GSDMB stipriklis varoma HSV timidinkinazės ekspresija vektorių ir kontroliuoti slaptasis peritoninė sklaidą skrandžio vėžys cells

A GSDMB
stipriklis varoma HSV timidinkinazės ekspresija vektorių kontrolei slaptasis peritoninė sklaidą skrandžio vėžio ląstelių
Santrauka
fone
Skrandžio vėžys (GC) yra vienas iš pagrindinių piktybinių ligų visame pasaulyje, ypač Azijoje, o Japonija ir Korėja turi didžiausią sergamumą pasaulyje. Nes daugeliu atvejų, kad ji yra atspari gydymui į gydymo miršta dėl peritoninės sklaidos taisykles (PD) vėžio ląstelių, kontroliuoti PD yra svarbu, kad pacientų išgyvenimo. GSDMB
yra iš gasdermin genų šeimos narys. Kadangi GSDMB
išreiškiamas daugelio rūšių vėžio, įskaitant GC, tai
tikėtina, kad genų yra reguliavimo sritį, kuri yra panaudota gydymui slapto PD per vėžio ląstelėms būdingas išraiškos citotoksinių genuose. Metodai
> Mes atlikome reporteris tyrimus, atliekamus siekiant nustatyti reguliavimo regioną vėžio ląstelėms būdingas išraiškos. Mes taip pat pastatyti lentiviruso gydomąjį vektorių, kad išreiškia Herpes simplex virusas timidinkinazės (HSVtk) į GC ląstelėms būdingas būdu ir išbandyti jį pelės modelis PD.
Rezultatai
Mes nustatė reguliavimo regioną +496 į +989 nuo GSDMB
transkripcija starto vietą ir, jis tapo GSDMB
stipriklis. Lentiviruso terapinis vektorius slopino platinimo GC ląstelių linija, 60As6, in vitro pervežimas į iš gancikloviro akivaizdoje, ir į pilvaplėvės ertmę vektoriaus pratęsė išgyvenimo terminą pelių, kurios buvo pilvaplėvę užkrėstų 60As6 vieną savaitę iki administracijos.
Išvados Viesbutis The GSDMB
-driven HSVtk ekspresijos vektorius turėjo gydomąjį poveikį okultizmu PD modelio pelių. Ši strategija gali būti potencialiai gydyti GC pacientus PD.
Raktiniai žodžiai
Skrandžio navikai pilvaplėvės ertmėje Genetinis terapija HSV timidinkinazės faktai
Skrandžio vėžys (GC) yra vienas iš pagrindinių piktybinių ligų, ypač Azijoje, ir antra pagrindinė priežastis, dėl vėžio susijusias mirtis visame pasaulyje [1]. Jis paprastai yra skirstomi į du tipus (Lauren klasifikacinių) [2], žarnyno ir difuzinės, kurie, kaip manoma, atsižvelgiant į jo patogenezę [3]. Difuzinis tipo GC (DGC) sub-klasifikuojami kaip blogai diferencijuota GC (ne kietas tipo) arba nediferencijuota GC Japonijos skrandžio vėžio asociacijos klasifikaciją [4] sistemą. DGC yra infiltracinė ir dažnai rodo agresyvų invazija į skrandžio sieną, todėl metastazių ir GC ląstelių plitimą į pilvaplėvės ertmę (pilvaplėvės sklaidos, Pd).
Platinama GC ląstelių pilvaplėvės ertmę sukelti pilvaplėvės karcinomatoze ( PC) [5]. PC sukelia virškinimo trakto simptomai, tokie kaip pilvo skausmas, pykinimas ir vėmimas, taip pat sisteminių simptomų, tokių kaip svorio ir ascite. PC ne tik smarkiai blogėja gyvenimo GC pacientams kokybę, bet taip pat yra pirmaujanti mirties priežastis GC [6]. Vien palaikomojo gydymo, išgyvenamumo mediana pacientams, sergantiems PC 3-6 mėnesius [7]. Jei jie yra apdoroti su sisteminė chemoterapija, tuo pačiu būdu, kaip ir kitų Metastazės, Kompiuteriu rodo prastesnę atsaką į gydymą nei kitų rūšių metastazių GC, daugiausia dėl prastos paskirstymo chemoterapiniu agentu pilvaplėvės ertmę. Todėl pastaruoju metu pastangos orientuota į novatoriškus PC terapijos, pavyzdžiui, derinant citoredukcinės operacijos, šilumos terapija, ir į pilvaplėvės ertmę, chemoterapija. Šios kombinuotos požiūriai šiek tiek pagerino PC prognozę, nors vidutinis išgyvenamumo trukmė yra dar mažiau nei 12 mėnesių, todėl aišku, kad yra praktiškas riba chirurginio cytoreduction veiksmingumo [8, 9]. Naujausi tyrimai rodo, kad tai yra svarbu nustatyti GC pacientus okultinės PD atliekant citologinis nagrinėjimą peritoninės lavažo skysčio, nes tokie atvejai parodė geresnį prognozę, jei jie gauti virtimą į neigiamą citologija plataus masto operacijos metu pilvaplėvės plovimas po pilvo ertmę chemoterapijos [10].
į "savižudybė genų" vėžio gydymo koncepciją, naudojant herpes simplex virusas timidinkinazės (HSVtk), atsirado 1980 m [11]. HSVtk katalizuoja guanozinas analoginio gancikloviro (GCV) fosforilinimo į tam monofosfatai, vėliau fosforilinamos korinio nukleotidų kinazės į labai nuodingas gancikloviro trifosfatas [12]. Gancikloviro trifosfato blokai DNR replikacija, todėl ląstelės ciklo suėmimo ir ląstelių mirtį [13]. Apimantis gydymas HSVtk pavertimą vėžinių ląstelių, o po to GCV pavartojimo, yra žinomas kaip savižudybės genų terapijos, ir šis metodas neseniai buvo naudojamas III fazės klinikinių bandymų su glioblastoma [12].
Šiame tyrime, mes sukūrė terapinis vektorius, kad išreiškia HSVtk į vėžio ląsteles, panaudojant reguliavimo regioną gasdermin B geno (GSDMB pervežimas). GSDMB
yra iš gasdermin narys (GSDM
) šeimos, kurią sudaro keturių genų, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC parsisiųsti ir GSDMD
[14, 15], ir išreikštas besidauginančiose ląsteles normalaus epitelio ir taip pat įvairių tipų vėžio, įskaitant stemplės, skrandžio, kepenų, storosios žarnos, gimdos kaklelio ir krūties vėžio [14, 16-18]. GSDMB
išraiška yra varomas dviejų vykdytojų, mobiliojo ryšio promotoriaus ir LTR-gauto rengėjas [19-21]. LTR-kilęs promotorius (LTR promotorius) yra aktyvus daugeliu normaliuose audiniuose, išskyrus skrandžio, ir daugelyje vėžio ląstelių linijų, o korinio promotorius yra aktyvus įprastu skrandžio audinio ir kai kuriais vėžio ląstelių linijų [20]. Šiame tyrime mes nustatė regioną žemyn upelio dėl ilgalaikių gyventojų promotorius, kad smarkiai transkripcijos veiklą GC ląstelių linijų. Mes naudojome šį regioną pastatyti HSVtk saviraiškos virusinis vektorius kontroliuoti slaptasis PD.
Metodai
Žmogaus audiniai
Skrandžio vėžys (GC) audiniai teikė Nacionalinio vėžio centro ligoninės gavusi rašytinį informuoto sutikimo vieni iš pacientas, kuris buvo patvirtintas nacionalinio vėžio centro institucinių ekspertizės valdyba (ID: No.17-030). Audinių mėginiai buvo nedelsiant užšaldomi skystu azotu po chirurginės gavybos ir saugomi -80 ° C iki naudojimo.
Mikrogardeliq analizė
viso RNR buvo išskirta sustabdant į ISOGEN lizės buferio ląstelių (Nippon genų, Tojama, Japonija) po nusodinant izopropanolio. Mes atlikome išraiška analizuoja naudojant žmogaus išraiška Array U95A versija 2 (Affymetrix, Santa Clara, Kalifornija), atsižvelgiant į tiekėjų protokolus. Sąvoka vertė (vidutinis skirtumas: AD) kiekvieno geno buvo apskaičiuotas naudojant GeneChip analizė Suite versija 4.0 programinės įrangos (Affymetrix). Hierarchinis grupuojama mikrogardeliq duomenų buvo atliekamas naudojant GeneSpring (Agilent Technologies Ltd, Palo Alto, Kalifornija), "Microsoft Excel" ir "Cluster & TreeView [22, 23]. Visi mikrogardeliq duomenys buvo pervestas į MIAME atitinkančio duomenų bazės, GEO (prisijungimas skaičius; GSE47007). Iki Vilkoksono U
-test (psl
< 0,05) ir rodo 2 kartus kaita, genai konkrečiai difuzinis tipo GC buvo pasirinktas [22]
Mobilaus ryšio linijų ir pirminės kultūros pele. mesothelial ląstelių
Trys skrandžio vėžio ląstelių linijas, HSC-57, kilęs iš žarnyno tipo GC, ir SSK-59 ir HSC-60, tiek gaunami iš pasklidųjų tipo GC, buvo įsteigta ir pasižymi vienu iš autorių [24 ]. SNU16, kilęs iš pasklidųjų tipo GC, buvo numatyta iš Amerikos tipas Kultūros kolekcijos (ATCC), kitos dvi ląstelių linijos su efektyvumas gaminant PD pelėms, 60As6 ir 60As6GFP (60As6 išreikšti žalia fluorescencijos baltymų), buvo įkurta autorių iš difuzinis tipo GC kilęs SAK-60 ląstelių linijos po kelių ištraukų pilvo ertmę transplantacijai pelių [25]. CC-2511, fibroblastų ląstelių linija, buvo įsigytas iš Lonza, Japonijoje (Tokijas, Japonija). Visi mobilieji linijos buvo prižiūrimi Dulbecco modifikuota Eagle terpė. Pelės mesothelial ląstelės buvo nuimta injekcijomis 10 ml pašiltintas 0,25% tripsino /EDTA tirpalo į pilvaplėvės ertmę [26]. Ląstelės buvo inkubuojami 3 dienų RPMI-1640, papildytas L-glutamino, fenolio raudonasis ir HEPES (WAKO, Tokijas, Japonija). Met-5A, žmogaus mesothelial ląstelių linija, buvo pateikta ATCC ir prižiūrimi terpė 199 (Life technologies ", Tokijas, Japonija), papildytoje 3,3 nM EGF (Life Technologies), 400 Nm hydrocortison (Sigma-Aldrich, St Louis, MO JAV), 870 nM Insulinas (Life Technologies ") ir 10% FBS.
AT-PGR
Bendras RNR nuo įprastų žmogaus organų buvo įsigytas iš BioChain, Hayward, CA Iš viso RNR buvo paimti naudojant RNeasy Mini komplektas (QIAGEN, Tokijas, Japonija). Po generuoti pirmos grandies kDNR iš viso RNR naudojant ThermoScript RT-PGR sistema (LIFE TECHNOLOGIES, Tokyo Japan), PGR buvo atliekama su AccuPrime ™ PFX
DNR polimerazė (Life Technologies) pagal šias dviračių sąlygomis arba 35 (LTR nuorašai ) arba 25 ciklų (kita): 95 ° C 1 min; 56 ° C temperatūroje (β-aktino) arba 58 ° C (kiti) 1 min; ir 72 ° C temperatūroje 1 min. buvo naudojami šie gruntas rinkiniai: koriniams rengėjas stenograma, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 "ir 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3"; už ltr promotoriaus gautas transkriptų, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'ir 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; už 3 'pusėje GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3' ir 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3 '; už MYH11
, 5'-CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 "ir 5'-CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; ir beta-aktino
, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3.
Reportažai Analizės
"ir 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3" genomo fragmentą, iš -1080 iki +1053 iš GSDMB
ir kurių sudėtyje LTR promotorius, buvo amplifikuotas naudojant LA Taq karšto paleidimo DNR polimerazės (TAKARA) 35 ciklų 96 ° C temperatūroje 30 s ir 68 ° C temperatūroje 2 min, naudojant pradmens rinkinius: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'ir 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 "ir įterpiamas į pGL3 pagrindinio vektoriaus (Promega, Madison, WI). Jis buvo sutrumpintas naudojant restrikcijos vietas: nhe
i ir ekologinio
i R generuoti -1035 į 1053 fragmentą; KPN
i ir ekologinio
R I -426 iki 1053; Nhe
I ir AFL
II už -61 iki 1053; Nhe
I ir ekologinio
81 I 129-1053; ir nhe
i ir Stu
I +496 iki +1053. 496-1053 reporteris konstruktas buvo labiau sutrumpintas su restrikcijos fermentų: nhe
i ir Swa
I 757-1053; Nhe
I ir Pvu
II už 860-1053; Nhe
i ir Bst
X I +989 iki +1053; Xho
I ir Bst
x i už 496-989; Xho
I ir Pvu
II "496-860; ir Xho
I ir Swa
I +496 iki +757. Tolesniam leidžia atmesti 496 į 989 fragmento, PGR buvo atliekama su fragmento kaip šabloną, naudojant Ex Taq DNR polimerazės (TAKARA) 35 ciklų 95 ° C temperatūroje 1 min, 58 ° C temperatūroje 1 min, ir 72 ° C 1 min, naudojant šiuos pradmens rinkinius: už 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'ir 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; ir +649 į +989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'ir 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Po amplifikacijos, fragmentai buvo įtraukta į pGL4.12 [luc2CP
] vektoriaus (Promega). -1 Kb prieš srovę regionai CXCR4
ir CXCR7
buvo paruošti pagal genomo PGR naudojant MightyAmp DNR polimerazės (TAKARA) 35 ciklų 98 ° C temperatūroje 10 S, 62 ° C temperatūroje 15 s, ir 68 ° C 2 min, naudojant šiuos pradmens rinkinius: už CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'ir 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; ir CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'ir 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Šie fragmentai buvo įdėta į pGL4.12 [luc2CP
] vektorių. Vienas mikrogramų kiekvieno konstrukto ir Renilla liuciferazė kontrolę vykdanti Reportažai vektoriniu (PRL-SV40 vektorius, Promega) buvo bendrai perkeltų į 1 × 10 5 ląstelės naudoja SuperFect transfekcijq reagento (Qiagen). Liuciferazės tyrimas buvo atliktas, po 24 valandų reporterio įvedimo, naudojant Dual-liuciferazės reporterio testą sistema (PROMEGA). Tyrimas buvo atliekamas tris kartus.
GSDMB
stipriklis-HSVtk lentivirus vektorius
pMFG-HSVtk vektorius buvo pateikta RIKEN BRC per nacionalinį "Bio-Resource projektas MEXT, Japonijoje, kurią mandagumo dr . Hirofumi Hamada, ir HSVtk kDNR buvo pašalintų iš jo kaip puskarininkių pervežimas I-Bam
HI fragmentą. Statyti GSDMB
stipriklis-HSVtk lentivirus vektorių, pirmąjį iš 496 į 989 fragmentą (GSDMB
stipriklis) buvo įterptas į pcDNA3.1 (+) (Life Technologies ") tarp nhe
I ir Hind
III svetaines, tada HSVtk kDNR buvo įtraukta į esant Bam
HI svetainę į priekį (už prasme-Strand išraiška) vektoriaus arba pakeisti (už antiprasmio-Strand išraiška) kryptimi. Be to, GSDMB
stipriklis-HSVtk jausmas ir GSDMB
stipriklis-HSVtk antiprasmq fragmentai buvo pašalintų iš plazmidžių vektorių kaip nhe
i-Ne
i fragmentus ir įterpiamas į pLVSIN-CMV neo vektorių tarp Xba
aš, o ne
i svetainėse. Pagaliau, CMV promotorius buvo pašalintas iš lentiviruso konstruoja. Norėdami sukurti virusines daleles, turinčias vektorius, konstruktai buvo įtraukta į LENTI-X ™ 293 T ląstelių (TAKARA), naudojant Lenti-X ™ HTX pakavimo sistemos (TAKARA). Po to, kai 72 h'-inkubacijos, vidutinės buvo surinkti ir virusinis titras (ksv /ml) buvo nustatomas pagal transdukcijos į HT-1080 ląstelių į polibrenui (5 mikrogramai /ml kultūrinėje terpėje, Sigma-Aldrich) buvimą. Dalelės buvo taikomas Met-5A ir 60As6 (1 × 10 5 ląstelės per indą, esantys tris kartus) in vitro
Atsižvelgiant į polibrenui buvimą (5 g /ml), ir ląstelės buvo inkubuojamos terpėje, turinčioje Gancicrovir (GCV, 5 mikrogramai /ml, WAKO) 5 dienas ląstelių augimo tyrimus. Buvo atlikti buvo atliekami trimis egzemplioriais ir P
-Pridėtinės iš Stjudento t
-test tarp išaugintų ląstelių su (+) ir be (-) GCV buvo apskaičiuota
gydymas PD pelės modelis su GSDMB stipriklis-HSVtk vektoriai
Mes anksčiau pranešė pelės PD modelį (PD pelėmis), kuris buvo gaminamas injekciją į pilvą iš 60As6 ląstelių [25]. 60As6GFP ląstelės (1 × 10 6 ląstelės per pele) buvo švirkščiamas į pilvaplėvės ertmę 18 pelėmis (6 savaičių pelių CB17 /ICR-Prkdc < SCID > /CrlCrlj genotipas: SCID /SCID Charles River yokohama Japonija)-ą dieną 1. pelių buvo suskirstyti į dvi grupes; viena grupė buvo suleista su Priešprasminis ekspresijos vektoriumi, ir kita grupė buvo suleista su prasme vektoriuje; abi grupės tada buvo pilvaplėvę įšvirkščiama 2 ml PBS tirpalo, kuriame yra virusinė dalelė (5 × 10 5 ksv) ir gancikloviro (2 mg) 8, 10 ir 12 dieną. buvo apskaičiuotas vidutinis išlikimo laikas iš kiekvienos grupės ir P
-Pridėtinės iš Stjudento t
-test tarp dviejų grupių. Tyrimas buvo patvirtinta Nacionalinio vėžio centro komitetas Gyvūnų eksperimentus.
Rezultatai
Identifikacija stipriklis regione GSDMB
, kuris verčiantis genų ekspresiją GC ląstelių
nustatyti rengėjas /Enhancer regionams, kurie būtų veiksmingas terapinio vektoriaus peritoninės sklaidos (PD) plėtros, pirmiausia ieškoma genų dažniau išreikštų difuzinis tipo GC nei žarnyno tipo GC naudojant lyginamąją genų ekspresijos analizė tarp 12 pirminių pasklidųjų tipų ir 18 žarnyno -tipai, nes PD dažniau matyti difuzinis tipo GC nei žarnyno tipo [22]. Pastebėjome, kad keturi iš dešimties Affymetrix GeneChip zondas rinkiniai rodo aukščiausią kartų kaita genų ekspresija difuzinis tipo GC palyginti su žarnyno tipo buvo probe rinkiniai MYH11
(myosin, sunkiosios grandinės 11, lygiųjų raumenų genų, papildomų failų 1: S1 lentelė). Įsitikinę, kad genas yra ne išreikšta įamžinta žmogaus mesothelial ląstelių linijos MET-5A (duomenys neparodyti), mes išrinkome MYH11
kaip stipri kandidatė geno, kurio rengėjas leidžia difuzinis tipo GC konkrečią išraišką HSVtk. Tačiau genas nėra išreikštas 60As6 ląstelių, kurios buvo naudojamos už PD modelio peles (papildomas failų 2: S1 paveiksle). Tikėtina, kad MYH11
išreiškiamas vėžiu susijusių fibroblastų, kurie yra ypač gausu difuzinis tipo GC audiniuose. Be to, vyksta iš mikrogardeliq duomenų analizę, mes persikėlė mūsų dėmesį į tiekėjų regionuose CXCR4
(chemokino (CXC motyvas) receptorių 4 genas) ir CXCR7
(chemokino (CXC motyvas) receptorių 7 genas), nes abi yra išreikšti daugelio rūšių vėžio ir vaidina svarbų vaidmenį metastazių [27]. Tačiau, naudojant reporteris bandymo rezultatais, mes nustatėme, jog pirminė regionai Šių genų buvo transkripciškai aktyvus tiek MET-5A ir 60As6 ląstelių (Papildoma failų 2: S2 paveikslas), o tai reiškia, kad regionai vairuoti HSVtk išraiška žmogaus mesothelial ląstelių in vivo
. Galiausiai, mes sutelktas į GSDMB
geno, kaip mūsų Ankstesnis tyrimas parodė, kad ji yra labai išreikštas GC audinių ir ląstelių linijų [14].
GSDMB
yra transkripcija dviem vykdytojų, ląstelių ir LTR vykdytojų ( 1a pav.), o pastaroji yra daugiausia naudojamas normaliuose audiniuose ir vėžio ląstelių linijos [19-21]. Mes patvirtino šias išvadas atliekant PGR analizę RNR iš kelių rūšių sveikų audinių (pav. 1b). RT-PGR GC chirurginiai mėginiai parodė, kad LTR promotorius buvo naudojamas 14 15 žarnyno tipo gcs ir 11 iš 15 difuzinis-tipo GCS (pav. 1c). Pav. 1 GSDMB
genas yra perrašyti ląstelių ir LTR rengėjams. (A) schema iliustracijos iš dviejų skatinančių medžiagų. (B) išraiška iš dviejų transkriptų, po vieną, Cellular promotoriaus, o kitą LTR, žmogaus normaliuose audiniuose (RT-PCR). Keturi variantai žmogaus GSDMB stenograma yra registruotas GenBank; 1 variantas (NM_001042471), variantas 2 (NM_018530), 3 variantas (NM_001165958) ir variantas 4 (NM_001165959). Transkripcija variantų 1, 3 ir 4 varomoji jėga yra korinio promotoriaus ir kad varianto 2 yra prie LTR promotoriaus. 3 "pusėje GSDMB
nuorašai yra bendras kiekvienam. (C) išraiška ltr nuorašai skrandžio vėžio audiniuose, 15 žarnyno tipo ir 15 difuzinis tipo bandiniai (RT-PGR chirurginės egzempliorių)
Nustatyti regioną kritinę už transkripcijos veiklos GC ląstelių DNR fragmentas, apimanti -1080 į +1053 bp, laikoma, kad iš transkripcijos pradžios vietos, būtinos LTR promotoriaus pozicija, buvo išskirtas (pav. 2a). Žurnalistė tiriant sutrumpintas DNR fragmentų, naudojant dvi dujų chromatografijos ląstelių linijas, hsc-57 ir SAK-59 nurodė, kad 496-989 regionas turėjo stiprią transkripcijos veiklą, dar labiau nei originalus -1080 į 1053 fragmentas, ir kad tolesnis trumpinimą nuo 496 iki 989 fragmento lėmė žymiai sumažinti transkripcijos veiklos (pav. 2b). Šis regionas, atitinkantis šio fragmento su stipriu transkripcijos veiklos buvo pavadintas GSDMB
stipriklis. Pav. 2 identifikavimas GSDMB
stipriklis. (A) schema iliustracija rodo reporteris konstruktus naudojami liuciferazės tyrimus. Ilgas terminalas pakartokite (ltr) elementas žmogaus endogeninio retrovirusų parodoma dvigalvis rodykle. Pozicija yra iš transkripcijos starto vietoje nuo LTR promotoriaus stenograma. (B) liuciferazės tyrimai, naudojant dvi skrandžio vėžio ląstelių linijas, SAK-57 ir SAK-59 atskleidė regioną su stipriu transkripcijos veiklos, apimanti nuo +496 iki +989, kuri buvo paskirta kaip GSDMB
stipriklis. Vektorius, tuščias reporteris vektorius, Baras, standartinis nuokrypis
statyba GSDMB
stipriklis varoma HSVtk lentivirus vektoriaus
Mes anksčiau pranešė pelės PD modelį (PD mice), kuris buvo gaminamas injekciją į pilvą iš 60As6 ląstelių [ ,,,0],25]; šiame tyrime, mes sukūrė virusinės terapinį vektorių Pd pelių gydymui. Dėl nagrinėjant transkripcijos veiklos GSDMB
stipriklis į 60As6 jėgą, buvo atlikta Reporter tyrimai, naudojant žurnalistė statyti už tiekėjų regionuose CXCR4
ir CXCR7
palyginimui. Į GSDMB
stipriklis parodė didesnį transkripcijos veiklą 60As6 ląstelių nei CXCR4
arba į CXCR7
tiekėjų regionuose, ir, svarbiausia, GSDMB
stipriklis turėjo labai silpną transkripcijos veiklą pelės pilvaplėvės mesothelial ląstelių ir met-5A, žmogaus mesothelial ląstelių linija (3 pav.). Šis rezultatas rodo, kad GSDMB
stipriklis leidžia HSVtk išraiška beveik išimtinai 60As6 bet ne mesothelial ląstelių pilvaplėvės ertmę PD pelių, ir tikriausiai ne žmogaus peritoninės mesothelium. Pav. 3 GSDMB
stipriklis turi stiprią transkripcijos veiklą kitoje 60As6 ląstelių linija. Liuciferazės tyrimai su trijų rūšių išaugintų ląstelių: 60As6 ląstelių, kurios buvo naudojamos už pilvaplėvės sklaida (PD) Modelis pelėms šiame tyrime, pirminės kultūros ląstelių pelės pilvaplėvės mesothelial ląstelių ir įsteigta žmogaus mesotherial ląstelių linija MET-5A. Baras, standartinis nuokrypis
Be to, mes išnagrinėjo HSVtk /GCV terapija, naudojant GSDMB
stipriklis varoma HSVtk lentivirus vektorių ant 60As6 in vitro
(Pav. 4a) poveikį. Iš 60As6 ląstelių transdukuotų su lentivirus vektorių skaičius buvo žymiai sumažintas, kai inkubuojami terpėje, papildytoje su GCV; Kita vertus, tas pats HSVtk /GCV gydymas neturėjo įtakos ląstelių skaičių Met-5A (pav. 4b) poveikį. Pav. 4 HSVtk /GCV terapija naudojant GSDMB
stipriklis varoma lentivirus vektorių pagerino išgyvenamumas PD pelių. (A) lentiviruso terapinis vektorius GSDMB
stipriklis (ENH) -driven išraiška herpes simplex virusas timidinkinaze (HSVtk). (B) ląstelių proliferacijos tiriant 60As6 ir Met-5A, transdukuoti terapinio vektoriaus, inkubuojant atlikto vidutiniu su (+) /be (-) gancikloviro (GCV). (C) gydymo HSVtk /GCV režimas už PD pelių. Baras, standartinis nuokrypis, p
P
-Pridėtinės iš Stjudento t
-test tarp išaugintų ląstelių su (+) ir be (-) GCV. (D) Mikroskopinis stebėjimas eksponuojami nedidelį gyventojų 60As6GFP ląstelių (žalia fluorescencijos) implantuojami į pelės pilvaplėvės ne dieną 10. (E) kiekis išliko pelių po HSVtk /GCV terapijos su prasme-Strand išreikšti vektorių (raudona) ir su antiprasmiq -strand išreikšti vektorių kaip nuoroda (mėlyna). Vidutinė gyvenimo trukmė iš kiekvienos grupės rodoma dešinėje pusėje su P CR.LT - vertę Stjudento t
-test tarp dviejų grupių
HSVtk /GCV terapijos okultinės PD pelių
Mes taikoma HSVtk /GCV terapija PD pelių. Šiame terapinio tyrime, mes paruošti dviejų tipų GSDMB
stipriklis-varoma lentivirus vektoriaus: vienas vektorius išreikštas prasminės-viją HSVtk kDNR ir buvo naudojami PD pelių gydymo, kadangi kito vektoriaus išreikštas Priešprasminis-kryptis ir buvo naudojamas kaip kontrolės. Terapija buvo pradėtas praėjus septynioms dienoms nuo pilvo ertmę Sėjimas 60As6 ląstelių išreiškė žalia fluorescencijos baltymų (60As6GFP). Šis režimas buvo skirta gydymui slapto PD modelio, kurioje 60As6GFP ląstelės buvo difuziškai transplantuota į pilvaplėvės ertmę (. 4c pav, d). Po trijų dozių gydymo, po 36 dienos, nė vienas iš devynių pelių, vartojusių HSVtk jausmas ekspresijos vektoriumi mirė, o du iš devynių atskaitos pelių jau mirė. Nei vienas iš devynių atskaitos pelių buvo gyvas dieną 57, t.y. aštuonias savaites po injekcijos 60As6GFP ląstelių; Tačiau, keturi iš devynių terapinių vektoriaus-pelių vis dar buvo gyvas (pav. 4e). Šis rezultatas rodo, kad gydymas gali pagerinti okultinės PD pelių prognozę.
Diskusijos Viesbutis The GSDMB
stipriklis diskai genų ekspresiją GC ląstelių
Anksčiau mes pranešta, kad GSDMB
išreiškiamas visų GC audinių ir ląstelių linijų išnagrinėjo [14], ir šio tyrimo mes parodė, kad LTR rengėjas diskai GSDMB
išraišką 25 30 GC egzempliorių (pav. 1c). Transkripcijos veikla LTR regione (pav. 2a), anksčiau buvo įrodyta reporteris mėginiais ne-GC ląstelių linijų [20, 21]. Tačiau, mes nustatėme, atskirą regioną su stipriu transkripcijos veikla pasroviui LTR regione, ir paskirta kaip GSDMB
stipriklis. Be dviejų GC ląstelių linijų, HSC-57 ir HSC-59, transkripcijos veikla šiame regione buvo aptikti reporteris tyrimus kitose GC ląstelių linijų, įskaitant MKN74 (santykinė liuciferazė aktyvumas buvo maždaug 1,9), SAK-60 (29,4 ), SSK-42 (2.5) ir SSK-44 (4,6), bet ne SSK-58 arba MKN28 (duomenų neparodytos) [14]. Taigi, GSDMB
stipriklis neverčia genų ekspresiją kai GC ląstelių.
Trumpinti regione, apimanti +496 prie +562 žymiai sumažino transkripcijos veikla GSDMB
stipriklis (. 2b pav, 562 į +989). Per 496 iki 562 regione, mes nustatėme, sutarimo jungimosi vietų kelių transkripcijos veiksnių, įskaitant GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 ir NFY-A, ir bazinių keitimą į bet kurį iš šių konsensuso sekos padarė neturi įtakos transkripcijos aktyvumą stipriklis (duomenys neparodyta). Transkripcijos veiksnys, kuris sąveikauja su stipriklis ir prisideda prie jos transkripcijos veikla dar nebuvo nustatytas.
Taikymas terapinio lentivirus vektorių į gydymą žmogaus okultinės PD pervežimas Gydomasis terapija nebuvo nustatytas PD. GC pacientams, sergantiems makroskopinis PD yra prastos prognozes, mediana bendrajam išgyvenamumui 3-6 mėnesius. Tie, kurie tik mikroskopinio PD taip pat turi prastą prognozę; jų 5 metų išgyvenamumas yra 0-18% [28]. Todėl svarbu nustatyti slaptasis PD iki citologinis tyrimo peritoninės lavažo skysčio ir visiškai išnaikinti vėžines ląsteles į pilvaplėvės ertmę. Metaanalizės pagal Cabalag kt
. nurodė, kad platus pilvaplėvės ertmę plovimas (EIPL, fiziologinio tirpalo 1 vada /dozė, 10 kartų) ir intraoperacinis pilvaplėvės ertmę chemoterapija (IIPC) su cisplatina žymiai pagerėjo 5 metų bendras išgyvenamumas, kad daugiau nei 40% [28]. Mūsų tyrimo rezultatai rodo, kad HSVtk /GCV terapija, naudojant lentivirus vektorių pagerina pacientų prognozę nepriklausomai, ir mes manyti, ji bus naudojama kaip konsolidaciniam gydymui,. Solidinių navikų su difuzinio augimo sudaryta iš daugelio miofibroblastus ir kelių laivams (pvz, difuzinis tipo GKS, kasos vėžio ir Tarpikliai tipo krūties vėžiu). Priklausomai nuo iš mikroaplinkos sąlygomis, kaip antai maistinių medžiagų trūkumo, šių navikų, rodo didelę paplitimas retai-proliferacinių naviko ląstelių. Taigi, difuzinis tipo GC ląstelės platinami pilvaplėvės ertmę, gali būti sudarytas iš gyventojų, kurie gali priešintis citotoksinis poveikis cisplatina. Lentivirus terapinis vektorius gali pristatyti HSVtk į abi plinta ir Neproliferuojančiose ląsteles. Be to, GSDMB
stipriklis leidžia GC ląstelėms būdingas HSVtk išraiška. Tai riboja išraiška sumažina mesothelial ląstelių pažeidimą, o tai reiškia, kad genų terapija gali būti atliekamas naudojant dozes pakankamai didelis, kad visiškai išnaikinti GC ląsteles, net ir tie, atsparus cisplatina, slaptosios PD. Tai greičiausiai yra ta, kad gydymas deriniu, EIPL ir IIPC, po HSVtk /GCV terapijos naudojant lentivirus vektorių, pagerins okultinės PD prognozę labiau nei EIPL ir IIPC sudėtinį gydymą ramybėje. Tikime, kad šis režimas yra verti būti skiriamas klinikinių tyrimų metu. Nors atrodo, kad GSDMB
stipriklis neveikia kai GC ląsteles, tolesni tyrimai, kuriais siekiama nustatyti papildomus GC-specifinis stiprikliai, bus išspręsti šią problemą.
Išvados Viesbutis The GSDMB
-driven HSVtk išraiška vektorius turėjo gydomąjį poveikį okultizmu PD modelio pelių. Ši strategija gali būti potencialiai naudojamas siekiant užkirsti kelią GC pacientus nuo perkančiosios PD ir taip pat vartojamas gydyti GC pacientus PD.
Deklaracijų
Padėka
Šio tyrimo metu parėmė Dotacijos-in-pagalbos moksliniams tyrimams (C .) iš Japonijos draugijos mokslo skatinimo (JSP KAKENHI Grantas skaičius 23.501.322)
papildomų failų
Papildoma failą 1: Stalas S1. Dešimt zondas rinkiniai, rodantys išraišką konkretų skleisti tipo skrandžio vėžio. Papildoma failą 2: S1 paveiksle. MYH11
nėra išreikštas skrandžio vėžio ląstelių linijas. Projekto vykdytojas, regionas tiek CXCR4
ir CXCR7
genų rodo transkripcijos veiklą tiek 60As6 ir MET-5A ląsteles. Konkuruojančių interesų Viesbutis The autoriai deklaruoja jie neturi konkuruojančius interesus.
Autoriai įnašai
NS ir SS suprojektuoti ir nukreipti šį tyrimą. NS atlikti biologinius tyrimus ir bandymus su gyvūnais paramos RK, FC ir KY. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Skrandžio vėžys universitete mokomojoje ligoninėje šiaurės vakarų Tanzanijoje: retrospektyvinė peržiūra 232 atvejų
• Priėmimo diagnozę poveikis skrandžio ištuštinimo sunkiai sergantiems pacientams