A GSDMB fokozó hajtott HSV timidin kináz-kifejező vektor szabályozására okkult peritoneális terjesztése gyomorrák sejtek

Egy GSDMB
enhanszer-vezérelt HSV timidin-kináz-expresszáló vektor szabályozására okkult peritoneális terjesztése gyomorrák sejtek
Abstract
alapon
Gyomorrák (GC) az egyik legfontosabb rosszindulatú betegségek világszerte, különösen a Ázsiában és Japánban és Koreában a legmagasabb előfordulási a világon. Mivel az esetek többségében, amelyek tűzálló terápiákhoz meghalni miatt peritoneális terjesztés (PD), a rákos sejtek, controlling PD fontos a páciens túlélését. GSDMB
tagja a gasdermin gén család. Mivel GSDMB
expresszálódik számos típusú rák, beleértve a GC, akkor valószínű, hogy a gén tartalmaz egy szabályozó régió, amely hasznosítható terápia okkult PD keresztül rákos sejt-specifikus expressziója citotoxikus gének.
Módszerek
végeztünk riporter assay azonosítani a szabályozó régió a rákos sejt-specifikus expresszió. Mi is épített lentivirális terápiás vektor, amely kifejezi a herpes simplex vírus timidin-kináz (HSVtk) egy GC-sejt-specifikus módon, és teszteltük egy egérmodelljében a PD.
Eredménye
Azonosítottuk a szabályozó régió a 496 hogy 989 a GSDMB katalógusa transzkripciós starthely és a kijelölt, mint egy GSDMB katalógusa fokozó. A lentivirális terápiás vektor elfojtott proliferációját GC sejtvonal, 60As6, az in vitro
jelenlétében ganciklovir, és intraperitoneális beadásra a vektor meghosszabbította túlélési idejének egereket intraperitoneálisan beoltjuk 60As6 előtt egy héttel a beadás.
Következtetések
GSDMB
-driven HSVtk expressziós vektor volt a terápiás hatás okkult PD modell egerekben. Ez a stratégia potenciálisan kezelésére használhatók GC betegek PD.
Kulcsszavak
Gyomor neoplazmák hasüregbe Genetic terápia HSV timidin-kináz-alapon
Gyomorrák (GC) az egyik legfontosabb rosszindulatú betegségek, különösen Ázsiában, és a második vezető oka a rákhoz kapcsolódó halálesetek világszerte [1]. Ez általában két csoportba lehet sorolni (Lauren besorolás) [2], bél- és diffúz, amelyek úgy gondolják, hogy az tükrözze a patogenezisében [3]. A diffúz típusú GC (DGC) al-besorolt ​​rosszul differenciált GC (nem szilárd típusú) vagy differenciálatlan GC a japán gyomorkarcinóma Association osztályozási rendszer [4]. DGC van infiltratív és gyakran azt mutatja, agresszív invázió a gyomor fal, így a metasztázis és terjedését a GC-sejtek a hasüregbe (peritoneális terjesztés, PD).
A disszeminált GC sejteket a hasüregbe vezetnek peritoneális carcinomatosis ( PC) [5]. PC okoz gyomor-bélrendszeri tünetek, mint a hasi fájdalom, hányinger és hányás, valamint a szisztémás tünetek, mint a fogyás és aszciteszt. PC nem csak erősen rontja az életminőséget GC betegek, de az is a vezető halálok a GC [6]. Szupportív egyedül, a medián túlélés betegek PC 3-6 hónap [7]. Ha szisztémás kemoterápiával kezelt, ugyanolyan módon, mint az egyéb metasztatikus léziók, PC mutat szegényebb a terápiás válasz, mint a más típusú metasztázis GC, főleg azért, mert a rossz eloszlása ​​a kemoterápiás ágens a hasüregbe. Ezért a legutóbbi erőfeszítések arra összpontosítottak innovatív PC Therapeutics, ilyen kombinálása cytoreductiv műtét, termikus terápia, és intraperitoneális kemoterápia. Ezek a kombinált megközelítések kissé javult a prognózisa pc, de a medián túlélési idő még mindig kevesebb, mint 12 hónap, egyértelművé téve, hogy van egy gyakorlati határa a hatásosságát sebészi cytoreduction [8, 9]. A legújabb tanulmányok arra utalnak, hogy fontos azonosítani GC betegek okkult PD elvégzésével egy citológiai vizsgálata peritoneális mosófolyadékban, mert ilyen esetekben azt mutatta, hogy jobb a prognózis, ha nyert konverzió negatív citológia kiterjedt intraoperatív peritoneális öblítéssel, majd intraperitoneálisan kemoterápia [10].
a "öngyilkos gén" rákterápia, felhasználva a herpes simplex vírus timidin-kináz (HSVtk), alakult ki a 1980-as években [11]. HSVtk katalizálja a foszforilációját a guanozin analóg ganciclovir (GCV) egy monofoszfát formában, hogy ezt követően foszforilálják celluláris nukleotid kinázok be erősen mérgező ganciklovir trifoszfát [12]. Ganciclovir trifoszfát blokkok DNS replikáció, ami a sejtciklus leállásához és sejthalál [13]. Terápia járó HSVtk transzfer a rákos sejteket, majd GCV adagolás ismert öngyilkos gén terápia, és ezt a technikát alkalmazott nemrégiben egy fázis III klinikai vizsgálatban a glioblastoma multiforme [12].
Ebben a tanulmányban, kifejlesztettünk egy terápiás vektor, amely kifejezi HSVtk a rákos sejtekben, felhasználva a szabályozó régió a gasdermin B gén (GSDMB katalógusa). GSDMB katalógusa tagja a gasdermin (GSDM katalógusa) család áll, hogy a négy gén, GSDMA katalógusa, GSDMB katalógusa, GSDMC katalógusa és GSDMD katalógusa [14, 15], és kifejezett szaporodó sejtek a normális hám és szintén számos típusú rák, beleértve a nyelőcső, gyomor, máj, a vastagbél, méhnyak és emlőrákban [14, 16-18]. GSDMB katalógusa kifejezés hajtja két promoter celluláris promoter és LTR-eredetű promoter [19-21]. Az LTR-eredetű promóter (LTR promoter) aktív a legtöbb normális szövetben, kivéve a gyomor, és sok rákos sejtvonalakban, míg a celluláris promoter aktív a normál gyomor szövetek és bizonyos rákos sejtvonalakban [20]. Ebben a vizsgálatban, azonosítottunk egy régió down-stream, az LTR-promoter, hogy mutatott erős transzkripciós aktivitást GC sejtvonalakban. Szoktuk a régió építeni egy HSVtk expressziós virális vektor szabályozására okkult PD. Katalógusa módszerek
emberi szövetek
Gyomorrák (GC) szövetek által a National Cancer Center Hospital megszerzését követően írásos hozzájárulását minden beteg, amely jóváhagyta a Nemzeti Rákkutató Központ Intézményi Review Board (ID: No.17-030). Tissue mintákat azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénnel után sebészeti extrakció, és -80 ° C-on tároltuk felhasználásig.
Microarray analízis
Az összes RNS-t izoláltunk szuszpendáljuk a sejteket ISOGEN lízispufferben (Nippon Gene, Toyama, Japán) majd csapadék izopropanollal. Végeztünk kifejezés analízisek emberi kifejezés Array U95A 2-es verziója (Affymetrix, Santa Clara, CA) szerint a beszállítók protokollokat. A kifejezés értéke (átlagos különbség: AD) mindegyik gén segítségével számoltuk GeneChip Analysis Suite 4.0 szoftverrel (Affymetrix). Hierarchikus klaszterezés microarray adatok segítségével végeztük GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), a Microsoft Excel és a Cluster & TreeView [22, 23]. Minden microarray adatok kerültek letétbe a MIAME kompatibilis adatbázist, GEO (nyilvántartási száma; GSE47007). A Wilcoxon u katalógusa -teszt (p katalógusa < 0,05), valamint a mutató 2-szeres változást, gének a specifikusan diffúz típusú GC választottak. [22] katalógusa sejtvonalak és primer kultúra egér mesothelialis sejtek katalógusa Három gyomor rákos sejtvonalak, HSC-57, származó bél típusú GC, és HSC-59 és HSC-60, mind a származtatott diffúz típusú GC, jöttek létre, és jellemzője a az egyik szerző [24 ]. SNU16 származó diffúz típusú GC-ben, amelyeket az American Type Culture Collection (ATCC), két más sejtvonalak hatékonyság termelő PD egerekben, 60As6 és 60As6GFP (60As6 expresszáló zöld fluoreszcencia fehérje), hozták létre a szerzők a diffúz típusú GC származó HSC-60 sejtvonal néhány passzázs után intraperitoneális transzplantáció egerekben [25]. CC-2511, egy fibroblaszt sejtvonalat, vásárolt a Lonza, Japán (Tokió, Japán). Minden sejtvonalat Dulbecco-féle módosított Eagle Medium. Egér mesothelialis sejteket injekcióval 10 ml meleg 0,25% -os tripszin /EDTA oldatot a hasüregbe [26]. A sejteket 3 napig inkubáltuk RPMI-1640-ben tenyésztettük, amelyet L-glutaminnal, fenolvörös és HEPES-ben (WAKO, Tokió, Japán). Met-5A, egy humán mesothelialis sejtvonal adta ATCC és karbantartani, Medium 199 (Life Technologies, Tokió, Japán) kiegészített 3,3 nM EGF (Life Technologies), 400 nM hidrokortizon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA), 870 nm inzulint (Life Technologies) és 10% FBS-t.
RT-PCR
Az összes RNS-ek a humán normál szervek cégtől vásároltuk BioChain, Hayward, CA. Összesen RNS-eket kivontuk egy RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Tokió, Japán). Miután generáló első szál cDNS-re teljes RNS felhasználásával ThermoScript RT-PCR System (Life Technologies, Tokyo Japán), PCR-t végeztünk a AccuPrime ™ Pfx
DNS-polimerázt (Life Technologies) a következő ciklus körülményei bármelyik 35 (LTR átiratok ), vagy 25 ciklus (mások): 95 ° C-on 1 perc; 56 ° C (β-aktin), vagy 58 ° C (mások) 1 percig; és 72 ° C-on 1 percig. A következő primer készleteket alkalmaztuk: a celluláris promoter átirat 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'és 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; az LTR promoter-eredetű átiratok, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'és 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; a 3 'oldalán GSDMB katalógusa, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3' és 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3 '; A MYH11
, 5'CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'és 5'-CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; és a β-aktin katalógusa, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'és 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3'.
Reporter Assay
Egy genomiális fragmens, -1.080-1053 a GSDMB katalógusa, és amely tartalmazza az LTR promoter, amplifikáltuk PCR segítségével LA-Taq Melegindítási DNS-polimeráz (Takara) 35 ciklus 96 ° C-on 30 s és 68 ° C 2 perc, felhasználva primer készlet: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'és 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', és beiktatjuk egy pGL3 Basic vektorba (Promega, Madison, WI). Ez csonkítva a restrikciós helyek: Nhel katalógusa I és Eco katalógusa R I generálására -1.035-1053 töredék; Kpn katalógusa I és Eco katalógusa R I -426 hogy 1053; NHE katalógusa I. és Afl katalógusa II -61 a 1053; NHE katalógusa I és Eco katalógusa 81 I 129-1053; Nhel
I és Stu katalógusa I 496-1053. A 496-1053 riporter konstrukciót további csonka restrikciós enzimek: Nhel
I és Swa katalógusa I 757-1053; NHE katalógusa I és Pvu katalógusa II 860-1053; NHE
I és Bst
X I 989-1053; Xho katalógusa I és Bst
X I. 496-989; Xho katalógusa I és Pvu katalógusa II 496-860; és Xho katalógusa I és Swa katalógusa I 496-757. További csonkolása a 496-989 fragmens PCR-t végeztünk a fragmens templátként használva Ex Taq DNS-polimeráz (Takara) 35 ciklus 95 ° C 1 perc, 58 ° C-on 1 percig és 72 ° C-on 1 percig, az alábbi láncindító: a 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'és 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; és a 649-989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'és 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Az amplifikálás után a fragmentumokat beiktatjuk pGL4.12 [luc2CP
] vektorba (Promega). A -1 kb upstream régiójában CXCR4
és CXCR7
állítottunk elő genomiális PCR-MightyAmp DNS-polimeráz (Takara) 35 ciklus 98 ° C-on 10 s, 62 ° C-on 15 s, és 68 ° C-on 2 percig, a következő láncindító: a CXCR4 katalógusa, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'és 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; és CXCR7 katalógusa, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'és 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Ezeket a fragmentumokat beiktatjuk a pGL4.12 [luc2CP
] vektor. Egy mikrogramm egyes konstrukciók és a Renilla luciferáz kontroll riporter vektort (PRL-SV40 vektor, Promega) ko-transzfektáltuk 1 × 10 5 sejt felhasználásával SuperFect transzfekciós reagens (QIAGEN) alkalmazva. A luciferáz assay-t 24 óra után a riporter bevezetését, egy Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). A vizsgálatot háromszor végeztünk el. Katalógusa GSDMB katalógusa fokozó-HSVtk lentivírusvektor
Egy pMFG-HSVtk vektort által RIKEN SZBK a Nemzeti Bio-Resource Project a MEXT, Japán, szívességi Dr. . Hirofumi Hamada, és egy HSVtk cDNS-t kivágtuk a rá, mint NCO
I-Bam
HI fragmentumot. A konstrukció a GSDMB
fokozó-HSVtk lentivírus vektor, először a 496-989 fragmens (GSDMB
fokozó) beiktatjuk a pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) között Nhel
I és Hind
III oldalakat, majd HSVtk cDNS beiktatjuk a vektorba Bam katalógusa Hl hely az előre (az ész-szál kifejezés) vagy fordított (antiszensz szál kifejezés) irányba. Ezután GSDMB
enhanszer-HSVtk ész és GSDMB
enhanszer-HSVtk antiszensz fragmentumokat kivágtuk a plazmid-vektorok, mint Nhel
I-Not
I fragmensek és beiktatjuk pLVSIN-CMV neo vektorok között az Xba
és Not
helyek közé. Végül, a CMV promoter lekerült a lentivirális konstrukciókat. A generál vírusrészecskék tartalmazó vektorok, a konstrukciókat bejuttattuk Lenti-X ™ 293 T-sejtek (Takara) felhasználásával Lenti-X ™ HTX Packaging System (Takara). Miután 72 H'-inkubálás után a közeget összegyűjtöttük, és a virális titert (CFU /ml) úgy határozzuk meg, transzdukcióval át HT-1080 sejtek jelenlétében polibrént (5 ng /ml tenyésztő tápközegben, Sigma-Aldrich). A részecskék vittük Met-5A és 60As6 (1 × 10 5 sejt per edény, három példányban) in vitro
jelenlétében polibrént (5 ug /ml), és a sejteket inkubáltuk tartalmazó közegben Gancicrovir (GCV, 5 ug /ml, WAKO) 5 napig a sejtnövekedést vizsgálatokban. A vizsgálatokat háromszori ismétléssel végeztük, és p
-értéke Student t
-próba között a tenyésztett sejteket (+) és a nélkül (-) GCV kiszámítottuk.
Kezelése PD egér modell GSDMB
enhanszer-HSVtk vektorok
korábban már beszámoltunk egy egér PD modellt (PD egerek) állították elő intraperitoneális 60As6 sejtek [25]. 60As6GFP sejteket (1 × 10 6 sejt per egér) injektáltunk a hasüregbe 18 egereket (6 hetes egereket CB17 /ICR-Prkdc < SCID > /CrlCrlj Genotípus: SCID /SCID, Charles River, Yokohama Japán) napon 1. Az egereket két csoportra osztottuk; az egyik csoport injektáltunk az antiszensz expressziós vektorral, és a másik csoport injektáltuk az értelemben vektor; Mindkét csoportban, majd intraperitoneálisan injektáltunk 2 ml PBS-oldattal, amely a virális részecske (5 × 10 5 CFU) és a ganciklovir (2 mg) a 8., 10. és 12. napon. Az átlagos túlélési idő minden egyes csoport és a p
-értéke Student t
-próba a két csoport között számoltuk. A vizsgálatot jóváhagyta a Nemzeti Rákkutató Központ bizottság Állatkísérletek. Katalógusa eredményei katalógusa azonosítása enhancer régió GSDMB katalógusa, amely vezérel génexpressziót GC sejtekben
Azonosítani a promoter /enhancer régiókat, hatásosak lehetnek a fejlesztés egy terápiás vektor peritoneális terjesztés (PD), akkor először keresett gének gyakrabban kifejezett diffúz típusú GC mint bél típusú GC segítségével összehasonlító génexpressziós analízis között 12 primer diffúz-típusú és 18 intesztinális -types, mert PD gyakrabban látható diffúz típusú GC, mint a bél típusú [22]. Azt észleltük, hogy a négy, tíz Affymetrix GeneChip próba készletek mutatja a legnagyobb hajtás-változás génexpresszió diffúz típusú GC képest intesztinális típusú volt szonda készlet MYH11 katalógusa (miozin, nehéz lánc 11, simaizom gén további fájl 1 táblázat S1). Miután meggyőződtünk, hogy a gén nem expresszálódik az immortalizált humán mesothel sejtvonal met-5A (az adatokat nem mutatjuk be), akkor a kiválasztott MYH11 katalógusa, mint egy erős jelölt a gén, amelynek promotere lehetővé teszi a diffúz-típusú GC specifikus expressziója HSVtk. Azonban a gén nem expresszálódik 60As6 sejtekben, amelyek készítéséhez használt PD modellt egereknek (Plusz fájl 2: ábra S1). Valószínű, hogy MYH11
van kifejezve rákhoz kapcsolódó fibroblasztok amelyek különösen gazdag diffúz típusú GC szövetekben. Ezután kiment a microarray adatok elemzése, toltuk fel a figyelmet upstream régiójában CXCR4 katalógusa (kemokin (CXC motívum) receptor 4 gén) és CXCR7 katalógusa (kemokin (CXC motívum) receptor gén 7), mivel mindkét vannak kifejezve sokféle rák és fontos szerepe van metasztázisban [27]. Ugyanakkor a riporter vizsgálatokban azt találtuk, hogy az upstream régiók ezen gének voltak transzkripcionálisan aktívak mind a Met-5A és a 60As6 sejtek (Kiegészítő fájl 2: ábra S2), ami arra utal, hogy a régiók meghajtó expresszióját HSVtk humán mesothelialis sejtekben in vivo katalógusa. Végül összpontosított GSDMB katalógusa gént, mint a korábbi vizsgálat azt mutatta, hogy ez erősen kifejezett GC szövetek és sejtvonalak [14]. Katalógusa GSDMB katalógusa átíródik a két promoter, celluláris és LTR promóterek ( 1A.), és az utóbbit főleg a normális szövetek és a rákos sejtvonalakban [19-21]. Igazoltuk ezeket az eredményeket elvégzésével RT-PCR elemzéseket RNS többféle normál szövetekben (ábra. 1b). RT-PCR-on GC sebészeti mintákban kimutatták, hogy az LTR promotert használjuk 14 15 bél típusú GC, és 11 15 diffúz típusú GC (ábra. 1c). Ábra. 1 GSDMB katalógusa gén átíródik a Cellular és LTR támogatói. (A) A sematikus ábrázolása a két promoter. (B) kifejezés két transzkriptum egyike által celluláris promoter és a másik által LTR, humán normál szövetekben (RT-PCR). Négy változatai emberi GSDMB átirat bejegyzett GenBank; 1. változat (NM_001042471), 2-es változat (NM_018530), 3. változat (NM_001165958) és a 4. változatot (NM_001165959). Transzkripciója változatok az 1., 3. és 4. hajtja a celluláris promoter és hogy a 2-es változat van az LTR promoter. A 3 'oldalán a GSDMB katalógusa transzkriptumok közös az egyes. (C) expresszáltatása LTR-transzkriptumok gyomorrák szövetekben, 15 intesztinális típusú és 15 diffúz típusú minták (RT-PCR sebészeti mintákban) hotelben a régió azonosítására kritikus a transzkripciós aktivitás GC-sejtek, egy olyan DNS-fragmenst spanning -1.080-1053 bp, a pozíció egy transzkripciós starthelyet az LTR promoter, izoláljuk (2A.). A riporter vizsgálatokat a csonkított DNS-fragmenseket használva két GC sejtvonalak, HSC-57 és HSC-59, jelezte, hogy a 496-989 régió volt erős transzkripciós aktivitást, még erősebb, mint az eredeti -1.080-1053 fragmenst, és hogy további csonkolás a 496-989 fragmens eredményezte jelentős csökkenését transzkripciós aktivitását (ábra. 2b). A régió ennek megfelelő fragmens erős transzkripciós aktivitást nevezték GSDMB
enhancer. Ábra. 2 azonosítása GSDMB katalógusa fokozó. (A) A sematikus illusztráció mutatja riporter konstrukciókat használnak a luciferáz assay. Hosszú terminális ismétlődő (LTR) eleme az emberi endogén retrovírus mutatja kétfejű nyíl. A pozíció a transzkripciós start hely számára az átirat az LTR promoter. (B) Luciferáz assay két gyomor rákos sejtvonalban, a HSC-57 és HSC-59, kiderült, olyan régióban erős transzkripciós aktivitást, spanning 496-989, amelyet a kijelölt GSDMB
enhancer. Vektor, üres reporter vektor, bár, szórás
építése GSDMB katalógusa enhanszer-vezérelt HSVtk lentivírusvektor
Korábban már beszámoltunk egy egér PD modellt (PD egerek) állították elő intraperitoneális 60As6 sejtek [ ,,,0],25]; Ebben a vizsgálatban, kifejlesztettünk egy virális terápiás vektor kezelésére PD egerekben. Vizsgálatára erejét a transzkripciós aktivitását GSDMB katalógusa fokozó 60As6, riporter vizsgálatot végeztünk, felhasználva a riporter konstrukció a upstream régiók CXCR4
és CXCR7
az összehasonlításhoz. A GSDMB
enhanszer kimutatta erősebb transzkripciós aktivitást 60As6 sejtekben, mint a CXCR4 katalógusa vagy CXCR7
upstream régiók, és a legfontosabb, a GSDMB
fokozó csak nagyon gyenge transzkripciós aktivitást egér peritoneális mesothelialis sejtekben és a Met-5A, egy humán mesothelialis sejtvonal (ábra. 3). Ez az eredmény azt sugallja, hogy a GSDMB
fokozó lehetővé HSVtk expressziója majdnem kizárólag 60As6 de nem mesothelialis sejtek a hasüregbe, a PD egerek, és valószínűleg nem a humán peritoneális mesothelium. Ábra. 3 GSDMB katalógusa fokozó erős transzkripciós aktivitást egy 60As6 sejtvonal. A luciferáz vizsgálatokat a három típusú tenyésztett sejtek: 60As6 sejteket, amelyek készítéséhez használt peritoneális terjesztés (PD) modell egerekben Ebben a vizsgálatban a primer kultúra sejtek egér peritoneális mesothelialis sejtek és létrehozott emberi mesotherial sejtvonal Met-5A. Bár, szórás katalógusa Ezután megvizsgáltuk a hatását HSVtk /GCV kezelést a GSDMB katalógusa fokozó-vezérelt HSVtk lentivírus vektor 60As6 in vitro katalógusa (4a.). Száma 60As6 sejtek transzdukált a lentivírus vektor szignifikánsan csökken, ha inkubáljuk tápközegben, amelyet GCV; Másrészről, az azonos HSVtk /GCV kezelés nem volt hatással a sejtek száma a Met-5A (ábra. 4b). Ábra. 4 HSVtk /GCV terápia használatával GSDMB
enhanszer-vezérelt lentivírus vektor javította a túlélési arány a PD egerekben. (A) lentivirális terápiás vektor GSDMB
enhanszer (ENH) -driven expresszióját a herpes simplex vírus timidin-kináz (HSVtk). (B) a sejtproliferációs vizsgálatokban a 60As6 és Met-5A transzdukált a terápiás vektorból, végzett inkubáció a tápközegben a (+) /nélkül (-) ganciklovir (GCV). (C) A rend HSVtk /GCV terápia PD egerekben. Bár, szórás, p
, p
-értéke Student t
-próba között a tenyésztett sejteket (+) és a nélkül (-) GCV. (D) Mikroszkópos megfigyelés mutatott egy kis populációját 60As6GFP sejtek (zöld fluoreszcencia) implantáltunk egér hashártya napon 10. (E) száma túlélte egerek után HSVtk /GCV terápia az értelemben,-szál expresszáló vektor (piros) és egy antiszensz -strand kifejező vektor referenciaként (kék). Átlagos túlélési idő minden egyes csoport látható a jobb oldali P katalógusa - értékét Student-féle t-próba katalógusa a két csoport között katalógusa HSVtk /GCV terápia okkult PD egerek katalógusa alkalmaztunk HSVtk /GCV terápia PD egerekben. Ebben a terápiás vizsgálatban, készítettünk kétféle a GSDMB katalógusa enhanszer-vezérelt lentivírus vektor: az egyik vektor kifejezve az értelemben,-szálát HSVtk cDNS, és használt kezelésére PD egerekben, míg a más vektor kifejezve az antiszensz szálú és használjuk, mint a kontroll. A terápia indult után hét nappal intraperitoneális inokulálása 60As6 expresszáló sejtek zöld fluoreszcencia fehérje (60As6GFP). Ez a séma tervezték kezelésére okkult PD modell, amelyben 60As6GFP sejteket diffúzan graftolunk a hasüregbe (ábra. 4c, d). Három adag után a kezelés, a 36. napon, sem a kilenc kezelt egerek HSVtk értelemben-expressziós vektor meghalt, míg a két a kilenc referencia egerek már meghalt. Egyik kilenc referencia egerek életben volt nap 57, azaz a nyolc héttel az injekció beadása után 60As6GFP sejtek; azonban négy kilenc terápiás vektor kezelt egerek még életben voltak (ábra. 4e). Ez az eredmény azt sugallja, hogy a terápia javíthatja a prognózist okkult PD egerekben.
Megbeszélés
GSDMB
fokozó vezérel génexpressziót GC sejtekben
Korábban azt jelentette, hogy GSDMB
expresszálódik valamennyi GC szövetek és sejtvonalak vizsgálni [14], és az ebben a tanulmányban kimutatták, hogy az LTR-promoter vezérel GSDMB katalógusa expressziót 25 30 GC példányok (ábra. 1c). Transzkripciós aktivitását, az LTR-régió (2A.) Korábban kimutatta riporter assay nem-GC sejtvonalak [20, 21]. Ugyanakkor azt találtuk, különálló régió erős transzkripciós aktivitást a downstream az LTR-régióba, és a kijelölt azt GSDMB katalógusa fokozó. Amellett, hogy a két GC sejtvonalak, HSC-57 és HSC-59, a transzkripciós aktivitását ebben a régióban detektáltuk riporter assay más GC sejtvonalakban, beleértve MKN74 (relatív luciferáz aktivitás körülbelül 1,9), HSC-60 (29,4 ), HSC-42 (2,5), és HSC-44 (4.6), de nem a HSC-58 vagy MKN28 (az adatokat nem mutatjuk be) [14]. Így a GSDMB
fokozó szer nem hajt génexpresszió néhány GC sejtekben.
Csonkolás egy régió átívelő 496-562 szignifikánsan csökkentette a transzkripciós aktivitását GSDMB katalógusa enhancer (ábra. 2b, 562 a 989). A 496-562 régió, azt találtuk, konszenzus-kötőhelyeket számos transzkripciós faktorok, beleértve a GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, Sox9, SOX10 és NFY-A, és a bázis-helyettesítés bármely ilyen konszenzus szekvenciák tette nem befolyásolják a transzkripciós aktivitását fokozó (az adatokat nem mutatjuk). A transzkripciós faktor, amely kölcsönhatásba lép a fokozó és hozzájárul annak transzkripciós aktivitását még nem azonosítottak.
Alkalmazása terápiás lentivírus vektor kezelés humán okkult PD
gyógyító terápiára még nem állapították meg a PD. GC betegek makroszkopikus PD rossz prognózis, a medián teljes túlélés 3-6 hónap. Azok, akik csak mikroszkopikus PD is van egy rossz prognózist; az 5 éves túlélési arány 0-18% [28]. Ezért fontos, hogy észlelni okkult PD által citológiai vizsgálata peritoneális mosófolyadékban, és teljesen kiirtani a rákos sejtek a hasüregbe. Metaanalíziseinek által Cabalag munkatársai katalógusa. jelezte, hogy az extenzív hasüregbe mosás (EIPL, fiziológiás sóoldat 1 alom /adag, 10-szer) és az intraoperatív hasüregbe kemoterápia (IIPC) ciszplatinnal jelentősen javult az 5 éves teljes túlélés több mint 40% [28]. A vizsgálati eredmények azt sugallják, hogy HSVtk /GCV kezelést a lentivírusvektor javítja a betegek prognózisát függetlenül, és azt feltételezzük, akkor lehet használni, mint egy konszolidációs kezelés. Szolid tumorok diffúz növekedés áll számos miofibroblastokat és néhány hajó (például diffúz típusú GC, hasnyálmirigy rák és scirrhous típusú emlőrák). Attól függően, hogy a feltételeket, a mikrokörnyezet, mint például a tápanyag-hiány, ezek a daganatok mutatnak magas prevalenciája ritkán-proliferatív tumorsejtekben. Így diffúz típusú GC sejtek terjeszteni a hasüregbe állhat egy populáció, amely képes ellenállni a citotoxikus hatását a ciszplatin. A lentivírus terápiás vektor lehet bevezetni HSVtk be mind proliferáló és nem-proliferáló sejtek. Sőt, a GSDMB
enhanszer lehetővé GC sejt-specifikus HSVtk kifejezést. Ez a korlátozott expressziója csökkenti mesothelialis sejtek károsodását, utalva arra, hogy a génterápia alkalmazásával végezhetjük dózisok elég magas ahhoz, hogy teljesen kiirtani GC-sejtek, még azok is, ellenáll a ciszplatin, az okkult PD. Valószínű, hogy a kombinációs kezelés, EIPL és IIPC, majd HSVtk /GCV terápia a lentivírus vektor, javítani fogja a prognózist okkult PD jelentősebben, mint a EIPL és IIPC kombinációs terápia egyedül. Úgy gondoljuk, hogy ez a rend méltó forgalomba klinikai vizsgálatokban. Bár úgy tűnik, hogy a GSDMB katalógusa fokozó szer nem működik bizonyos GC sejtekben, további tanulmányok, melyek célja, hogy meghatározza a további GC-specifikus fokozó, megoldja ezt a problémát.
Következtetések katalógusa A GSDMB
-driven HSVtk kifejezés vektor volt a terápiás hatás a okkult PD modell egerekben. Ez a stratégia alkalmazása is elképzelhető, hogy megakadályozzák GC betegek szerződő PD és kezelésére is használják GC betegek PD. Katalógusa nyilatkozatok katalógusa visszaigazolása katalógusa Ezt a tanulmányt támogatott a Grants-in-Aid for Scientific Research (C ) a Japan Society Elősegítő Science (JSPS KAKENHI Grant száma 23501322).
További fájlok
További fájl 1: táblázat S1. A tíz legnagyobb próba készletek mutató kifejezés jellemző diffúz típusú gyomorrák. Kiegészítő fájl 2. ábra: S1. MYH11
nem fejeznek ki gyomor rákos sejtvonalak. A promoter régió két CXCR4
és CXCR7
gének mutat transzkripciós aktivitást egyaránt 60As6 és Met-5A sejteket. Versengő érdekek
A szerzők kijelentik, hogy nincs ellentétes érdekek. Katalógusa szerzôk hozzájárulása katalógusa NS és HS tervezett és irányított ebben a vizsgálatban. NS elvégzett biológiai vizsgálatokat és az állatkísérleteket támogatást RK, FC és KY. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• A gyomorrák egy egyetemen oktató kórház északnyugati Tanzánia: a retrospektív 232 cases
• A hatás a felvételi diagnózis gyomorürülésre kritikusan beteg patients