GSDMB enhancer poháňané HSV tymidínkinázy exprimujúce vektor pre ovládanie okultné peritoneálnej šírenie buniek karcinómu žalúdka

A GSDMB
enhancer riadené HSV tymidínkinázy exprimujúce vektor pre ovládanie okultné peritoneálnej šíreniu rakovinových buniek žalúdočných
Abstract
pozadí
karcinómu žalúdka (GC) je jedným z hlavných nádorových ochorení na celom svete, a to najmä v Ázii a Japonsko a Kórea majú najvyšší výskyt na svete. Pretože väčšina prípadov, ktoré sú refraktérne na terapiu zomiera na peritoneálnej šírenie (PD) nádorových buniek, reguláciu PD je dôležité pre prežitie pacienta. GSDMB
je členom rodiny gasdermin génu. Vzhľadom k tomu, GSDMB
je exprimovaný u mnohých typov rakoviny, vrátane GC, je pravdepodobné, že gén obsahuje regulačné oblasť, ktorá je využitá pre liečbu PD okultné cez bunkovú špecifickú expresiu rakoviny cytotoxických génov.
Metódy
Uskutočnili sme reportéri testy na identifikáciu regulačné oblasť pre expresiu nádorových bunkových špecifické. Tiež konštruované lentivirovým terapeutický vektor, ktorý exprimuje vírusu herpes simplex tymidínkinázy (HSVtk) v bunkovej špecifickej spôsobom GC, a skúša to na myšiam modeli PD.
Výsledky
Identifikovali sme regulačné oblasť na +496 do +989 podaná GSDMB
počiatku transkripcie a označený ho ako GSDMB
zosilňovačom. Lentivirový terapeutický vektor potlačená proliferácie GC bunkové línie, 60As6, in vitro
v prítomnosti gancikloviru a intraperitoneálnom podaní vektora s predĺženým termín prežitie myší, ktoré boli intraperitoneálne naočkovaných 60As6 jeden týždeň pred podaním.
Závery
GSDMB
-driven HSVtk expresný vektor má terapeutický účinok na okultné PD modelu myší. Táto stratégia môže byť potenciálne použité na liečbu pacientov s PD GC.
Kľúčové
žalúdočné nádory dutiny brušnej génovej terapie HSV tymidínkinázy pozadí
karcinómu žalúdka (GC) je jedným z hlavných nádorových ochorení, najmä v Ázii, a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na rakovinu, spojené po celom svete [1]. To je zvyčajne rozdeliť do dvoch typov (Lauren klasifikácia) [2], črevné a difúzna, ktoré sa predpokladá, že do značnej miery odrážajú patogenéze [3]. Difúzne typu GC (DGC) je sub-klasifikovaný ako zle diferencované GC (non-solid typ) alebo nediferencovanej GC v klasifikačnom systéme japonská žalúdočné rakovinové asociácie [4]. DGC je infiltratívny a často ukazuje agresívny invázii do steny žalúdka, čo vedie k metastázy a šírenie GC buniek do peritoneálnej dutiny (peritoneálnej šírenie, PD).
Siréna GC buniek do peritoneálnej dutiny viesť k peritoneálnej karcinosou ( PC) [5]. PC spôsobuje gastrointestinálne príznaky, ako je bolesť brucha, nevoľnosť a vracanie, ako aj systémovými príznakmi, ako je strata hmotnosti a ascitu. PC nielen výrazne zhoršuje kvalitu života pacientov GC, ale to je tiež hlavnou príčinou úmrtí v GC [6]. So samotným podpornú liečbu, medián prežitia u pacientov s PC je 3-6 mesiacov [7]. Ak by sa systémovou chemoterapiou, a to rovnakým spôsobom ako u ostatných metastatických lézií, PC vykazuje horšie odozvu na liečbu, ako iné typy metastáz v GC, najmä z dôvodu zlej rozloženia chemoterapeutickej látky v peritoneálnej dutine. Z tohto dôvodu, nedávne snahy zamerali na inovačné PC liečiv, ako je kombinovanie cytoreduktívnej chirurgia, teplotná terapia, a intraperitoneálnej chemoterapiu. Tieto kombinované prístupy k miernemu zlepšeniu prognózy počítača, aj keď je stredná doba prežitia je stále menej ako 12 mesiacov, takže je jasné, že je praktické obmedzenie pre účinnosť chirurgického cytoredukci [8, 9]. Nedávne štúdie ukazujú, že je dôležité identifikovať pacientov GC s okultné PD prevedením skúšky cytologic peritoneálnej laváži, pretože tieto prípady ukázali zlepšenú prognózu, ak sa získa konverzia na negatívnu cytológie rozsiahlu intraoperačnej peritoneálnej výplach a následne intraperitoneálna chemoterapii [10].
pojem "samovražedný gén" liečbu rakoviny pomocou herpes simplex vírus tymidínkinázy (HSVtk), sa objavil v roku 1980 [11]. HSVtk katalyzuje fosforyláciu guanozín analógového gancikloviru (GCV) do formy monofosfátu, ktorý je následne fosforylovaný bunkovými kinázami nukleotidov do vysoko toxického ganciklovir trifosfát [12]. Ganciklovir trifosfát blokuje replikáciu DNA, čo vedie k zastaveniu bunkového cyklu a smrť bunky [13]. Terapia zahŕňajúce prenos HSVtk do nádorových buniek, nasledované podávaním GCV, je známy ako samovražedné génovej terapie, a táto technika sa v poslednej dobe používa vo fáze III klinického hodnotenia je multiformný glioblastóm [12].
V tejto štúdii sme vyvinuli terapeutický vektor, ktorý exprimuje HSVtk v nádorových bunkách, s použitím regulačné oblasť génu (B gasdermin GSDMB
). GSDMB
je členom gasdermin (GSDM
) Rodina, ktorá sa skladá zo štyroch génov, GSDMA
GSDMB
GSDMC stroje a GSDMD
[14, 15], a je vyjadrená v proliferujúcich bunkách normálneho epitelu a tiež u mnohých typov rakoviny, vrátane pažeráka, žalúdka, pečene, hrubého čreva, krčka maternice a rakoviny prsníka [14, 16-18]. GSDMB
expresia je poháňaný dvoma organizátormi, bunkovej promótor a LTR odvodeného od promotora [19-21]. LTR odvodené promótor (LTR promótor) je aktívna vo väčšine normálnych tkanív, s výnimkou žalúdka, a v mnohých nádorových bunkových línií, zatiaľ čo bunkový promótor je aktívny v normálnom žalúdku tkanive a v niektorých nádorových bunkových línií [20]. V tejto štúdii sme identifikovali oblasť v down-slede promótorom LTR, ktorá ukázala silnú transkripčný aktivitu v bunkových líniách GC. Použili sme túto oblasť konštruovať HSVtk expresie vírusového vektora pre ovládanie okultné PD.
Metódy
Ľudské tkanivá
Karcinóm žalúdka (GC) tkanivá boli poskytnuté štátnej nemocnici Cancer Center po obdržaní písomného informovaného súhlasu od každého pacient, ktorý bol schválený National Cancer Center Institutional Review Board (ID: No.17-030). Tkanivové vzorky boli okamžite zmrazený kvapalným dusíkom po chirurgickej extrakcii, a skladované pri -80 ° C až do použitia.
Microarray, analýzy
Celková RNA bola izolovaná suspendovaním buniek v lyzačním pufri ISOGEN (Nippon Gene, Toyama, Japonsko) nasledované vyzrážaním izopropanolom. Vykonali sme výraz analýzy využívajúce Human Expression Array U95A verzia 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA) podľa protokolov dodávateľov. Výraz hodnota (priemerný rozdiel: AD) každého génu bola vypočítaná pomocou softvéru GeneChip Analysis Suite verzie 4.0 (Affymetrix). Hierarchickej zhlukovaniu mikročipov dát bola vykonaná pomocou GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), Microsoft Excel a cluster & TreeView [22, 23]. Všetky dáta microarray boli uložené v databáze vyhovujúce Miami, GEO (prístupové číslo, GSE47007). Tým, Wilcoxon u
-test (p Hotel < 0,05) a tým, že ukazuje 2-násobnú zmenu, gény prejavujú najmä v difúznej typu GC boli vybrané [22]
Bunkové línie a primárne kultúry myši. mezoteliálnych buniek sa
tri žalúdočné rakovinové bunkové línie, HSC-57, odvodený od intestinálneho typu GC a HSC-59 a HSC-60, obe odvodené z difúznej typu GC, boli stanovené a charakterizované jedným z autorov [24 ]. SNU16, odvodený z difúzna typu GC, boli poskytnuté od American Type Culture Collection (ATCC), dve ďalšie bunkové línie s účinnosťou na výrobu PD myšou, 60As6 a 60As6GFP (60As6 exprimujúce zelený fluorescenčný proteín), boli stanovené podľa autorov z difúzny typ GC odvodené HSC-60 bunkové línie po niekoľkých pasážach intraperitoneálnej transplantáciu u myší [25]. CC-2511, je fibroblastové bunkové línie, bola získaná od Lonza, Japonsko (Tokyo, Japonsko). Všetky bunkové línie boli udržiavané v Dulbeccova modifikovanom Eagle médiu. Myšou mezotelových boli bunky zozbierané injekcií 10 ml zahriateho 0,25% trypsínu /EDTA roztoku do peritoneálnej dutiny [26]. Bunky boli inkubované po dobu 3 dní v RPMI-1640 doplnenom L-glutamínom, fenolovej červene a HEPES (Wako, Tokyo, Japonsko). Met-5A, ľudská mesothelial bunková línia, bola poskytnutá ATCC a udržiavané v médiu 199 (Life Technologies, Tokyo, Japonsko) s prídavkom 3,3 nM EGF (Life Technologies), 400 nM hydrokortizón (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA), 870 nM inzulínu (Life Technologies) a 10% FBS.
RT-PCR
Celková RNA z ľudských normálnych orgánov boli zakúpené od Biochain, Hayward, CA. Celkové RNA boli získané pomocou RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Tokio, Japonsko). Po vytvorení prvého reťazca cDNA z celkovej RNA za použitia Thermoscript RT-PCR System (Life Technologies, Tokyo Japonsko), bola vykonaná PCR s AccuPrime PFX ™
DNA polymeráza (Life Technologies) za nasledovných podmienok cyklovanie buď 35 (LTR transkriptov ) alebo 25 cyklov (ostatné): 95 ° C po dobu 1 minúty; 56 ° C (β-aktínu), alebo 58 ° C (ďalšie) po dobu 1 minúty; a 72 ° C po dobu 1 min. Boli použité nasledujúce sady primérov: pre bunkový promótor transkriptov, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'a 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; pre LTR-odvodených transkriptov, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'a 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; pre 3 'strane GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3' a 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3 '; Pre MYH11
5'-CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'a 5'CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; a pre beta-aktínu
5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'a 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3 "Test Reporter. stroje a genomového fragmentu, od -1080 do +1053 o GSDMB stroje a obsahujúce promótor LTR, bola amplifikovaná pomocou PCR s použitím Taq LA Hot štart DNA polymerázy (Takara) v 35 cyklov 96 ° C počas 30 sekúnd a 68 ° C po dobu 2 minút, za použitia sady primérov: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'a 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', a vložený do vektora pGL3 základný (Promega, Madison, WI). To bol skrátený s použitím reštrikčných miest: NHE
som a ekologické
R Aj vygenerovať -1035 až 1053 fragment; Kpn
I a Eco
R Aj pre -426 až 1053; Nhe
I a II AFL
na -61 až 1053; NHE
I a Eco
81 Aj za 129 až 1053; a NHE Aj stroje a Stu
som +496 až +1053. 496-1053 reportér konštrukt bol ďalej skrátený s reštrikčných enzýmov: NHE
I a Swa
som 757-1053; Nhe
I a II ECS
pre 860 až 1053; NHE
I a BST
X som +989 až +1053; Xho
I a BST
x aj pre 496-989; Xho
I a II ECS
pre 496-860; a Xho I a
Swa
som +496 do +757. Pre ďalšie skrátenie na 496 až 989 fragmentu PCR bola vykonaná s fragmentom ako šablóny pomocou Ex Taq DNA polymerázy (Takara) v 35 cyklov 95 ° C po dobu 1 minúty, 58 ° C po dobu 1 minúty a 72 ° C po dobu 1 min, s použitím nasledujúcich sád primérov: pre 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'a 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; a +649 do +989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'a 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Po zosilnenie, fragmenty boli vložené do pGL4.12 [luc2CP
] vektora (Promega). -1 Kb upstream oblasti CXCR4 stroje a CXCR7
boli pripravené PCR za použitia genómovej MightyAmp DNA polymerázy (Takara) v 35 cyklov 98 ° C počas 10 s, 62 ° C počas 15 sekúnd a 68 ° C po dobu 2 minút, za použitia nasledujúcich primérov: pre CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'a 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; a pre CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'a 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Tieto fragmenty boli vložené do pGL4.12 [luc2CP
] vektora. Jeden mikrogram každý konštrukt a Renilla luciferázy ovládacieho reportér vektor (PRL-SV40 vektora, Promega) boli kotransfekovány do 1 x 10 5 buniek pomocou SuperFect® transfekčního činidla (QIAGEN). Test luciferázy vykonávalo 24 hodín po zavedení reporterového pomocou Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Tento test bol vykonaný v troch opakovaniach.
GSDMB
enhancer-HSVtk lentivirus vektor
pMFG-HSVtk vektor bol poskytnutý Riken BRC prostredníctvom Národného Bio-zdrojov projektu MEXT, Japonsko, zásluhou Dr . Hirofumi Hamada, a HSVtk cDNA bola vyrezaná z nej ako NCO
i-Bam HI fragment
. Konštruovať GSDMB
Enhancer-HSVtk lentivirus vektora, najprv 496 až 989 fragment (GSDMB
Enhancer) bol vložený do pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) medzi NHE
I a Hind
lokalít III, a potom HSVtk cDNA bol vložený do vektora pri
HI miesta Bam v doprednom (pre sense-vlákno expresie) alebo dozadu (pre expresiu nezmyselné prameňov) smere. Ďalej GSDMB
Enhancer-HSVtk rozum a GSDMB
nezmyselné fragmenty Enhancer-HSVtk boli vyrezané z plasmidových vektorov ako NHE
I-Not I fragmenty stroje a vloží do pLVSIN-CMV neo vektorov medzi XBA
i a nie
som lokalít. Napokon, CMV promótor bol odstránený z lentivirových konštruktov. Generovať vírusové častice, obsahujúce tieto vektory, konštrukty boli zavedené do Lenti-X ™ 293 T-buniek (Takara) za použitia Lenti-X ™ HTX Obalový systém (Takara). Po 72 h'-inkubácii sa médium zhromaždí a vírusový titer (CFU /ml) bola stanovená transdukcia do HT-1080 buniek v prítomnosti polybrenu (5 ug /ml v médiu, Sigma-Aldrich). Častice boli aplikované na Met-5A a 60As6 (1 x 10 5 buniek na misku, tri kópie) in vitro
v prítomnosti polybrenu (5 ug /ml) a bunky boli inkubované v médiu obsahujúcom Gancicrovir (GCV, 5 ug /ml, Wako) počas 5 dní pre testy bunkového rastu. Tieto testy boli vykonané v troch opakovaniach a P-hodnota
z Student t-test
medzi kultivovanými bunkami s (+) a bez (-) spaľovacieho tepla bola vypočítaná
úprava modelu myší PD s GSDMB enhancer-HSVtk vektory
sme už bolo skôr oznámené PD myšieho modelu (PD myši), ktorý bol vyrobený intraperitoneálnou injekciou 60As6 buniek [25]. 60As6GFP bunky (1 x 10 6 buniek na myš) boli injikované do peritoneálnej dutiny 18 myší (vek 6 týždňov myší, CB17 /ICR-Prkdc < SCID > /CrlCrlj Genotyp: SCID /SCID, Charles River, Yokohama Japonsko) v deň 1. myši boli rozdelené do dvoch skupín; jedna skupina bola injikovaný s antisencie expresným vektorom, a druhá skupina bola injikovaný sense vektorom; obe skupiny potom bolo intraperitoneálne podali 2 ml roztoku PBS, ktorý obsahuje vírusové častice (5 x 10 5 CFU) a gancykloviru (2 mg) v 8, 10 a 12. deň. bola vypočítaná priemerná doba prežitia každej skupiny a P
-hodnota zo Student je t-test
medzi oboma skupinami. Štúdia bola schválená National Cancer Center výboru k pokusom na zvieratách.
Výsledky
Identifikácia k regiónu enhanceru v GSDMB
, ktorý riadi expresiu génu v GC buniek
K identifikácii promótor /zosilňovač regióny, ktoré by boli účinné pri vývoji terapeutického vektora pre peritoneálnej šírenia (PD), najprv hľadali gény častejšie vyjadrujú v difúznej typu GC než v intestinálnej typu GC za použitia komparatívnej analýzy génovej expresie medzi 12 primárnych rozptýlených typov a 18 intestinálnej -types, pretože PD je viac často vidieť v difúzny typu GC, než v črevnom typu [22]. Zistili sme, že štyri z desiatich Affymetrix GeneChip sady sond, ktorý má najvyššiu fold-change pre génovú expresiu v difúznej typu GC v porovnaní s črevnej typu boli sady sondy pre MYH11
(myosin, ťažký reťaz 11, hladké génu sval, ďalší súbor 1: Tabuľka S1). Po potvrdení, že gén nie je exprimovaný v imortalizované ľudské bunkové línie mesothelial Met-5A (dáta nie sú uvedené), sme vybrali MYH11
ako silný kandidát na génu, ktorého promótor umožňujúci difúzny typ GC špecifickú expresiu HSVtk. Avšak, gén nie je vyjadrená v 60As6 bunkách, ktoré boli použité pre výrobu PD myšiam modeli (ďalšie súbor 2: Obrázok S1). Je pravdepodobné, že MYH11
je vyjadrená vo fibroblastoch s rakovinou spojené, ktoré sú obzvlášť bohaté na GC tkanivách difúzna typu. Ďalej sa z microarray analýzy dát, sme sa presunula svoju pozornosť na upstream oblastí CXCR4
(chemokiny (CXC motívom) receptor 4 gén) a CXCR7
(chemokínu (CXC motívom) receptora 7 génu), zatiaľ čo oba sú vyjadrené v mnohých typov rakoviny a majú dôležitú úlohu v metastáz [27]. Avšak, s použitím reportéri testami, sme zistili, že upstream oblasti týchto génov boli transkripčný aktívny v oboch Met-5A a 60As6 buniek (ďalší súbor 2: Obrázok S2), z čoho vyplýva, že regióny riadi expresiu HSVtk v ľudských mezoteliálnych buniek in vivo
. Nakoniec sme sa zamerali na GSDMB
génu, ako naše predchádzajúce štúdie naznačila, že je silne vyjadrená v GC tkanivách a bunkových líniách [14].
GSDMB
je prepísaný dva organizátormi, mobilné a promotérov LTR ( obr. 1a), a druhý sa používa hlavne v normálnych tkanivách a bunkových línií karcinómu [19-21]. Potvrdili sme tieto poznatky prevedením RT-PCR analýzy na RNA z niekoľkých typov normálnych tkanív (obr. 1b). RT-PCR na GC Chirurgické vzorky ukázali, že promótor LTR bol použitý v 14 z 15 intestinálneho typu GC a v 11 z 15 difúzna typu GC (obr. 1c). Obr. 1 GSDMB
gén je prepísaný promotérov Cellular a LTR. (A) schematické znázornenie dvoch promotorov. (B) Expresia transkriptov dva, jeden bunkovú promótorom a druhý LTR, v ľudských normálnych tkanivách (RT-PCR). Štyri varianty ľudskej GSDMB transkriptov sú registrované v GenBank; Variant 1 (NM_001042471), variant 2 (NM_018530), variant 3 (NM_001165958) a variant 4 (NM_001165959). Transkripcie variant 1, 3 a 4 je riadený promótorom bunkovej a varianty 2 je promótorom LTR. 3 'strane GSDMB
prepisov je spoločná pre každú z nich. (C) Expresia LTR transkriptov v tkanivách karcinómu žalúdka 15 intestinálneho typu a 15 vzoriek difúzna typu (RT-PCR z chirurgických vzoriek)
, identifikovať oblasť je nevyhnutná pre transkripčný aktivitu v GC buniek, DNA fragment klenout -1080 do +1053 bp, pozície z počiatku transkripcie k promótorom LTR, bola izolovaná (obr. 2a). Tieto reportéri testy na skrátených fragmentov DNA pomocou dvoch bunkových línií GC HSC-57 a HSC-59, je uvedené, že 496-989 región mal silnú transkripčný aktivitu, ešte silnejší ako pôvodné -1.080-1053 fragment, a že ďalšie skrátenie na 496 až 989 fragmentu viedla k významnému zníženiu transkripčný aktivity (obr. 2b). Región zodpovedajúce tomuto fragmentu so silnou transkripčný aktivity bol menovaný GSDMB
zosilňovač. Obr. 2 Identifikácia GSDMB
zosilňovačom. (A) schematické znázornenie zobrazujúce reportéri konštrukty použité v luciferázové testy. Dlhá koncová opakovania (LTR) prvok ľudského endogénneho retrovírusu je znázornené dvojitú šípku. Pozícia je od počiatku transkripcie pre prepisu promótorom LTR. (B) stanovenie luciferázy pomocou dvoch žalúdočnej rakovinové bunkové línie, HSC-57 a HSC-59, odhalila oblasť so silnou transkripčný aktivity, preklenutie od +496 do +989, ktorý bol označený ako GSDMB
enhancer. Vektor, prázdny reportér vektor, Bar, štandardná odchýlka
výstavba GSDMB
Enhancer-driven HSVtk lentivirem vektora
sme už bolo skôr oznámené myšieho modelu PD (PD myši), ktorý bol vyrobený intraperitoneálnou injekciou 60As6 buniek [ ,,,0],25]; V tejto štúdii sme vyvinuli vírusový vektor pre terapeutickú liečbu PD myšou. Pre posúdenie pevnosti transkripčný aktivity GSDMB
zosilňovače v 60As6, boli vykonané reportéri testy, za použitia reportér konštrukt pre upstream oblasti CXCR4 stroje a CXCR7
pre porovnanie. V GSDMB
Enhancer ukázal silnejší transkripčný aktivitu v bunkách 60As6 než
CXCR4 alebo do CXCR7
upstream regiónov, a čo je dôležité, na GSDMB
Enhancer mal veľmi slabú transkripčný aktivitu v myších peritoneálnych mesothelial buniek a met-5A, ľudská bunková línia mesothelial (obr. 3). Tento výsledok naznačuje, že GSDMB
enhancer umožňuje HSVtk expresie takmer výlučne v 60As6 ale nie v mezoteliálnych buniek peritoneálnej dutiny myší PD, a pravdepodobne nie v ľudskej peritoneálnej mezotelem. Obr. 3 GSDMB
enhancer má silnú transkripčný aktivitu v bunkovej línii 60As6. Luciferázové testy s tromi typmi kultivovaných buniek: 60As6 bunky, ktoré boli použité pre výrobu peritoneálnej šírenie (PD) modelu myši v tejto štúdii, primárne kultúra buniek z myších peritoneálnych buniek a mezoteliálnych založená ľudská bunková línia mesotherial Met-5A. Bar, štandardná odchýlka
Ďalej sme skúmali účinok terapie HSVtk /GCV užitím GSDMB
zosilňovač riadený HSVtk lentivirus vektor na 60As6 in vitro
(obr. 4a). Počet 60As6 buniek transdukovaných vektorom lentivirů bola významne znížená, keď inkubované v médiu doplnenom GCV; na druhej strane, rovnaké zaobchádzanie HSVtk /GCV nemala žiadny vplyv na počet buniek Met-5A (obr. 4b). Obr. 4 HSVtk /GCV terapie s použitím GSDMB
zosilňovač riadený lentivirus vektora zlepšiť mieru prežitia myší PD. (A) lentivirovým terapeutický vektor pre GSDMB
zosilňovačom (Enh) -driven expresie vírusu herpes simplex tymidínkinázy (HSVtk). (B) testoch bunkovej proliferácie na 60As6 a Met-5A transdukovány terapeutického vektora, vykonáva inkubáciou v médiu s (+) /bez (-), ganciklovir (GCV). (C) režim liečby HSVtk /GCV pre PD myšou. Bar, štandardná odchýlka, P
, P
-hodnota z Student t-test
medzi kultivovanými bunkami s (+) a bez (-) GCV. (D) Mikroskopické pozorovanie vykazovali malú populáciu 60As6GFP buniek (zelená fluorescencia) implantované do myší pobrušnice v deň 10. (e) Počet preživších myší po liečbe HSVtk /GCV s sense vláknom vyjadrujúce vektor (červená) a s antisencie -strand vyjadrenie vektora ako referenčná (modrá). Priemerná doba prežitia každej skupiny je zobrazený na pravej strane s P
- hodnotu Studentov-test
medzi týmito dvoma skupinami
HSVtk /GCV terapiu okultných PD myšou
Použili sme HSVtk /GCV terapia na PD myšou. V tomto teste terapeutickej, pripravili sme dva typy GSDMB
zosilňovač riadený lentivirem vektora: jeden vektor exprimovaný sense-vlákno HSVtk cDNA a bola použitá na liečbu PD myšou, zatiaľ čo druhý vektor vyjadril antisencie-reťazca a bol použitý ako kontrola. Terapia bola zahájená sedem dní po intraperitoneálnej inokulácii 60As6 buniek exprimujúcich zelený fluorescenčný proteín (60As6GFP). Tento režim bol určený pre liečbu okultné modelu PD, v ktorom 60As6GFP bunky difúzne štep do peritoneálnej dutiny (obr. 4c, d). Po troch dávkach liečby, v deň 36, žiadna z deviatich myší liečených HSVtk sense-expresného vektora zomrel, pričom dva z referenčných myší deviatich už zomrel. Žiadna z myší referenčných deviatich nažive v deň 57, to znamená, osem týždňov po injekcii 60As6GFP buniek; Avšak, štyri z deviatich myší terapeutických vektorov liečených ešte nažive (obr. 4e). Tento výsledok naznačuje, že liečba môže zlepšiť prognózu okultné PD myšou.
Diskusia
GSDMB
zvýrazňujúce riadi expresiu génu v bunkách GC
Predtým sme popísali, že GSDMB
je exprimovaný vo všetkých GC tkanív a bunkových línií skúmaná [14], a v tejto štúdii sme preukázali, že promótor LTR riadi GSDMB
vyjadrenie v 25 z 30 vzoriek GC (obr. 1c). Transkripční aktivitu v oblasti LTR (viď obr. 2a) bola už predtým preukázaná reportérových testoch v non-GC bunkové línie [20, 21]. Avšak sme zistili výrazné oblasť so silnou transkripčný aktivity na odberateľskom regiónu LTR, a označil to GSDMB
Enhancer. Okrem týchto dvoch bunkových línií GC, HSC-57 a HSC-59, transkripčný aktivita tejto oblasti bola detekovaná reportérových testoch v iných GC bunkových línií, vrátane MKN74 (relatívna aktivita luciferázy bola približne 1,9), HSC-60 (29,4 ), HSC-42 (2,5) a HSC-44 (4,6), ale nie v HSC-58 alebo MKN28 (dáta nie sú uvedené) [14]. To znamená, že GSDMB
enhancer neriadi génovej expresie v niektorých GC buniek.
Skrátenie oblasti trvajúce +496 do +562 významne znižuje transkripčný aktivitu GSDMB
zosilňovačom (obr. 2b, 562 do +989). V 496 až 562 oblasti, sme zistili, konsenzus-väzbové miesta niekoľkých transkripčných faktorov, vrátane GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 a NFY-A, a báz substitúciu v ktorejkoľvek z týchto konvenčných sekvencií urobil nemá vplyv na transkripčný aktivitu zosilňovača (dáta nie sú uvedené). Transkripčný faktor, ktorý interaguje s zosilňovačom a prispieva k jeho transkripčný aktivita nebola dosiaľ identifikovaná.
Použitie terapeutického lentivirů vektora liečenia ľudského okultné PD
Liečebná terapia nebola stanovená pre PD. Pacienti s GC makroskopické PD majú zlú prognózu, s mediánom celkového prežitia 3-6 mesiacov. Tie, ktoré sa len mikroskopické PD majú zlú prognózu; Ich 5-ročné prežitie je 0-18% [28]. Z tohto dôvodu je dôležité pre detekciu okultného PD podľa cytologické vyšetrenie peritoneálnej laváži a úplne odstrániť rakovinové bunky v brušnej dutine. Meta-analýzy od Cabalag et al
. naznačili, že intraperitoneálna rozsiahla výplach (EIPL, fyziologický roztok jeden vrh /dávka, 10x) a intraoperačnej intraperitoneálna chemoterapia (IIPC) s cisplatinou výrazne zlepšil 5-ročné celkové prežívanie viac ako 40% [28]. Výsledky našej štúdie ukazujú, že HSVtk /GCV terapia pomocou lentivirus vektora zlepšuje prognózu pacientov nezávisle na sebe, a budeme predpokladať, že bude použitý ako konsolidačnej liečby. Solídne nádory s difúznou rastu sa skladá z mnohých myofibroblastů a niekoľko nádob (napr difúzna typu GC, karcinómu pankreasu a scirrhous typu rakoviny prsníka). V závislosti od podmienok, ako je napríklad mikroprostredie nedostatku živín, tieto nádory vykazujú vysokú prevalenciu zriedka-proliferačnej nádorových buniek. Tak, GC bunky difúzny typu šírená v peritoneálnej dutine môže pozostávať z populácie, ktorá môže odolávať cytotoxický účinok cisplatiny. Lentivirus terapeutický vektor môže zaviesť do oboch HSVtk proliferujúcich a non-proliferujúcich buniek. Okrem toho GSDMB
Enhancer umožňuje GC HSVtk expresiu buniek špecifické. Tento obmedzený výraz minimalizuje mezotelových poškodenie buniek, čo znamená, že sa génová terapia môže byť vykonaná za použitia dávky dostatočne vysoké, aby úplne odstrániť GC buniek, a to aj tých, odolný proti cisplatine, v okultné PD. Je pravdepodobné, že kombinačné terapie, a EIPL IIPC, nasleduje liečba HSVtk /GCV pomocou lentivirus vektora, sa zlepšiť prognózu okultné PD výraznejšie ako na EIPL a kombinovanú terapiu IIPC sám. Veríme, že tento režim je hoden sú umiestnené na klinických štúdiách. Aj keď sa zdá, že GSDMB
zosilňovač nefunguje v niektorých GC buniek, ďalšie štúdie zamerané na identifikáciu ďalších zosilňovačov GC-špecifické, bude tento problém vyriešiť.
Závery
GSDMB
-driven HSVtk výraz vektor mal terapeutický účinok na okultné PD modelu myší. Táto stratégia môže byť potenciálne použité na zabránenie pacientov GC pred nakazením PD a tiež používa na liečbu pacientov s GC PD.
Deklarácia
Potvrdenie
Táto štúdia bola podporená granty-v-pomoc pre vedecký výskum (C .) Japan Society pre podporu vedy (JSPS KAKENHI Grant číslo 23501322)
Ďalšie súbory
ďalšie súbor 1: Tabuľka S1. Prvých desať sád sond ukazujúci expresiu špecifickú rozptýliť vypisovať rakovinu žalúdka. Dodatočné Súbor 2: Obrázok S1. MYH11
nie je exprimovaný v žalúdočných nádorových bunkových línií. Promótor región oboch CXCR4 stroje a CXCR7
génov vykazuje transkripčnú aktivitu v oboch 60As6 a stretol-5A buniek. Konkurenčné záujmy
autori vyhlasujú, že nemajú žiadne protichodné záujmy. Podieľanie sa
autori '
NS a HS navrhnutý a riadil túto štúdiu. NS vykonané biologické analýzy a pokusy na zvieratách s podporou RK, FC a KY. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Rakovina žalúdka v univerzitnej fakultnej nemocnici v severozápadnej Tanzánii: retrospektívnu prehľad 232 cases
• Vplyv prijatia diagnózy na vyprázdňovanie žalúdka u kriticky chorých patients