A GSDMB enhancer-Undriff HSV thymidine kinase-ausdrécken Vecteure fir Rulle peritoneal Weiderleede vun gastric Kriibs cells

A GSDMB VerfÜgung enhancer-Undriff HSV thymidine kinase-ausdrécken Vecteure kontroléieren Rulle peritoneal Weiderleede vun gastric Kriibs Zellen VerfÜgung méiglech VerfÜgung fir kontroléieren Background VerfÜgung Gastric Kriibs (GC) ass ee vun de groussen malignant Krankheeten weltwäit, virun allem an Asien, a Japan a Korea hunn deen héchste Heefegkeet vun der Welt. Well déi meescht vun de Fäll, déi un Therapien Paschtéier gi wéinst peritoneal Publikatioun (Haaptleit) vun de Kriibs Zellen stierwen, Haaptleit kontroléieren ass wichteg fir Patient Iwwerliewensfro. GSDMB VerfÜgung ass e Member vun der gasdermin Gentherapie Famill. Well GSDMB VerfÜgung zu vill Zorte vu Kriibs ausgedréckt ass, dorënner GC, ass et wahrscheinlech, datt d'Gentherapie eng reglementaresche Regioun ass dat fir Therapie vun Rulle Haaptleit duerch Kriibs Zell-spezifesch Ausdrock vun cytotoxic Genen geheescht ass. VerfÜgung Method
Mir standing reporter assays de reglementaresche Regioun fir de Kriibs Zell-spezifesch Ausdrock ze identifizéieren. Mir gebaut och eng lentiviral therapeutesch Vecteure datt herpes Simplex Virus thymidine kinase (HSVtk) an engem GC Zell-spezifesch Manéier äussert, a getest et zu enger Maus Modell vun Haaptleit. VerfÜgung Resultater VerfÜgung mir de reglementaresche Regioun um +496 identifizéiert bis +989 aus der Transkriptiouns Start Site VerfÜgung GSDMB an et als GSDMB VerfÜgung enhancer designéierte. D'lentiviral therapeutesch Vecteure Trupen Verbreedung vun engem GC Zell Linn, 60As6, kënschtlech VerfÜgung an der Präsenz vun ganciclovir, an intraperitoneal Administratioun vun der Vecteure länger d'Iwwerliewe Begrëff vun Mais datt intraperitoneally mat 60As6 eng Woch fir d'Administratioun virewech inoculated goufen. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung d'GSDMB VerfÜgung -driven HSVtk Ausdrock Vecteure eng therapeutesch Wierkung op d'Rulle Haaptleit Modell Mais haten. Dës Strategie kann eventuell benotzt ginn fir GC Patienten mat Haaptleit Plëséier. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung Mo. neoplasms Peritoneal Discours genetesch Therapie HSV Thymidine kinase Background VerfÜgung Gastric Kriibs (GC) ee vun de grousse malignant Krankheeten ass, virun allem an Asien, an der zweeter Virwaat Ursaach vum Kriibs-verbonne Doudesfäll weltwäit [1]. Et ass normalerweis an zwou Zorte (Lauren d'Klassifikatioun) klassifizéiert [2], intestinal an diffusen, déi hir pathogenesis sinn Gedanken ze maachen [3]. D'diffusen-Typ GC (DGC) ass-sub klassifizéiert als schlecht ënnerscheet GC (Net-staark Typ) oder Strenz GC an der japanescher Gastric Cancer Association Systematik [4]. DGC ass infiltrative a weist oft aggressiv Invasioun an der gastric Mauer, an Metastasen an der Verbreedung vun GC Zellen an der peritoneal Discours doraus (peritoneal anzebezéien, Haaptleit). Den disseminated GC Zellen am peritoneal Discours VerfÜgung ginn Lut ze peritoneal carcinomatosis ( PC) [5]. PC bewierkt gastrointestinal Symptomer, wéi postwendend misse Péng, benotzen an iwelzeg, souwéi systemesch Symptomer wéi Gewiichtsverloscht an ascite. PC net nëmmen deteriorates betraff der Liewensqualitéit vun GC Patienten, mä et ass och den Haaptfiguren Doudesursaach vun GC [6]. Mat ënnerstëtzen ëm d'Steiren Iwwerliewe vu Patienten mat PC eleng, ass 3-6 Méint [7]. Wann mat systemesch Chimiotherapie behandelt, an déi selwecht Art a Weis wéi fir aner metastatic lesions, PC weist engem aarmen Äntwert op d'Therapie wéi aner Zorte vun Metastasen am GC, haaptsächlech wéinst den armen Verdeelung vun de chemotherapeutic Agent vun der peritoneal Discours. Dofir, hun rezent Efforten op innovative PC therapeutics do, wéi vun cytoreductive Agrëff kombinéiert, thermesch Therapie, an intraperitoneal Chimiotherapie goen. Dës kombinéiert Approche hunn gehumpelt Iwwregens hätt vun PC verbessert, obwuel d'Steiren Iwwerliewe Period ass nach manner ewéi 12 Méint, et kloer, datt et eng praktesch Limite fir d'Efficacitéit vun chirurgesch cytoreduction [8, 9]. Rezent Studien hindeit, datt et wichteg ass GC Patienten mat Rulle Haaptleit ze identifizéieren, déi vun engem cytologic Ënnersiche vun peritoneal lavage Flesseggassystem leeschtungsfäeg, well esou Fäll verbessert hätt awer wann se Konversioun ze negativ Zytologie Tierken intraoperative peritoneal lavage vun intraperitoneal Chimiotherapie [10] duerno kritt. VerfÜgung d'Konzept vun "Suizid Gentherapie" Kriibs Therapie, herpes Simplex Virus thymidine kinase (HSVtk) benotzt, an den 1980er Gedenkminutt [11]. HSVtk catalyzes der phosphorylation vun der guanosine analog ganciclovir (GCV) an engem monophosphate Form dass duerno vun bewosst Nukleotid kinases an héich gëfteg ganciclovir Adenosintriphosphat phosphorylated ass [12]. Ganciclovir Adenosintriphosphat Bleck DNA Gedächtnis, Virwaat zu Zell Zyklus verhaft a Zell Doud [13]. Therapie HSVtk Transfermaart Kriibsfuerschung Zellen sensibiliséieren, vun GCV Administratioun gefollegt, wéi Suizid Gentherapie bekannt ass, an dës Technik kuerzem huet zu enger Phas III Medeziner Prozess op Gehirtumoren multiforme benotzt [12]. VerfÜgung An dëser Etude, entwéckelt mir eng therapeutesch Vecteure datt HSVtk zu Kriibs Zellen, schreiwen e reglementaresche Regioun vun der gasdermin B Gentherapie (GSDMB VerfÜgung) dréckt. GSDMB VerfÜgung engem Member vun der gasdermin ass (GSDM VerfÜgung) Famill, déi vu véier Genen besteet, GSDMA VerfÜgung, GSDMB VerfÜgung, GSDMC VerfÜgung an GSDMD VerfÜgung [14, 15], an ass zu proliferating Zellen vun normal epithelium an och zu villen Zorte vu Kriibs, dorënner esophageal, gastric, Liewer, Colon, Joan cervix an Broscht Cancers ausgedréckt [14, 16-18]. GSDMB VerfÜgung Ausdrock ass vun zwee Promoteuren s'aus, déi bewosst Promoteur an LTR-ofgeleet Promoteur [19-21]. D'LTR-ofgeleet Promoteur (LTR Promoteur) ass aktiv am meeschte normal Stoffer, ausser de Mo, an zu vill Kriibs Zell Linnen, iwwerdeems de bewosst Promoteur ass aktiv an normal Mo. Otemschwieregkeeten an an e puer Kriibs Zell Linnen [20]. An dëser Etude, identifizéiert mir eng Regioun an Ugrëff-stero Transfert vun der LTR Promoteur, datt staark transcriptional Aktivitéit am GC Zell Linnen gewisen. Mir benotzt dëser Regioun eng HSVtk-Ausdrock Haren Vecteure fir Kontrollen Rulle Haaptleit ze bauen. VerfÜgung Method VerfÜgung Mënscherechter Stoffer VerfÜgung Gastric Kriibs (GC) Stoffer vun der National Cancer Center Hospital gëtt sech no aus all schrëftlech informéiert Zoustëmmung Erhaalen Patient, déi vun der National Cancer Center Finanzpolitiker Kritik Verwaltungsrot (ID: No.17-030) abruecht huet. Ray uplanzen sech direkt mat flëssegem Stéckstoff der chirurgesch Extraktioun gefruer, an gespäichert bei -80 ° C bis benotzen. VerfÜgung Total RNS VerfÜgung Microarray Analyse vom duerch d'Zellen am ISOGEN lysis gefiermt ageliwwert (Nippon Gene, Toyama, Japan) gefollegt vun Nidderschlag mat isopropanol. Mir standing Ausdrock Analysë laut Mënscherechter Expression Singular U95A Versioun 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA) benotzt fir d'Fournisseuren 'Ëmwelt-. Den Ausdrock Wäert (duerchschnëttlech Differenz: AD) vun all Gentherapie war mat Versioun GeneChip Analys Suite 4.0 Software (Affymetrix) berechent. Hierarchie Käre vun microarray Donnéeën war mat GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., gekësst Alto, CA), Microsoft iwwerschratt, an Koup &gesuergt; TreeView [22, 23]. All microarray Donnéeën hunn an engem MIAME diversifiéiert Datebank, Geo (Bäitrëtt Zuel; GSE47007) verschéckt ginn. Vun Wilcoxon u VerfÜgung Azeton (p VerfÜgung &Si besteet; 0,05) a vun engem 2-fantastesch änneren weist, spezifesch ausgedréckt Genen vun diffusen-Typ GC sech ausgewielt [22] zu Zell Linnen an alleréischter Kultur vun Maus. mesothelial Zellen VerfÜgung Dräi gastric Kriibs Zell Linnen, HSC-57, ofgeleet vu intestinal-Typ GC, an HSC-59 an HSC-60, ofgeleet souwuel vun diffusen-Typ GC, sech etabléiert an duerch ee vun den Auteuren engersäits [24 ]. SNU16, ofgeleet vun diffusen-Typ GC, gouf aus der American Type Kultur Collection (ATCC) gëtt, zwee aner Zell Linnen mat Effizienz vun Haaptleit Mais produzéiert, 60As6 an 60As6GFP (60As6 gréng fluorescence FAQ ausdrécken), déi vun der Auteuren aus der etabléiert sech diffusen-Typ GC ofgeleet HSC-60 Zell Linn no verschiddene Passage vun intraperitoneal Transplantatioun zu Mais [25]. CC-2511, engem fibroblast Zell Linn, war aus Lonza, Japan (Tokyo, Japan) kaaft. All Zell Strecken an Dulbecco d'geännert Eagle mëttlerer haten. Mouse mesothelial Zellen sech duerch Sprëtzen vun 10 ml vu sech 0,25% Trypsin /héich Léisung an der peritoneal Discours [26] recoltéiert. D'Zellen sech fir 3 Deeg zu RPMI-1640 mat L-glutamine, Phenol Red an HEPES (WAKO, Tokyo, Japan) ergänzt incubated. Erfëllt-5A, e Mënsch mesothelial Zell Linn, war vun ATCC an haten an mëttlerer 199 (Life Technologies, Tokyo, Japan) gëtt ergänzt mat 3,3 nm EGF (Life Technologies), 400 nm hydrocortison (Fläch-Aldrich, St. Louis, MO USA), 870 nm Insulin (Life Technologies) an 10% FBS. VerfÜgung RT-Hinnen alleguer VerfÜgung Total RNAs vum Mënsch normal Organer sech aus BioChain, Hayward, CA. kaaft Total RNAs huet mat enger RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Tokyo, Japan) ofgebaut. éischte-staarkt cDNA aus total RNS benotzt ThermoScript RT-Hinnen alleguer System (Life Technologies, Tokyo Japan), Hinnen alleguer war mat AccuPrime ™ Pfx VerfÜgung DNA Polymerase (Life Technologies) ënnert der folgender Vëlos Konditiounen vun entweder 35 (LTR gët No generéieren gesuergt ) oder 25 Monaco (aner): 95 ° C fir 1 min; 56 ° C (β-actin) oder 58 ° C (aner) fir 1 min; an 72 ° C fir 1 min. Déi folgend primer baut sech benotzt: fir bewosst Promoteur ët, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'an 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3 "; fir LTR Promoteur-ofgeleet gët, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'an 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3 "; fir d 'Säit vun GSDMB VerfÜgung, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3 "3 an 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3"; fir MYH11 VerfÜgung, 5'- CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'an 5'- CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; a fir β-actin VerfÜgung, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'an 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3 ". VerfÜgung Reporter Assay VerfÜgung A Frankräich ofgesprengt, aus -1080 zu +1053 vun GSDMB VerfÜgung a mat mat LA Taq Hot Start DNA polymerase (Takara) zu 35 Zykle vun 96 ° C fir 30 s an 68 ° C fir 2 min der LTR Promoteur, war vun Hinnen alleguer Implikatioune verstärkt, primer baut benotzt: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 "a 5 ' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ", an hin an engem pGL3 Basis Vecteure (Promega, Madison, allem). Et war mat der Restriktioun Siten gekierzt: Nhe VerfÜgung ech an Eco VerfÜgung R ech der -1035 zu +1053 ofgesprengt erstallt; KPN VerfÜgung ech an Eco VerfÜgung R ech fir -426 bis +1053; Nhe VerfÜgung ech an Afl VerfÜgung II fir -61 bis +1053; Nhe VerfÜgung ech an Eco VerfÜgung 81. ech fir +129 zu +1053; an Nhe VerfÜgung ech an Stu VerfÜgung ech fir +496 zu +1053. D'+496 zu +1053 reporter bauen war weider gekierzt mat Restriktioun Enzymen: Nhe VerfÜgung ech an Swa VerfÜgung ech fir +757 zu +1053; Nhe VerfÜgung ech an Pvu VerfÜgung II fir +860 zu +1053; Nhe VerfÜgung ech an Déifschlag VerfÜgung X ech fir +989 zu +1053; Xho VerfÜgung ech an Déifschlag VerfÜgung ech X fir +496 bis +989; Xho VerfÜgung ech an Pvu VerfÜgung II fir +496 bis +860; an Xho VerfÜgung ech an Swa VerfÜgung ech fir +496 bis +757. Fir weider truncation vun der +496 bis +989 ofgesprengt, Hinnen alleguer war mat der ofgesprengt als Skelett benotzt Ex Taq DNA polymerase (Takara) zu 35 Zykle vun 95 ° C fir 1 min, 58 ° C fir 1 min gesuergt, an 72 ° C fir 1 min, mat der folgender primer ausgedréckt: fir +562 bis +989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'an 5'- AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3 "; a fir +649 bis +989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'an 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3 ". No amplification, goufen Fragmenter an pGL4.12 [luc2CP VerfÜgung] Vecteure (Promega) gesaat. D'-1 KB Offloss Regioune vun CXCR4 VerfÜgung an CXCR7 VerfÜgung duerch Frankräich Hinnen alleguer mat MightyAmp DNA polymerase (Takara) zu 35 Zykle vun 98 ° C fir 10 ass bereet waren, 62 ° C fir 15 ass, an 68 ° C fir 2 min, mat der folgender primer ausgedréckt: fir CXCR4 VerfÜgung, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'an 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3 "; a fir CXCR7 VerfÜgung, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'an 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3 ". Dës Brochstécker hu sech an der pGL4.12 hin [luc2CP VerfÜgung] Vecteure. One microgram vun all bauen an de Renilla luciferase Kontroll reporter Vecteure (Praxis-SV40 Vecteure, Promega) geleet goufen durech-transfected an 1 × 10 5 Zellen mat SuperFect Transfection Reagent (QIAGEN). D'luciferase assay war 24 h no de Rapporteur Aféierung gesuergt, eng Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) benotzt. D'assay war zu triplicate duerchgefouert. VerfÜgung GSDMB VerfÜgung enhancer-HSVtk lentivirus Vecteure VerfÜgung A pMFG-HSVtk Vecteure vun RIKEN BRC duerch d'National Bio-Ressourcen-Projet vun der MEXT, Japan gëtt war, duerch Ugedriwwe vun Dr Hirofumi Hamada., an eng HSVtk cDNA war aus et als eng Nco VerfÜgung ech-Bam VerfÜgung Salut ofgesprengt excised. Fir d'GSDMB VerfÜgung enhancer-HSVtk lentivirus Vecteure bauen, éischter de +496 bis +989 ofgesprengt (GSDMB VerfÜgung enhancer) war an pcDNA3.1 gesaat (+) (Life Technologies) tëscht Nhe VerfÜgung ech an Hind
III Siten, an dann HSVtk cDNA war an der Vecteure op engem Bam VerfÜgung Salut Site vun der Forward (fir unzedoen-staarkt Ausdrock) hin oder ëmgedréint (fir antisense-staarkt Ausdrock) Richtung. Next, GSDMB VerfÜgung enhancer-HSVtk Sënn an GSDMB VerfÜgung enhancer-HSVtk antisense Fragmenter sech aus der vectors plasmid excised als Nhe VerfÜgung I-Net VerfÜgung sin Fragmenter an hin an pLVSIN-CMV Tendenz vectors tëscht der Xba VerfÜgung sin an net ech Siten VerfÜgung. Endlech, war e CMV Promoter vun der lentiviral gesond geläscht. Ze generéieren Haren Deelercher der vectors wouvun, huet de gesond agefouert an Lenti-X ™ 293 T BTS (Takara) benotzt Lenti-X ™ HTX duerf System (Takara). No 72 h'-incubation, war déi mëttel- gesammelt an d'Haren titer (cfu /ml) war vun transduction an HT-1080 Zellen an der Präsenz vun polybrene (5 μg /ML zu Kultur mëttelfristeg, Fläch-Aldrich) alles. D'Deelercher sech un hu-5A an 60As6 applizéiert (1 × 10 5 Zellen pro Plat, an triplicate) kënschtlech VerfÜgung an der Präsenz vun polybrene (5 μg /ml), an d'Zellen sech am mëttleren incubated wouvun Gancicrovir (GCV, 5 μg /mL, WAKO) fir 5 Deeg fir assays Zell Wuesstem. D'assays sech zu triplicate standing a P VerfÜgung -value vun Student d't VerfÜgung Azeton tëscht cultured Zellen mat (+) an ouni (-) GCV berechent war VerfÜgung Prefabrizéierten Haaptleit Maus Modell mat GSDMB enhancer-HSVtk vectors VerfÜgung Mir virdrun eng Maus Haaptleit Modell (Haaptleit Mais) confirméiert, datt déi intraperitoneal Sprëtz vun 60As6 Zellen [25] produzéiert gouf. 60As6GFP Zellen (1 × 10 6 Zellen pro Maus) waren an der peritoneal Discours vun 18 Mais heijen (6 Woch ale Mais vun CB17 /Icr-Prkdc &Si besteet; scid > /CrlCrlj Genotype: scid /scid, Charles River, Yokohama Japan) um Dag 1. De Mais goufen an zwou Gruppen ënnerdeelt; ee Grupp war mat der antisense Ausdrock Vecteure heijen, an déi aner Grupp war mat der Sënn Vecteure heijen; zwou Gruppen da waren intraperitoneally mat 2 ml vun PBS Léisung mat Haren ëm (5 × 10 5 cfu) an Ganciclovir (2 mg) op 8, 10 an 12 Dag heijen. Déi heeschen Iwwerliewe Zäit vun all Grupp an der P VerfÜgung -value vun Student d't VerfÜgung Azeton tëscht den zwou Gruppen waren berechent. D'Etude vun der National Cancer Center Comité op Déieren Experimenter ofgeseent gouf. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Umeldung vun enger enhancer Regioun an GSDMB VerfÜgung, déi Gene Ausdrock am GC Zellen fiert VerfÜgung de Promoteur /enhancer Regiounen ze identifizéieren déi géif an d'Entwécklung vun engem therapeutesch Vecteure fir peritoneal Publikatioun (Haaptleit) effikass ginn, gesichte mir éischt méi fir Genen dacks an diffusen-Typ GC ausgedréckt wéi am GC intestinal-Typ Komparativ Gentherapie Ausdrock Analyse tëscht 12 Primärschoul diffusen-Typen an 18 intestinal benotzt -types, well Haaptleit méi dacks zu diffusen-Typ GC gesinn wéi an der intestinal-Typ [22]. Mir gemierkt dass véier vun zéng Affymetrix GeneChip Studiebäihëllefe besot der héchster fantastesch-Ännerung fir Gentherapie Ausdrock vun diffusen-Typ GC Verglach zu intestinal-Typ weist sech Studiebäihëllefe capabel fir MYH11 VerfÜgung (myosin, markanter Kette 11, glat Muskel Gentherapie, Zousätzleche Fichier 1: Table S1). No confirméiert, datt d'Gentherapie net mesothelial zu der och mënschlech Zell Linn-5A begéint ausgedréckt gëtt (Donnéeën net gewisen), ausgewielt mir MYH11 VerfÜgung als staark Kandidat fir d'Gene deem Promoteur diffusen-Typ GC spezifesch Ausdrock vun HSVtk erméiglecht. Allerdéngs ass d'Gentherapie net zu 60As6 Zellen ausgedréckt, datt fir nees Haaptleit Modell Mais benotzt goufen (Zousätzleche Fichier 2: Dorënner S1). Et ass wahrscheinlech, datt MYH11 VerfÜgung zu Kriibs-verbonne Här iwert mech selwer ausgedréckt ass dat virun allem räich ginn an diffusen-Typ GC Stoffer. Next, aus der microarray analyteschen lass, verréckelt mir eis Opmierksamkeet ze Offloss Regioune vun CXCR4 VerfÜgung (chemokine (CXC Motif) receptor 4 Gentherapie) an CXCR7 VerfÜgung (chemokine (CXC Motif) receptor 7 Gentherapie), well souwuel sinn zu vill Zorte vu Kriibs an hunn eng wichteg Roll am Metastasen ausgedréckt [27]. Allerdéngs, reporter assays Hëllef, hunn mir datt de Offloss Regiounen vun dëse Genen souwuel d'begéint-5A an der 60As6 Zellen (Zousätzleche Fichier 2: Dorënner S2) zu transcriptionally aktiv waren, dass déi zousätzlech de Regiounen d'Expressioun vun HSVtk zu Mënsch mesothelial Zellen fueren zu VIVO VerfÜgung. Endlech, do hu mer op der GSDMB VerfÜgung Gentherapie, wéi eise virdrun Étude uginn, datt si staark am GC Stoffer an Zell Linnen ausgedréckt ass [14]. VerfÜgung GSDMB VerfÜgung ass vun zwee Promoteuren ausserdeem, bewosst a LTR Promoteuren ( Figebam. 1a), an d'Pai ass haaptsächlech zu normal Stoffer an zu Kriibs Zell Linnen benotzt [19-21]. Mir bestätegt dës Experienz vun enger performanter RT-Hinnen alleguer aus verschidden Zorte vun normal Stoffer op RNS Analysë (Figebam. 1b). RT-Hinnen alleguer op GC chirurgesch uplanzen bewisen, dass d'LTR Promoteur an 14 vun 15 intestinal-Typ GCs an 15 an 11 vun diffusen-Typ GCs benotzt gouf (Figebam. 1c). Figebam. 1 GSDMB VerfÜgung Gentherapie ass déi bewosst an LTR Promoteuren annescht. (En) E Sënn Illustratioun vun den zwee Promoteuren. (B) Expression vun zwee gët, eent vun bewosst Promoteur an déi aner vun LTR, an mënschlechen normal Stoffer (RT-Hinnen alleguer). Véier Varianten vun mënschlech GSDMB ët sinn zu GenBank ageschriwwen; Variant 1 (NM_001042471), Variant 2 (NM_018530), Variant 3 (NM_001165958) an abezuelt 4 (NM_001165959). Transkriptioun vun Varianten 1, 3 a 4 ass vun der bewosst Promoteur Hausse an déi vun Variant 2 ass vun der LTR Promoteur. Déi 3 'Säit vun der ungen GSDMB VerfÜgung ass gemeinsam un all. (C) Expression vun LTR ungen zu gastric Kriibs Stoffer, 15 intestinal-Typ an 15 diffusen-Typ Echantillon (RT-Hinnen alleguer op chirurgesch uplanzen) VerfÜgung Fir eng Regioun kritescher fir d'transcriptional Aktivitéit am GC Zellen identifizéieren, eng DNA ofgesprengt Rennsport -1080 zu +1053 BP, d'Positioun vun engem Transkriptiouns Start Site fir de LTR Promoteur, vom (Figebam. 2a). De Rapporteur assays op gekierzt DNA Fragmenter mat zwee GC Zell Linnen, HSC-57 an HSC-59, uginn, datt e +496 bis +989 Regioun staark transcriptional Aktivitéit huet, nach méi staark ewéi déi vun der Original -1080 zu +1053 ofgesprengt, an datt weider truncation vun der +496 bis +989 ofgesprengt schéinen däitleche Minus vun der transcriptional Aktivitéit (Figebam. 2b). Der Regioun fir dës ofgesprengt mat staarke transcriptional Aktivitéit entspriechend war GSDMB VerfÜgung enhancer genannt. Figebam. 2 Umeldung vun GSDMB VerfÜgung enhancer. (En) E Sënn Illustratioun weist reporter gesond an der luciferase assays benotzt. Laang Uschloss widerhuelen (LTR) Element vun mënschlech endogeneous Aen do ass duerch eng duebel-goldrichteg Pfeil gewisen. D'Positioun ass vun der Transkriptiouns Start Site fir d'Idealer vun der LTR Promoteur. (B) Luciferase assays mat zwee gastric Kriibs Zell Linnen, HSC-57 an HSC-59, Teamchef eng Regioun mat staarke transcriptional Aktivitéit, Rennsport aus +496 bis +989, déi als GSDMB VerfÜgung enhancer designéierte war. Vecteure, eidel reporter Vecteure, Bar, Norm deviation VerfÜgung Bau vun engem GSDMB VerfÜgung enhancer-Undriff HSVtk lentivirus Vecteure VerfÜgung Mir virdrun eng Maus Haaptleit Modell (Haaptleit Mais) confirméiert, datt déi intraperitoneal Sprëtz vun 60As6 Zellen produzéiert gouf [ ,,,0],25]; an dëser Etude, entwéckelt mir eng Haren therapeutesch Vecteure fir d'Behandlung vun Haaptleit Mais. Fir waat d'Stäerkt vun der transcriptional Aktivitéit vun GSDMB VerfÜgung enhancer zu 60As6, reporter assays huet gesuergt, andeems de Rapporteur fir den Offloss Regioune vun CXCR4 bauen VerfÜgung an CXCR7 VerfÜgung zum Vergläich. D'GSDMB VerfÜgung enhancer zougedréckt staark transcriptional Aktivitéit zu 60As6 Zellen wéi d'CXCR4 VerfÜgung oder den Offloss Regiounen VerfÜgung CXCR7, an, wichteg, d'GSDMB VerfÜgung enhancer hu ganz schwaach transcriptional Aktivitéit an Maus peritoneal mesothelial Zellen an erfëllt-5A, e Mënsch mesothelial Zell Linn (Figebam. 3). Dëst Resultat hindeit, datt d'GSDMB VerfÜgung enhancer erméiglecht bal ausschliesslech HSVtk Ausdrock vun 60As6 awer net zu mesothelial Zellen vun der peritoneal Discours vun den Haaptleit Mais, a wahrscheinlech net zu Mënsch peritoneal mesothelium. Figebam. 3 GSDMB VerfÜgung enhancer huet staark transcriptional Aktivitéit zu engem 60As6 Zell Linn. Luciferase assays mat dräi Zorte vun cultured Zellen: 60As6 Zellen datt fir nees peritoneal Publikatioun (Haaptleit) Modell Mais an dëser Etude, Primär- Kultur Zellen vun Maus peritoneal mesothelial Zellen an etabléiert Mënsch mesotherial Zell Linn hu-5A benotzt goufen. Bar, Norm deviation VerfÜgung Next, mir den Effet vun der HSVtk /GCV Therapie iwwerpréift der GSDMB VerfÜgung enhancer-Undriff benotzt HSVtk lentivirus Vecteure op 60As6 kënschtlech VerfÜgung (Figebam. 4A). D'Zuel vun 60As6 Zellen mat der lentivirus Vecteure transduced war bedeitend reduzéiert wann an mëttelgrouss mat GCV nà incubated; op der aner Hand, d'selwecht HSVtk /GCV Behandlung no keen Effet op d'Zell Zuel vu hu-5A (Figebam. 4B). Figebam. 4 HSVtk /GCV Therapie déi GSDMB VerfÜgung enhancer-Undriff lentivirus Vecteure benotzt verbessert d'Iwwerliewe Taux vun Haaptleit Mais. (En) E lentiviral therapeutesch Vecteure fir GSDMB VerfÜgung enhancer (Enh) -driven Ausdrock vun herpes Simplex Virus thymidine kinase (HSVtk). (B) Zell Prolifératioun assays op 60As6 a begéint-5A mat der therapeutesch Vecteure transduced, vun incubation an der mëttel- standing mat (+) /ouni (-) ganciclovir (GCV). (C) A regimen vun HSVtk /GCV Therapie fir Haaptleit Mais. Bar, Norm deviation, P VerfÜgung, P VerfÜgung -value vun Student d't VerfÜgung Azeton tëscht der cultured Zellen mat (+) an ouni (-) GCV. (D) Microscopic observation Schatzkummer eng kleng Bevëlkerung vun 60As6GFP Zellen (gréng fluorescence) implanted an Maus peritoneum um Dag 10. (E) Zuel vun erëmfonnt Mais no HSVtk /GCV Therapie mat de Sënn-staarkt ausdrécken Vecteure (rout) an mat engem antisense -strand ausdrécken Vecteure als Referenz (blo). Mengen Iwwerliewe Zäit vun all Grupp ass op der rietser Säit mat P VerfÜgung gewisen - Wäert vun Student d't VerfÜgung Azeton tëscht den zwou Gruppen VerfÜgung HSVtk /GCV Therapie vun Rulle Haaptleit Mais VerfÜgung Mir HSVtk /GCV applizéiert Therapie ze Haaptleit Mais. An dëser therapeutesch assay, bereet mer zwou Zorte vun der GSDMB VerfÜgung enhancer-Undriff lentivirus Vecteure: ee Vecteure de Sënn-staarkt vun HSVtk cDNA ausgedréckt an huet fir d'Behandlung vun Haaptleit Mais benotzt ginn, hierkommen, déi aner Vecteure der antisense-staarkt ausgedréckt a gouf als d'Kontroll benotzt. D'Therapie ass siwen Deeg an der intraperitoneal inoculation vun 60As6 Zellen ausdrécken gréng fluorescence FAQ (60As6GFP) huet. Dëst regimen war fir Behandlung vun Rulle Haaptleit Modell entworf an déi 60As6GFP Zellen an der peritoneal Discours diffusely engrafted waren (ausstinn. 4C, d). No dräi Schrëtt vun Behandlung, um Dag 36, keent vun den néng Mais behandelt mat HSVtk Sënn-Ausdrock Vecteure gestuerwe waren, iwwerdeems zwee vun den néng Referenzmaterial Mais schonn gestuerwen. Keen vun den néng Referenzmaterial Mais sech lieweg am Dag 57, i.e., aacht Wochen no Sprëtz vun 60As6GFP Zellen; Ee, véier vun néng therapeutesch Vecteure-behandelt Mais sech Lieweg (Figebam. 4e). Dëst Resultat hindeit, datt d'Behandlung hätt vun Rulle Haaptleit Mais verbessere kann. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung D'GSDMB VerfÜgung enhancer fiert Gentherapie Ausdrock am GC Zellen VerfÜgung mir gemellt Virdrun datt GSDMB VerfÜgung zu all GC ausgedréckt ass Stoffer a Zell Linnen iwwerpréift [14], an an dëser Etude bewisen mir datt de LTR Promoteur GSDMB VerfÜgung Ausdrock an 25 vun 30 GC uplanzen (Figebam. 1c) fiert. D'transcriptional Aktivitéit vun der LTR Regioun (Figebam. 2a) war virdrun vun reporter assays an Net-GC Zell Linnen bewisen [20, 21]. Allerdéngs hunn mir eng eegestänneg Regioun mat staarke transcriptional Aktivitéit an der afgerappt vun der LTR Regioun, an et als GSDMB VerfÜgung enhancer designéierte. Nieft der zwee GC Zell Linnen, HSC-57 an HSC-59, war d'transcriptional Aktivitéit vun dëser Regioun vun reporter assays an anere GC Zell Linnen fonnt, dorënner MKN74 (relativ luciferase Aktivitéit huet ongeféier 1,9), HSC-60 (29.4 ), HSC-42 (2,5) an HSC-44 (4,6), mee net am HSC-58 oder MKN28 (Donnéeën net gewisen) [14]. Sou gesäit d'GSDMB VerfÜgung enhancer net Gentherapie Ausdrock vun e puer GC Zellen fueren. VerfÜgung Truncation vun enger Regioun Rennsport +496 bis +562 bedeitend der transcriptional Aktivitéit vun der GSDMB VerfÜgung enhancer reduzéiert (Figebam. 2b, +562 bis +989). An der +496 bis +562 Regioun, hunn mir Konsens-verbindlech Siten vun e puer Transkriptiouns Faktoren, dorënner GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 an NFY-A, an huel-Wiessel un kenger vun dësen Konsens Message huet net de transcriptional Aktivitéit vun der enhancer Afloss (Daten dës net). D'Transkriptiouns Faktor datt mat der enhancer openee an dréit op seng transcriptional Aktivitéit identifizéiert nach net gouf. VerfÜgung Programm vun der therapeutesch lentivirus Vecteure fir Behandlung vu mënschlechen Rulle Haaptleit VerfÜgung Curative Therapie huet fir Haaptleit net gi gegrënnt. GC Patienten mat macroscopic Haaptleit hunn aarmséileg prognoses, mat engem Steiren globale Iwwerliewe vun 3-6 Méint. Déi mat nëmmen microscopic Haaptleit och en armen hätt hunn; hir 5-Joer Iwwerliewe Taux ass 0-18% [28]. Dofir ass et wichteg Rulle Haaptleit vun cytologic Ënnersiche vun peritoneal lavage Flesseggassystem z'entdecken an komplett Kriibs Zellen am peritoneal Discours z'encouragéieren. Meta-Analysë vun Cabalag et al VerfÜgung. uginn, déi grousss intraperitoneal lavage (Eipl, gestallt Salins 1 Dreck /dodrunner, 10 mol) an intraoperative intraperitoneal Chimiotherapie (IIPC) mat cisplatin 5-Joer globale Iwwerliewe zu méi wéi 40% wesentlech verbessert [28]. D'Resultater vun eiser Etude weist dass HSVtk /GCV Therapie déi lentivirus Vecteure verbessert hätt vun Patienten onofhängeg benotzt, a mir huelen et wéi enger Konsolidéierung Therapie benotzt ginn. Staark erhéijen mat diffusen Wuesstem sinn zesummegesat aus ville myofibroblasts a puer kritt (e.g., diffusen-Typ GCs, pancreatic Cancers an scirrhous Typ vun Broscht Kriibs). Demno op d'Konditioune vun der microenvironment, wéi Nährwert hunn, weisen dës erhéijen eng héich prevalence vun selten-proliferative entholl Zellen. Sou, diffusen-Typ GC Zellen am peritoneal Discours disseminated vläicht vun enger Populatioun aus, datt de cytotoxic Effet vun cisplatin widderstoen kann. D'lentivirus therapeutesch Vecteure kann HSVtk an zwee proliferating an Net-proliferating Zellen aféieren. Ausserdem erméiglecht de GSDMB VerfÜgung enhancer GC Zell-spezifesch HSVtk Ausdrock. Dëst beschränkt Ausdrock Louhecke mesothelial Zell Schued, dass déi zousätzlech der Gentherapie benotzt Schrëtt héich genuch standing kënnen ze misst GC Zellen z'encouragéieren, souguer déi resistent cisplatin, an Rulle Haaptleit. Et ass wahrscheinlech, datt geschéckt Therapie, Eipl an IIPC, gefollegt vun HSVtk /GCV Therapie déi lentivirus Vecteure benotzt, wäert de Iwwregens hätt vun Rulle Haaptleit méi däitlech wéi d'Eipl an IIPC geschéckt Therapie eleng verbesseren. Mir gleewen, datt dat regimen wiirdeg ass op Medeziner Prozesser Faarwe vu Wiesen. Obwuel et datt d'enhancer VerfÜgung GSDMB schéngt net an e puer GC Zellen heescht Aarbecht, déngt weider Studien um zousätzlech GC-spezifesch enhancers Erkenntnesser, gëtt dëse Problem léisen. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung D'GSDMB VerfÜgung -driven HSVtk Ausdrock Vecteure haten eng therapeutesch Wierkung op d'Rulle Haaptleit Modell Mais. Dës Strategie kann eventuell benotzt ginn GC Patienten ze vermeiden aus Haaptleit Kontrakt an och mat Haaptleit unzegesin GC Patienten benotzt. VerfÜgung Deklaratioune VerfÜgung Wat VerfÜgung Dës Etude gouf vun engem Stipendie-zu-Hëllef ënnerstëtzt fir wëssenschaftlech Fuerschung (C .) vun der Japan Society fir d'Promotioun vun Science (JSPS KAKENHI Grant Number 23501322) VerfÜgung Weider Fichieren Weider Fichier 1 VerfÜgung: Table S1. Top Ten Studiebäihëllefe baut weist Ausdrock spezifesch ze diffusen-Typ gastric Kriibs. Weider Fichier 2: Dorënner S1. MYH11 VerfÜgung ass net am gastric Kriibs Zell Linnen ausgedréckt. Promoteur Regioun vu béiden CXCR4 VerfÜgung an CXCR7 VerfÜgung Genen weist eng transcriptional Aktivitéit zu souwuel 60As6 a begéint-5A Zellen. Konkurréiert Interessen VerfÜgung D'Auteuren erklären si hu keng Competitioun Interessen. VerfÜgung Auteuren 'Contributiounen VerfÜgung NS an t entworf a Regisseur dëser Etude. NS standing biologescher analyséiert an Déier Experimenter mat Ënnerstëtzung vun rk, FC a Ky. All Auteuren liesen an guttgeheescht der Finale mëttelalterlech Handschrëft. VerfÜgung

• Gastric Kriibs bei enger Universitéit geléiert Spidol am nordwestlechen Tanzania: eng Retrospektiv review vun 232 cases
• Den Impakt vun den Entrée Diagnos op gastric emptying zu kritesch krank Patienten