Um vector GSDMB-driven potenciador HSV timidina cinase-expressando para controlar a disseminação peritoneal oculto das células cancerosas gástricas

A GSDMB
-driven potenciador HSV timidina cinase-expressando vector para controlar a disseminação peritoneal oculto das células cancerosas gástricas da arte abstracta
Fundo
O câncer gástrico (GC) é uma das principais doenças malignas em todo o mundo, especialmente em Ásia, e Japão e Coréia têm a maior incidência no mundo. Porque a maioria dos casos refratários a terapias morrer devido à disseminação peritoneal (DP) das células cancerosas, controlando PD é importante para a sobrevivência do paciente. GSDMB
é um membro da família de genes gasdermin. Porque GSDMB
é expressa em muitos tipos de cancro, incluindo GC, é provável que o gene contém uma região reguladora que é utilizado para a terapia da DP oculto através da expressão específica de célula de cancro de genes citotóxicos.
Métodos
Realizou-se ensaios de repórter para identificar a região reguladora para a expressão específica de célula de cancro. Nós também construído um vector lentiviral terapêutico que expressa o vírus herpes simplex timidina cinase (tk do HSV) de um modo específico de células de GC, e testaram num modelo de ratinho de PD.

Resultados Identificou-se a região reguladora a 496 a 989 do GSDMB
local de início da transcrição e designou-o como um GSDMB
potenciador. O vector lentiviral proliferação terapêutico suprimida de uma linha celular de GC, 60As6, in vitro
na presença de ganciclovir, e a administração intraperitoneal do vector prolongou a duração de sobrevivência dos ratinhos que foram inoculados por via intraperitoneal com 60As6 uma semana antes da administração.
Conclusões of the GSDMB
-driven HSVtk vetor de expressão teve um efeito terapêutico sobre as ocultas ratos modelo PD. Esta estratégia pode potencialmente ser utilizada para tratar doentes com PD GC. Palavras-chave

neoplasias do estômago cavidade peritoneal terapia genética HSV timidina quinase do fundo
cancro gástrico (GC) é uma das principais doenças malignas, especialmente na Ásia, e a segunda causa principal de mortes associadas a cancro em todo o mundo [1]. É geralmente classificado em dois tipos (classificação de Lauren) [2], intestinal e difuso, que são pensados ​​para refletir sua patogênese [3]. O tipo difuso GC (DGC) é sub-classificados como mal GC (tipo não-sólida) diferenciada ou indiferenciada GC no sistema de classificação Cancer Association japonesa gástrica [4]. DGC é infiltrativas e muitas vezes mostra invasão agressiva na parede gástrica, resultando em metástase e a propagação de células de GC na cavidade peritoneal (disseminação peritoneal, PD).
GC As células disseminadas na cavidade peritoneal dar origem a carcinomatose peritoneal ( PC) [5]. PC faz com que os sintomas gastrintestinais, tais como dor abdominal, náuseas e vómitos, bem como sintomas sistêmicos, como perda de peso e ascite. PC não se deteriora única fortemente a qualidade de vida dos pacientes de GC, mas é também a principal causa de morte em GC [6]. Com cuidados de suporte sozinho, a média de sobrevivência de pacientes com PC é de 3-6 meses [7]. Se tratados com quimioterapia sistémica, da mesma maneira que para as outras lesões metastáticas, PC mostra uma resposta mais fraca ao tratamento de outros tipos de metástase em GC, principalmente por causa da má distribuição do agente quimioterapêutico na cavidade peritoneal. Portanto, os recentes esforços concentraram-se em terapias inovadoras de PC, como a combinação de cirurgia citorredutor, a terapia térmica, e quimioterapia intraperitoneal. Estas abordagens combinadas foram ligeiramente melhorado o prognóstico de PC, embora o período médio de sobrevivência é ainda menos de 12 meses, o que torna claro que há um limite prático para a eficácia de citorredução cirúrgica [8, 9]. Estudos recentes sugerem que é importante para identificar os pacientes do GC com PD oculto através da realização de um exame citológico do lavado peritoneal, porque esses casos mostraram melhor prognóstico se obteve conversão para citologia negativa por extensa lavagem peritoneal intra-operatória seguida de quimioterapia intraperitoneal [10].
O conceito de terapia contra o câncer "gene suicida", usando vírus herpes simplex timidina quinase (tk do HSV), surgiram na década de 1980 [11]. HSVtk catalisa a fosforilação do ganciclovir análogo de guanosina (GCV) em uma forma de monofosfato, que é depois fosforilado por cinases celulares de nucleótidos trifosfato de ganciclovir em altamente tóxicos [12]. O ganciclovir blocos de trifosfato de replicação do DNA, conduzindo à paragem do ciclo celular e morte celular [13]. A terapia envolve a transferência de tk do HSV em células cancerosas, seguido por administração GCV, é conhecido como terapia de gene suicida, e esta técnica foi recentemente utilizada num ensaio clínico de fase III em glioblastoma multiforme [12].
Neste estudo, nós desenvolvemos uma terapêutica vector que expressa o tk do HSV em células cancerosas, utilizando uma região reguladora do gene gasdermin B (GSDMB
). GSDMB
é um membro da família gasdermin (GSDM
), que consiste em quatro genes, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC Comprar e GSDMD
[14, 15], e é expressa em células de epitélio normal proliferando e também em muitos tipos de cancro, incluindo esofágico, gástrico, fígado, cólon, colo uterino e cancros da mama [14, 16-18]. GSDMB
a expressão é conduzida por dois promotores, o promotor celular e promotor LTR-derivado [19-21]. O promotor LTR-derivado (LTR) é activo na maioria dos tecidos normais, excepto o estômago, e em muitas linhas celulares de cancro, enquanto que o promotor celular é activa no tecido do estômago normal e em algumas linhas celulares de cancro [20]. Neste estudo, foi identificada uma região a jusante do promotor LTR, que mostrou actividade de transcrição forte em linhas celulares de GC. Nós usamos esta região para construir um vector viral HSVtk-expressão para controlar PD ocultismo.
Métodos
tecidos humanos
O câncer gástrico (CG) tecidos foram fornecidos pelo National Hospital Cancer Center após a obtenção do consentimento informado por escrito de cada paciente, que foi aprovado pelo Cancer Center Institutional Review Board Nacional (ID: No.17-030). Os espécimes de tecido foram imediatamente congeladas com azoto líquido após extracção cirúrgica, e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Microarray Analysis
O ARN total foi isolado por suspensão das células em tampão de lise ISOGEN (Nippon Gene, Toyama, Japão) seguido por precipitação com isopropanol. Foram realizadas análises de expressão usando Humano expressão de matriz U95A versão 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA) de acordo com os protocolos dos fornecedores. O valor da expressão (diferença média: AD) de cada gene foi calculada utilizando GeneChip Analysis Software Suite versão 4.0 (Affymetrix). agrupamento hierárquico dos dados microarray foi realizada utilizando GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), Microsoft Excel e Cluster & TreeView [22, 23]. Todos os dados de microarranjos foram depositados em um banco de dados compatível Miame, GEO (número de acesso; GSE47007). Por Wilcoxon u
-test (p Art < 0,05) e mostrando uma mudança de 2 vezes, genes expressos especificamente no tipo difuso GC foram selecionados [22] As linhas celulares
e cultura primária de mouse. células mesoteliais
Três linhas de células de cancro gástrico, HSC-57, derivados de tipo intestinal GC, e HSC-59 e HSC-60, ambas derivadas de tipo difuso-GC, foram estabelecidas e caracterizadas por um dos autores [24 ]. SNU16, derivado do tipo difuso GC, foi fornecida a partir da American Type Culture Collection (ATCC), duas outras linhas de células com eficiência na produção de ratinhos DP, 60As6 e 60As6GFP (60As6 expressam a proteína de fluorescência verde), foram estabelecidas pelos autores do difusa do tipo GC derivado linha de células HSC-60 depois de várias passagens do transplante intraperitoneal a ratinhos [25]. CC-2511, uma linha celular de fibroblastos, foi adquirido a partir de Lonza, Japão (Tóquio, Japão). Todas as linhas celulares foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium. células mesoteliais de rato foram colhidas por injecção de 10 ml de solução /EDTA aquecida até 0,25% de tripsina para a cavidade peritoneal [26]. As células foram incubadas durante 3 dias em meio RPMI-1640 suplementado com L-glutamina, vermelho de fenol e HEPES (WAKO, Tóquio, Japão). Met-5A, uma linha de células de mesotélio humano, foi fornecida pela ATCC e mantidas em meio 199 (Life Technologies, Tóquio, Japão), suplementado com 3,3 nM de EGF (Life Technologies), 400 nM de hidrocortisona (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO EUA), 870 nM de insulina (Life Technologies) e 10% de FBS.
de RT-PCR a partir de ARN total
órgãos humanos normais foram adquiridos a Biochain, Hayward, CA. Os ARNs totais foram extraídos utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tóquio, Japão). Depois de gerar ADNc de primeira cadeia a partir de ARN total utilizando ThermoScript RT-PCR System (Life Technologies, Tóquio Japão), por PCR foi realizada com AccuPrime ™ Pfx ADN Polimerase
(Life Technologies) de acordo com as seguintes condições de ciclização quer de 35 (transcritos de LTR ) ou 25 ciclos (entre outras): 95 ° C durante 1 min; 56 ° C (β-actina) ou 58 ° C (outros) durante 1 min; e 72 ° C durante 1 min. Foram utilizados os seguintes conjuntos de iniciadores: para promotor de transcrição celular, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'e 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; para LTR transcritos derivados do promotor, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'e 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; para 'lado de GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3' e 5'-3 ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3 '; para MYH11
, 5'- CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'e 5'CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; e para a β-actina
, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'e 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3'.
Reporter Assay
Um fragmento genómico, -1.080-1053 de GSDMB
e contendo o promotor LTR, foi amplificado por PCR usando polimerase Taq LA Iniciar ADN quente (Takara), em 35 ciclos de 96 ° C durante 30 s e 68 ° C durante 2 min, utilizando conjuntos de iniciadores: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'e 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', e inserido num vector básico pGL3 (Promega, Madison, WI). Ele foi truncado utilizando os locais de restrição: Nhe
I e Eco
R I para gerar a -1.035-1053 fragmento; Kpn
I e Eco
R I para -426 a 1053; Nhe
I e Afl
II para -61 1053; Nhe
I e Eco
81 I de 129-1053; e Nhe
I e Stu
I para 496-1053. A construção 496-1053 repórter foi ainda mais truncada com enzimas de restrição: Nhe
I e Swa
I para 757-1053; Nhe
I e Pvu
II para 860-1053; Nhe
I e Bst
X I para 989-1053; Xho
I e Bst
X I para 496-989; Xho
I e Pvu
II para 496-860; e Xho
I e Swa
I para 496-757. Para mais truncamento do fragmento 496-989, a PCR foi realizada com o fragmento como modelo, utilizando polimerase de ADN Taq Ex (Takara), em 35 ciclos de 95 ° C durante 1 min, 58 ° C durante 1 min, e 72 ° C durante 1 min, utilizando os seguintes conjuntos de iniciadores: para 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'e 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; e para 649-989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'e 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Após a amplificação, os fragmentos foram inseridos no vector de pGL4.12 [
luc2CP] (Promega). As regiões -1 kb a montante de CXCR4
e CXCR7
foram preparados por PCR genómico utilizando polimerase de ADN MightyAmp (Takara), em 35 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 62 ° C durante 15 s, e 68 ° C durante 2 minutos, utilizando os seguintes conjuntos de iniciadores: para CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'e 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; e para CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'e 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Estes fragmentos foram inseridos no [luc2CP
] pGL4.12 vector. Um micrograma de cada construção e o controlo de luciferase de Renilla vector repórter (pRL-SV40 vector, Promega) foram co-transfectados em 1 × 10 5 células usando SuperFect Transfection Reagent (Qiagen). O ensaio de luciferase foi realizada 24 horas após a introdução repórter, utilizando um Sistema de Ensaio Repórter Dual-Luciferase (Promega). O ensaio foi realizado em triplicado.
GSDMB
potenciador-HSVtk lentivírus vetor
Um vector PMFG-tk do HSV foi fornecida por RIKEN BRC através do Projeto Nacional de Bio-Recursos do MEXT, Japão, por cortesia do Dr. . Hirofumi Hamada, e um cDNA HSVtk foi excisada a partir dele como um Nco
I-Bam
fragmento HI. Para construir o GSDMB
intensificador-HSVtk vector de lentivírus, em primeiro lugar o fragmento 496-989 (GSDMB
potenciador) foi inserido no pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) entre
Nhe I e Hind
locais III, e em seguida cDNA HSVtk foi inserido no vector em um local
HI Bam na frente (para a expressão sentido passadas) ou para trás (para a expressão antisense passadas) direção. Em seguida, GSDMB
sentido intensificador-tk do HSV e GSDMB
fragmentos anti-sentido intensificador-HSVtk foram excisadas a partir dos vectores plasmídicos como
Nhe I-not * eu fragmentos e inserido em vectores de CMV pLVSIN-neo entre Xba
I e Not I
sites. Finalmente, um promotor de CMV foi removido a partir das construções de lentivírus. Para gerar partículas virais contendo os vectores, as construções foram introduzidas em Lenti-X ™ 293 células T (Takara) usando Lenti-X ™ Sistema HTX Embalagem (Takara). Após 72 h'-incubação, o meio foi recolhido e o título virai (ufc /mL) foi determinada por transdução nas células HT-1080 na presença de polibreno (5 ug /ml em meio de cultura, Sigma-Aldrich). As partículas foram aplicados a Met-5A e 60As6 (1 × 10 5 células por placa, em triplicado) in vitro
na presença de polibreno (5 ug /ml), e as células foram incubadas em meio contendo Gancicrovir (GCV, 5 ug /ml, WAKO), durante 5 dias para os ensaios de crescimento celular. Os ensaios foram realizados em triplicado e P
-valor de t de Student
-test entre as células cultivadas com (+) e sem (-) GCV foi calculada
Tratamento de modelo de ratinho com PD GSDMB vetores potenciador-HSVtk
já relatado anteriormente um modelo PD rato (ratos PD), que foi produzido por injeção intraperitoneal de células 60As6 [25]. 60As6GFP células (1 × 10 6 células por rato) foram injectadas na cavidade peritoneal de 18 ratinhos (ratinhos seis semanas de idade de CB17 /ICR-Prkdc < SCID > /CrlCrlj Genótipo: scid /scid, Charles River, Yokohama Japan) no dia 1. Os ratinhos foram divididos em dois grupos; um grupo foi injectado com o vector de expressão anti-sentido, e o outro grupo foi injectado com o vector de sentido; ambos os grupos foram então injectados intraperitonealmente com 2 ml de solução de PBS contendo partícula viral (5 × 10 5 CFU) e ganciclovir (2 mg) em 8, 10 e 12 dias. O tempo médio de sobrevivência de cada grupo e da P
-valor de t de Student
-test entre os dois grupos foram calculados. O estudo foi aprovado pela Comissão Nacional de Cancer Center em Experimentação Animal.

Resultados da Identificação de uma região potenciador em GSDMB
, que dirige a expressão do gene em células GC
Para identificar as regiões promotor /intensificador que seria eficaz no desenvolvimento de um vector terapêutico para difusão peritoneal (PD), que em primeiro lugar procurado para os genes mais frequentemente expressos em tipo difuso de GC do que no tipo intestinal GC usando a análise de expressão do gene comparativa entre 12 difuso tipos primários e 18 intestinal -Tipos, porque PD é mais freqüentemente visto no tipo difuso GC do que no tipo intestinal [22]. Percebemos que quatro dos dez Affymetrix GeneChip conjuntos de sondas que mostra o maior fold-change para a expressão de genes em-tipo difuso GC comparado com o tipo intestinal foram conjuntos de sondas para MYH11
(miosina, cadeia pesada 11, gene do músculo liso, arquivo adicionais 1: Tabela S1). Após a confirmação de que o gene não é expresso na linha de células mesoteliais humanas imortalizadas Met-5A (dados não mostrados), que selecionado MYH11
como um forte candidato para o gene cujo promotor permite a expressão específica do tipo difuso GC de tk do HSV. No entanto, o gene não é expresso em 60As6 células que foram usados ​​para fazer ratos modelo PD (arquivo adicional 2: Figura S1). É provável que MYH11
é expresso em fibroblastos associadas a cancro que são especialmente abundantes em tecidos GC-tipo difuso. Em seguida, sair da análise de dados de microarrays, nós deslocamos nossa atenção para regiões a montante de CXCR4
(receptor 7 gene de quimiocina (motivo CXC)) (quimiocina (motivo CXC) receptor 4 gene) e CXCR7
, pois ambos são expressos em muitos tipos de cancro e tem um papel importante na metástase [27]. No entanto, usando ensaios de repórter, descobriu-se que as regiões situadas a montante destes genes foram transcricionalmente ativo tanto no células 60As6 (arquivo adicional 2: Figura S2) reuniu-5A e, o que implica que as regiões dirigir a expressão de tk do HSV em células mesoteliais humanas in vivo
. Finalmente, nós nos concentramos em gene da GSDMB
, como nosso estudo anterior indicou que é fortemente expresso em tecidos GC e linhas celulares [14].
GSDMB
é transcrito por dois promotores, celulares e promotores de LTR ( a Fig. 1a), e o último é usado principalmente em tecidos normais e em linhas celulares de cancro [19-21]. Confirmámos estas descobertas por realizar as análises de RT-PCR em ARN de diferentes tipos de tecidos normais (Fig. 1b). RT-PCR em CG espécimes cirúrgicos demonstraram que o promotor LTR foi usado em 14 dos 15 do tipo intestinal GC e em 11 de 15 GC-tipo difuso (Fig. 1C). FIG. gene 1 GSDMB
é transcrito pelos promotores celulares e LTR. (A) uma ilustração esquemática dos dois promotores. (B) Expressão de dois transcritos, por um promotor celular e o outro por LTR, em tecidos humanos normais (RT-PCR). Quatro variantes de transcrição GSDMB humana são registrados no GenBank; Variante 1 (NM_001042471), variante 2 (NM_018530), variante 3 (NM_001165958) ea variante 4 (NM_001165959). A transcrição de variantes 1, 3 e 4 é conduzida pelo promotor celular e que da variante 2 é pelo promotor LTR. O lado 3 'do GSDMB
transcritos é comum a cada um. (C) A expressão de transcritos de LTR em tecidos de cancro gástrico, 15-intestinal tipo e 15 amostras do tipo difuso (RT-PCR em amostras cirúrgicas)
Para identificar uma região crítica para a actividade de transcrição em células de GC, um fragmento de ADN abrangendo -1.080-1053 pb, a posição de um local de iniciação da transcrição para o promotor LTR, foi isolado (Fig. 2a). Os ensaios de repórter sobre fragmentos de ADN truncadas utilizando duas linhas celulares de GC, a HSC-57 e HSC-59, indicaram que uma região 496-989 tinha uma forte actividade de transcrição, ainda mais forte do que a do original -1.080-1053 fragmento, e ainda que o truncamento do fragmento 496-989 resultou na redução significativa da actividade de transcrição (Fig. 2b). A região correspondente a esse fragmento com actividade de transcrição forte foi nomeado GSDMB
potenciador. FIG. 2 Identificação de GSDMB
potenciador. (A) uma ilustração esquemática que mostra construções repórter utilizados nos ensaios de luciferase. elemento de repetição longa terminal (LTR) de retrovírus endógeno humano é mostrado por uma seta dupla. A posição é a partir do local de início da transcrição para o transcrito do promotor LTR. (B) Os ensaios de luciferase, utilizando duas linhas celulares de cancro gástrico, HSC-57 e HSC-59, revelou uma região com forte actividade de transcrição, abrangendo 496-989, que foi designado como GSDMB
potenciador. Vector, vazio vector repórter, Bar, desvio padrão
Construção de um GSDMB
-driven potenciador HSVtk lentivírus vetor
Nós relatado anteriormente um modelo de rato PD (ratos PD), que foi produzido por injeção intraperitoneal de células 60As6 [ ,,,0],25]; Neste estudo, foi desenvolvido um vector virai terapêutico para o tratamento de ratinhos DP. Para examinar a força da actividade transcricional do potenciador em GSDMB
60As6, ensaios de repórter foram realizadas, utilizando o repórter construir para as regiões a montante de CXCR4
e CXCR7
para comparação. O GSDMB
potenciador mostrou forte actividade de transcrição em células 60As6 do que o
CXCR4 ou a CXCR7
regiões situadas a montante, e, mais importante, o intensificador GSDMB
tinha actividade transcricional muito fraca em células mesoteliais peritoneais de rato e em met-5A, uma linha de células de mesotélio humano (Fig. 3). Este resultado sugere que a GSDMB
potenciador permite expressão tk do HSV quase exclusivamente em 60As6 mas não em células mesoteliais da cavidade peritoneal dos murganhos PD, e, provavelmente, não no mesotélio peritoneal humana. FIG. 3 GSDMB
intensificador tem actividade de transcrição forte na célula de uma linha 60As6. Os ensaios de luciferase com três tipos de células: as células cultivadas 60As6 que foram utilizados para fazer ratinhos modelo disseminação peritoneal (DP) no presente estudo, as células de cultura primária de células mesoteliais peritoneais de ratinho e a linha celular humana estabelecida mesotherial Met-5A. Bar, desvio padrão
Em seguida, examinou-se o efeito da terapia com tk do HSV /GCV usando o GSDMB
-driven potenciador HSVtk lentivirus vector em 60As6
in vitro (Fig. 4a). O número de células 60As6 transduzidas com o vector de lentivírus foi significativamente reduzida quando incubadas em meio suplementado com GCV; Por outro lado, o mesmo tratamento tk do HSV /GCV não teve efeito sobre o número de células de Met-5A (Fig. 4b). FIG. 4 terapia HSVtk /GCV usando o GSDMB
-driven potenciador lentivírus vetor melhorou a taxa de sobrevivência de ratos com DP. (A) Um vector lentiviral terapêutico para GSDMB
potenciador (ENH) -driven expressão de vírus de herpes simplex timidina cinase (tk do HSV). (B) ensaios de proliferação celular em 60As6 e Met-5A transduzidas com o vector terapêutico, realizada por incubação no meio com (+) /sem (-) o ganciclovir (GCV). (C) Um regime de terapia HSVtk /GCV para ratos DP. Bar, desvio padrão, P
, P
-valor de t de Student
-test entre as células cultivadas com (+) e sem (-) GCV. (D) A observação microscópica exibiu uma pequena população de células 60As6GFP (fluorescência verde) implantadas no peritônio do mouse no dia 10. (e) Número de ratos sobreviveram após a terapia HSVtk /GCV com o sentido de cadeia expressar vetor (vermelho) e com um antisense -Strand expressar vector como referência (azul). O tempo médio de sobrevivência de cada grupo é mostrado no lado direito com P viajantes - valor do estudante de t
-test entre os dois Grupos em terapia HSVtk /GCV de ratos DP ocultas
Aplicamos HSVtk /GCV terapia para ratinhos DP. Neste ensaio terapêutico, preparamos dois tipos de GSDMB
vector dirigido por lentivírus-potenciador: um vector de expresso no sentido de ADNc de cadeia tk do HSV e foi utilizado para o tratamento de ratinhos com TP, enquanto que o outro vector expressa o anti-sentido de cadeia e foi utilizado como controlo. A terapia foi iniciado sete dias após a inoculação intraperitoneal de células 60As6 expressando a proteína fluorescente verde (60As6GFP). Este regime foi concebido para o tratamento de modelo PD oculto em que as células foram 60As6GFP difusamente enxertado na cavidade peritoneal (Figs. 4c, d). Após três doses de tratamento, no dia 36, ​​nenhum dos nove ratinhos tratados com HSVtk vector de expressão-sentido morreu, enquanto dois dos nove murganhos de referência já tinha morrido. Nenhum dos ratinhos de referência nove estavam vivos no dia 57, isto é, oito semanas após a injecção das células 60As6GFP; No entanto, quatro dos nove ratinhos tratados com terapêuticas vetor ainda estavam vivos (Fig. 4e). Este resultado sugere que a terapia pode melhorar o prognóstico de ratos DP ocultas.
Discussão
O GSDMB
potenciador dirige a expressão do gene em células GC
Anteriormente, relatou que GSDMB
é expressa em todos GC tecidos e linhas celulares examinadas [14], e neste estudo demonstrou-se que o promotor conduza a expressão LTR GSDMB
em 25 de 30 amostras de GC (Fig. 1C). A actividade de transcrição da região de LTR (Fig. 2a) foi previamente demonstrada por ensaios de repórter em linhagens de células não-GC [20, 21]. No entanto, encontramos uma região distinta, com forte atividade transcricional na jusante da região LTR, e designou-o como GSDMB
potenciador. Para além das duas linhas de células de GC, HSC-57 e HSC-59, a actividade de transcrição da região foi detectada por ensaios de repórter em outras linhas de células de GC, incluindo MKN74 (actividade de luciferase relativa era de aproximadamente 1,9), a HSC-60 (29,4 ), SH-42 (2,5) e HSC-44 (4,6), mas não em HSC-58 ou MKN28 (dados não mostrados) [14]. Deste modo, o intensificador de GSDMB
não dirige a expressão do gene em algumas células GC.
Truncamento de uma região que abrange 496-562 reduziu significativamente a actividade transcricional do potenciador GSDMB
(Fig. 2b, 562 para 989). Em 496-562 região, encontramos locais de vários fatores de transcrição, incluindo GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 e NFY-A, e base de substituição em qualquer uma dessas sequências de consenso de ligação de consenso fez não afecta a actividade transcricional do potenciador (dados não mostrados). O factor de transcrição que interage com o intensificador e contribui para a sua actividade de transcrição ainda não foram identificados.
Aplicação do vector de lentivírus terapêutico para o tratamento da DP oculto humano
terapia curativa não foi estabelecida para o TP. pacientes GC com DP macroscópica tem mau prognóstico, com uma sobrevida global mediana de 3-6 meses. Aqueles com apenas PD microscópica também têm um prognóstico pobre; sua taxa de sobrevivência de 5 anos é 0-18% [28]. Portanto, é importante para detectar PD oculto por exame citológico de fluido de lavagem peritoneal e completamente erradicar as células cancerosas no interior da cavidade peritoneal. Meta-análises por Cabalag et al
. indicou que extensa lavagem intraperitoneal (EIPL, salina fisiológica 1 litro /dose, 10 vezes) e intra-operatório quimioterapia intraperitoneal (IIPC) com cisplatina melhorou significativamente a sobrevida global em 5 anos a mais de 40% [28]. Os resultados do nosso estudo sugerem que a terapia HSVtk /GCV usando o vetor lentivírus melhora o prognóstico dos pacientes de forma independente, e nós assumimos que será usado como uma terapia de consolidação. tumores sólidos com um crescimento difuso são compostas de muitas miofibroblastos e poucos vasos (por exemplo, difusa do tipo GCs, cancros pancreáticos e tipo scirrhous de câncer de mama). Dependendo das condições do microambiente, tais como a deficiência de nutriente, estes tumores apresentam uma elevada prevalência de células de tumor raramente-proliferativas. Assim, as células de GC-tipo difuso disseminadas na cavidade peritoneal podem consistir de uma população que pode resistir ao efeito citotóxico de cisplatina. O vector terapêutico lentivírus pode introduzir tk do HSV em ambas as proliferativas e não das células em proliferação. Além disso, o intensificador de GSDMB
permite a expressão específica de células tk do HSV GC. Isto minimiza os danos expressão restrita de células mesoteliais, o que implica que a terapia génica pode ser realizada utilizando doses elevadas o suficiente para erradicar completamente células GC, mesmo os que são resistentes a cisplatina, na DP oculto. É provável que a terapia de combinação, e EIPL IIPC, seguido por terapia de tk do HSV /GCV utilizando o vector de lentivírus, vai melhorar o prognóstico de PD oculta de forma mais significativa do que a terapia de combinação e EIPL IIPC sozinho. Acreditamos que este regime é digno de ser colocado em ensaios clínicos. Embora pareça que o GSDMB
potenciador não funciona em algumas células GC, mais estudos visando identificar potenciadores específicos de CG adicionais, irá resolver este problema.
Conclusões of the GSDMB
-driven HSVtk expressão vector teve um efeito terapêutico sobre as ocultas ratinhos modelo PD. Esta estratégia pode potencialmente ser usado para impedir que os pacientes do GC de contrair PD e também usado para tratar pacientes com GC PD.
Declarações
Reconhecimento
Este estudo foi apoiado por uma Grants-in-Aid para a Investigação Científica (C .) pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS KAKENHI Grant Número 23.501.322)
arquivos adicionais
arquivo adicionais 1: Tabela S1. Top dez conjuntos de sondas que mostram expressão específica para difundir-tipo de câncer gástrico. arquivo adicional 2: Figura S1. MYH11
não é expresso em linhas celulares de cancro gástrico. Uma região promotora de ambos CXCR4
e CXCR7
genes mostra uma actividade de transcrição em células tanto 60As6 e Met-5A. interesses concorrentes
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes. contribuições
dos autores
NS e HS projetado e dirigiu este estudo. NS realizadas análises biológicas e experiências com animais com o apoio da RK, FC e KY. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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• O impacto do diagnóstico de admissão no esvaziamento gástrico no paciente crítico patients