencepunkter mus allerede var død. Ingen af ​​de ni referencepunkter musene var i live på dag 57, dvs. otte uger efter injektion af 60As6GFP celler; imidlertid fire af ni terapeutiske vektor-behandlede mus stadig var i live (fig. 4e). Dette resultat tyder på, at terapi kan forbedre prognosen for okkulte PD mus.
Diskussion
GSDMB
forstærker driver genekspression i GC celler
Tidligere vi rapporterede, at GSDMB
udtrykkes i alle GC væv og cellelinier undersøgt [14], og i denne undersøgelse påviste vi, at LTR-promotor driver GSDMB
ekspression i 25 af 30 GC prøver (fig. 1c). Den transkriptionelle aktivitet af LTR-regionen (fig. 2a) er tidligere blevet demonstreret ved reporterassays i ikke-GC cellelinjer [20, 21]. Imidlertid fandt vi en distinkt region med stærk transkriptionsaktivitet i nedstrøms for LTR-regionen, og betegnet den som GSDMB
enhancer. Ud over de to GC-cellelinier, HSC-57 og HSC-59, blev den transkriptionelle aktivitet af denne region detekteres af reporter assays i andre GC cellelinjer, herunder MKN74 (relativ luciferaseaktivitet var ca. 1,9), HSC-60 (29,4 ), HSC-42 (2,5) og HSC-44 (4,6), men ikke i HSC-58 eller MKN28 (data ikke vist) [14]. Således ikke GSDMB
enhancer ikke køre genekspression i nogle GC celler.
Trunkering af en region der spænder over +496 til 562 reducerede signifikant transkriptionel aktivitet af GSDMB
enhancer (fig. 2b, 562 til 989). I 496-562 region, fandt vi konsensus-bindingssteder i flere transkriptionsfaktorer, herunder GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, Sox9, SOX10 og NFY-A, og base-substitution i nogen af ​​disse konsensussekvenser gjorde ikke påvirke den transkriptionelle aktivitet af enhancer (data ikke vist). Transkriptionsfaktoren der interagerer med enhancer og bidrager til dens transkriptionsaktivitet er endnu ikke blevet identificeret.
Anvendelse af den terapeutiske lentivirusvektor til behandling af human okkult PD
Helbredende behandling er ikke blevet fastlagt for PD. GC patienter med makroskopisk PD har dårlige prognoser, med en median overlevelse på 3-6 måneder. Dem med kun mikroskopiske PD har også en dårlig prognose; deres 5-års overlevelse er 0-18% [28]. Derfor er det vigtigt at påvise okkult PD ved cytologisk undersøgelse af peritoneal lavage fluid og fuldstændigt udrydde cancerceller i bughulen. Meta-analyser fra Cabalag et al
. indikeret, at omfattende intraperitoneal lavage (EIPL, fysiologisk saltvand 1 kuld /dosis, 10 gange) og intraoperativ intraperitoneal kemoterapi (IIPC) med cisplatin væsentligt forbedret 5-års samlet overlevelse til mere end 40% [28]. Resultaterne af vores undersøgelse tyder på, at HSVtk /GCV behandling med den lentivirusvektor forbedrer prognosen for patienter uafhængigt, og vi antager, at det vil blive brugt som et sammendrag terapi. Solide tumorer med diffus vækst er sammensat af mange myofibroblaster og få fartøjer (fx diffus type GC'er, pancreascancer og scirrhous type brystkræft). Afhængigt af betingelserne for mikromiljø, såsom næringsstof mangel, disse tumorer viser en høj forekomst af sjældent-proliferative tumorceller. Således kan diffus-type GC-celler formidles i bughulen består af en population, som kan modstå den cytotoksiske virkning af cisplatin. Lentivirus terapeutiske vektor kan introducere HSVtk ind i begge prolifererende og ikke-prolifererende celler. Desuden GSDMB
enhancer muliggør GC cellespecifik HSVtk ekspression. Denne begrænsede ekspression minimerer mesotelial cellebeskadigelse, hvilket indebærer, at genterapi kan udføres under anvendelse doser er høje nok til fuldstændig at udrydde GC-celler, selv dem resistente over for cisplatin, i okkult PD. Det er sandsynligt, at kombinationsterapi, EIPL og IIPC efterfulgt af HSVtk /GCV behandling med den lentivirusvektor, vil forbedre prognosen for okkult PD mere markant end EIPL og IIPC kombinationsterapi alene. Vi mener, at dette regime er værdig til at blive placeret på kliniske forsøg. Selv om det fremgår, at GSDMB
forstærker ikke virker i nogle GC celler, yderligere undersøgelser med sigte på at identificere yderligere GC-specifikke forstærkere vil løse dette problem.
Konklusioner
GSDMB
-driven HSVtk udtryk vektor havde en terapeutisk virkning på den okkulte PD modelmus. Denne strategi kan potentielt bruges til at forhindre GC patienter fra at indgå PD og også anvendes til behandling af GC patienter med PD.
Erklæringer
Kvittering
Denne undersøgelse blev støttet af en Grants-in-Støtte til videnskabelig forskning (C .) af Japan Society for fremme af Science (JSP'er KAKENHI Grant Number 23.501.322)
Ekstra filer
Yderligere fil 1: tabel S1. Top ti probe sæt viser udtryk specifikt for diffus type mavekræft. Yderligere fil 2: Figur S1. MYH11
udtrykkes ikke i gastrisk cancer cellelinjer. En promotor-regionen af ​​både CXCR4
og CXCR7
gener viser en transkriptionel aktivitet i både 60As6 og Met-5A celler. Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende interesser.
Forfattere bidrag
NS og HS designet og instrueret denne undersøgelse. NS udførte biologiske analyser og dyreforsøg med støtte fra RK, FC og KY. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Gastrisk kræft på et universitet universitetshospital i det nordvestlige Tanzania: en retrospektiv gennemgang af 232 sager
• Virkningen af ​​optagelse diagnose på ventrikeltømning i kritisk syge patienter