GSDMB pojačivač-driven HSV timidin kinaze-izražavanje vektor za kontrolu okultno peritonealnoj širenje želuca stanica raka

A GSDMB pregled pojačivač-driven HSV timidin kinaze-izražavanje vektor za kontrolu okultno peritonealnoj širenje želuca stanica raka pregled apstraktne pregled Pozadina pregled, rak želuca (GC) je jedan od glavnih malignih bolesti u svijetu, posebno u Azija i Japan i Koreja imaju najveću učestalost u svijetu. Budući da je većina slučajeva koji su rezistentni na terapiju umire zbog peritonejsku širenje (PD) od stanica raka, kontrolu PD je važno za preživljavanje pacijenta. GSDMB pregled je član obitelji gasdermin gena. Zato GSDMB pregled je izražena u mnogim tipovima raka, uključujući GC, vjerojatno je da je gen sadrži regulatorne regije koja se koristi za terapiju okultne PD putem ekspresije stanica raka specifičnih citotoksičnih gena. Pregled metode
Izvršili smo reporter analize identificirati regulatornu regiju za izražavanje stanica raka-specifične. Također smo izgradili lentivirusnog terapijski vektor koji izražava herpes simplex virus timidin kinazu (HSVtk) u staničnoj specifičan način GC, a testirani je u mišjem modelu PD-a. Pregled Rezultati
Identificirali smo regulatornu regiju na +496 do +989 od GSDMB pregled početka transkripcije i to određen kao GSDMB pregled pojačivač. Lentivirusnog terapijski vektor potisnut proliferacija GC stanične linije, 60As6, in vitro
u prisutnosti ganciklovira i intraperitonealo vektora produžuje rok preživljenja miševa koji su intraperitonealno ubrizgana 60As6 jedan tjedan prije primjene.
Zaključci
GSDMB
-driven HSVtk ekspresijski vektor je terapeutski učinak na okultne PD modela miševa. Ova strategija potencijalno može koristiti za liječenje pacijenata GC sa PD-a. Pregled Ključne riječi pregled želuca neoplazme peritonejsku šupljinu Genetska terapija HSV timidin Pozadina kinaze pregled karcinoma želuca (GC) je jedan od glavnih malignih bolesti, posebno u Aziji, i drugi vodeći uzrok smrti od raka povezane svijetu [1]. Obično se razvrstavaju u dvije vrste (Lauren je klasifikacija) [2], crijevna i difuzne, koje se smatra da odražavaju patogeneze [3]. Difuznog tipa GC (DGC) je pod-klasificiran kao slabo diferencirani GC (bez čvrste tipa) ili nediferencirane GC u sustavu klasifikacije Japanski rak želuca pridruživanju [4]. DGC je inflitrativni i često pokazuje agresivno invazije u stijenku želuca, što je rezultiralo metastaza i širenja GC stanica u peritonealnoj šupljini (peritonejsku širenja, PD).
Šire GC stanica u peritonealnoj šupljini dovesti do peritonealnoj karcinomatoza ( PC) [5]. PC uzrokuje gastrointestinalne simptome kao što su bol u trbuhu, mučnina i povraćanje, kao i sistemskim simptomima kao što su gubitak težine i ascite. PC ne samo jako pogoršava kvalitetu života GC bolesnika, ali to je ujedno i vodeći uzrok smrti u GC [6]. Sa samo suportivna skrb, medijan preživljenja bolesnika s PC je 3-6 mjeseci [7]. Ako se tretira sa sistemske kemoterapije, na isti način kao i za ostale metastatskih lezija PC pokazuje slabiji odgovor na terapiju od drugih vrsta metastaza u GC, uglavnom zbog lošeg rasporeda kemoterapeutska sredstva u peritonealnoj šupljini. Dakle, nedavni napori su usmjereni na inovativne PC terapeutika, kao kombiniranje citoreduktivni operacije, toplinska terapija, i intraperitonealne kemoterapije. Ti kombinirani pristupi malo poboljšali prognozu PC-u, iako je medijan vrijeme preživljavanja je još uvijek manje od 12 mjeseci, tako da je jasno da postoji praktično ograničenje na učinkovitost kirurškog cytoreduction [8, 9]. Nedavne studije ukazuju na to da je važno identificirati pacijente GC s okultnom PD izvođenjem ispit citološku za peritonejsku iscjetku, jer takvi slučajevi su pokazali bolju prognozu ukoliko dobije pretvaranje u negativnom citologije opsežnom intraoperacijske peritonejsku ispiranja slijedi u trbušnu šupljinu kemoterapije [10].
pojam "genske samoubojstvo" liječenju raka pomoću herpes simplex virus timidin kinazu (HSVtk), nastali u 1980. [11]. HSVtk katalizira fosforilaciju gvanozin analognom ganciklovirom (GCV) u obliku monofosfat koji se zatim fosforiliranog staničnim nukleotidnim kinaze u vrlo toksičnog ganciklovir trifosfata [12]. Ganciklovir trifosfat blokira replikaciju DNA, što dovodi do staničnog ciklusa i stanična smrt [13]. Terapija uključuje HSVtk prijenos u stanice raka, nakon čega slijedi GCV uprave, što je poznato kao genske samoubojstvo terapiju, a ova tehnika je nedavno koristi u kliničkom ispitivanju faze III na glioblastoma multiforme [12].
U ovoj studiji, razvili smo terapijski vektor koji eksprimira HSVtk u stanicama raka, koristeći regulatornu regiju gena gasdermin B (GSDMB
). GSDMB pregled je član gasdermin (GSDM pregled) obitelj koja se sastoji od četiri gena, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC
i GSDMD
[14, 15], te je izražena u proliferirajuće stanice normalnog epitela te u mnogim tipovima raka, uključujući jednjaka, želuca, jetre, crijeva, vrata maternice i rak dojke [14, 16-18]. GSDMB pregled, izraz je upravljan od strane dva promotora, staničnog promotora i LTR-izvedene promotora [19-21]. LTR-derived promotor (LTR promotor) djeluje u većini normalnih tkiva, osim u želucu, te u mnogim staničnim linijama raka, a stanični promotor aktivan u normalnom tkivu želuca u nekim staničnim linijama raka [20]. U ovom istraživanju, identificirali smo regiju u nizvodno od LTR promotora, koji su pokazali snažnu transkripcijsku aktivnost u staničnim linijama GC. Koristili smo ovu regiju konstruirati HSVtk-ekspresije virusnih vektora za kontrolu okultno PD.
Metode
ljudskih tkiva
Rak želuca (GC) tkiva nabavljeni su od National Cancer Center bolnici nakon primitka pismene suglasnosti iz svake pacijent, koji je odobren od strane National Cancer Center Institutional Review Board (ID: No.17-030). Tkiva Uzorci su odmah zamrznut u tekućem dušiku nakon kirurškog ekstrakciji i pohranjen na -80 ° C do upotrebe. Pregled analiza mikropolja pregled Ukupna RNA izolirana je suspendiranjem stanica u ISOGEN pufera za lizu (Nippon Gene, Toyama, Japan) taloženje s izopropanolom. Izvršili smo izraz analizira pomoću ljudskog izražavanja Array U95A inačicu 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA) prema protokolu proizvođača. Vrijednost izraz (prosječna razlika: AD) za svaki gen je izračunata korištenjem GeneChip analiza Suite verzija 4.0 softvera (Affymetrix). Hijerarhijski grupiranje microarray podataka provedena je pomoću GeneSpring (Agilent Technologies Ltd, Palo Alto, CA), Microsoft Excel i Cluster & TreeView [22, 23]. Svi podaci microarray su položene u MIAME Sukladno baze podataka, GEO (pristupni broj, GSE47007). Do Wilcoxon u pregled, -test (p izvoznici < 0,05) i pokazuje dva puta promjene, geni su izrazili posebno u difuzna tipa GC odabrani su [22]
stanične linije i primarne kulture miša. mezotelnih stanica
tri želučanih stanične linije raka, HSC-57, izveden iz intestinalne tipa GC i HSC-59 i HSC-60, kako proizlazi iz difuzno tipa GC, uspostavljeni su i karakterizirani s jednim od autora [24 ]. SNU16, proizlazi iz difuznih tipa GC, dao iz American Type Culture Collection (ATCC), druge dvije stanične linije s učinkovitosti u proizvodnji PD miševe, 60As6 i 60As6GFP (60As6 izražavanje zeleni fluorescentni protein), osnovan je od strane autora iz difuzni tip GC izvedeni HSC-60 staničnu liniju nakon nekoliko prolaza u trbušnu šupljinu presađivanje miševa [25]. CC-2511, stanična linija fibroblasta, kupljen je od Lonza, Japan (Tokyo, Japan). Sve stanične linije su uzgajane u Dulbecco Modified Eagle Medium. Miša mezotelnih skupljene su injekcijom 10 ml toplog 0,25% tripsin /EDTA otopine u peritonealnu šupljinu [26]. Stanice su inkubirane tijekom 3 dana u RPMI-1640 s L-glutaminom, fenol crvenom i HEPES (Wako, Tokio, Japan). Met-5A, humane stanične linije mezotelijalno, dao je ATCC i održava u Medium 199 (Life Technologies, Tokyo, Japan), uz dodatak 3,3 nM EGF (Life Technologies), 400 Nm hydrocortison (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA), 870 nM inzulina (Life Technologies) i 10% FBS.
RT-PCR pregled Ukupne RNA iz ljudskih normalnih organa su kupljena od BioChain, Hayward, CA. Ukupno RNA su izvađeni koristeći RNeasy Mini kit (QIAGEN, Tokyo, Japan). Nakon generiranja prvog lanca cDNA iz ukupne RNA pomoću Thermoscript RT-PCR System (Life Technologies, Tokyo, Japan), PCRjeizvedenas AccuPrime ™ PFX pregled, DNA polimeraze (Life Technologies) pod sljedećim uvjetima kruženju bilo 35 (LTR transkripata ) ili 25 ciklusa (drugi): 95 ° C tijekom 1 min; 56 ° C (β-aktin) ili 58 ° C (ostale) tijekom 1 min; i 72 ° C tijekom 1 min. Korišteni su sljedeći primer kompleta: za stanični promotor prijepis, 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'i 5' CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3 '; za LTR promotor izveden iz transkripata, 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'i 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; za 3 'strane GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3' i 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3 '; za MYH11 Netlogu, 5'CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 "i 5'CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; a za ß-aktin Netlogu, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'i 5' CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3 'reporter.
genomske fragment, od -1080 do +1053 od GSDMB Netlogu i sadrži LTR promotor je amplificiran PCR-om primjenom LA Taq Topli start DNA polimeraze (Takara) u 35 ciklusa 96 ° C u trajanju od 30 s i na 68 ° C 2 min, primjenom primera kompleta: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'i 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', i umetnut u vektor pGL3 Basic (Promega, Madison, WI). To je bio skraćen pomoću restrikcijskih mjesta: HNE-
I i Eco pregled, r generirati -1035 do 1053 fragment; KPN pregled sam i eko pregled R I za -426 do 1053; NHE pregled I i AFL pregled II za -61 do 1053; NHE pregled I. i Eko pregled 81 I za 129-1053; a NHE
I i Stu pregled sam +496 do +1053. 496-1053 reporter konstrukcija bila je dodatno skraćen sa restrikcijskih enzima: Nhe
I i SWA pregled sam 757-1053; NHE pregled I. i PVU Netlogu II za 860 do 1053; NHE
I i Bst
X sam +989 do +1053; Xhol pregled sam i Bst
X i za 496-989; Xhol pregled sam i Pvu pregled II za 496 do 860; i XhoI pregled, ja i SWA pregled sam +496 do +757. Za daljnje skraćivanjem 496 do 989 fragmenta, PCR je izveden uz fragmenata kao predloška pomoću Ex Taq DNA polimeraze (Takara) u 35 ciklusa 95 ° C 1 min, 58 ° C 1 min, i 72 ° C 1 min, pomoću sljedećih primera skupa, jer 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'i 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; i +649 do +989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'i 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Nakon pojačavanja, fragmenti su ubačeni u pGL4.12 [luc2CP pregled] vektor (Promega). -1 Kb uzvodno regije CXCR4
i CXCR7 pregled su pripravljeni genomskom PCR uporabom MightyAmp DNA polimeraze (Takara) u 35 ciklusa od 98 ° C tijekom 10 s, 62 ° C tijekom 15 s, te 68 ° C 2 min, uz upotrebu slijedećih primera skupa: za CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'i 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; i CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'i 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Ovi ulomci su ubačeni u pGL4.12 [luc2CP pregled] vektor. Jedan mikrogram svaki konstrukt i Renilla luciferaza kontrole reporter vektor (pRL-SV40 vektor, Promega) sutransficirana su u 1 × 10 5 stanice korištenjem Superfect transfekcijski reagens (QIAGEN). Je ispitivanje luciferaze provedena 24 sata nakon uvođenja reporter, korištenjem Dual-Luciferase reporter Assay System (Promega). Ispitivanje je provedeno u tri primjerka. Pregled GSDMB pregled pojačivač-HSVtk lentivirus vektor
pMFG-HSVtk vektor dao je Riken BRC kroz Nacionalni Bio-Resource Projekta MEXT, Japan, ustupio Dr . Hirofumi Hamada, a HSVtk cDNA je izrezan iz njega kao dočasnik
i-Bam
HI fragment. Konstruirati GSDMB pregled pojačivač-HSVtk lentivirusom vektor, najprije 496 do 989 fragment (GSDMB pregled pojačivač) je umetnuta u pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) između HNE-pregled, I i Hind
III web stranice, a zatim HSVtk cDNA umetnuta u vektor na Bam pregled HI mjestu u naprijed (za osjetilno-strand izrazu) ili obrnuto (za suprotne cjedilu izraz) smjeru. Dalje, GSDMB pregled pojačivač-HSVtk smisao i GSDMB pregled pojačivača-HSVtk antisense fragmenti izrezani su iz plazmidnih vektora kao Nhe
I-Not I.
fragmente i umetnut pLVSIN-CMV neo vektori između XbaI pregled, ja i ne
I. mjesta. Konačno, CMV promotor je uklonjen sa lentivirusni konstrukata. Za generiranje virusnih čestica koje sadrže vektore, konstrukti su uvedeni u Lenti-X ™ 293 T stanice (Takara) pomoću Lenti-X ™ HTX pakiranje System (Takara). Nakon 72 h'inkubacije, medij je skupljen i virusni titar (cfu /ml) određena je pretvaranje u stanice HT-1080, u prisutnosti polibren (5 ug /mL u mediju za kulturu, Sigma-Aldrich). Čestice se primjenjuju na Met-5A i 60As6 (1 × 10 5 stanica po zdjelici, u triplikatu) in vitro
u prisustvu polibren (5 ug /ml) i stanice se inkubiraju u mediju koji sadrži Gancicrovir (GCV, 5 ug /ml, WAKO) tijekom 5 dana za ispitivanjima rasta stanica. Testovi su izvedeni u triplikatu te P
-vrijednosti od Studentov t-test pregled između kultiviranih stanica s (+) ili bez (-) GCV izračunate pregled liječenju PD mišjem modelu s GSDMB pojačivač-HSVtk vektori pregled smo prethodno opisani model miša PD (PD miševe) koji je proizveden pomoću intraperitonalne injekcije 60As6 stanica [25]. 60As6GFP stanice (1 × 10 6 stanica po mišu) su injektirani u peritonealnu šupljinu 18 miševa (6 tjedana starih miševa CB17 /ICR-Prkdc < scid > /CrlCrlj genotip: scid /scid, Charles River, Yokohama Japan) na dan 1. miševi su podijeljeni u dvije skupine; jedna je skupina bila injicira antisense ekspresijskim vektorom, a druga skupina se injicira sense vektora; obje skupine su zatim intraperitonealno injektirano 2 mL PBS otopine koja sadrži virusne čestice (5 × 10 5 cfu) i ganciklovir (2 mg) na 8, 10 i 12 dana. izračunati su srednja opstanak vrijeme svake skupine, a P pregled-vrijednost od Studentov t-test pregled između dviju skupina. Studija je odobren od strane National Cancer Center odbora o životinjama. Pregled Rezultati
Identifikacija pojačivač regiji GSDMB Netlogu, koji vozi na ekspresiju gena u GC stanicama
Identificirati promoter /regije koje će biti učinkovit u razvoju terapeutskih vektor za peritonealnu širenje (PD), prvo smo tražili gena češće izraženim u difuzno tipa GC odnosu na intestinalni tipa GC uz komparativnu analizu ekspresije gena između 12 primarnih difuzno vrsta i 18 crijeva -types jer PD češće vidjeti u difuzna tipa GC nego u probavnom tipa [22]. Primijetili smo da su četiri od deset Affymetrix GeneChip sonda postavlja pokazuje najvišu sjedeća promjenu ekspresije gena u difuzna tipa GC odnosu na crijevne tipa su sonde setovi za MYH11 Netlogu (miozina, teški lanac 11, glatka gena mišića, dodatne datoteke 1: Tablica S1). Nakon potvrde da gen nije izražen u besmrtna humana Mezotelijalno stanične linije Met-5A (podaci nisu prikazani), odabrali smo MYH11 pregled kao snažan kandidat za gen čiji je promotor omogućuje difuzni tip GC specifičnu ekspresiju HSVtk. Ipak, gen nije izražen u 60As6 stanicama koje su korištene za izradu PD modela miševa (Dodatni datoteka 2: Slika S1). Vjerojatno je da MYH11 pregled se izražava u rakom fibroblasti koji su posebno obiluje difuzno tipa GC tkiva. Zatim ide iz analiza mikropostrojima podataka, pomaknut ćemo našu pozornost na uzvodnim područjima CXCR4 pregled (kemokina (CXC motiv) receptora 4 gena) i CXCR7 pregled (kemokina (CXC motiva) receptora 7 gen), kao i su izraženi u mnogim tipovima karcinoma i imaju važnu ulogu u metastazi [27]. Međutim, korištenje reporter testova, utvrdili smo da su uzvodno područja ovih gena su transkripcijski aktivan u oba Met-5A i 60As6 stanica (Dodatni datoteka 2: Slika S2), što znači da regije voziti ekspresiju HSVtk u ljudskim mesothelial stanica in vivo pregled. Konačno, usredotočili smo se na GSDMB pregled gena, kao što je naša ranija istraživanja pokazala da je snažno izražena u GC tkiva i stanične linije [14]. Pregled GSDMB pregled transkribira dva promotora, mobilne i LTR promotora ( sl. 1a), a drugi se uglavnom koristi u normalnim tkivima, te stanične linije karcinoma [19-21]. Potvrdili smo ove rezultate obavljanjem RT-PCR analize na RNA iz nekoliko vrsta normalnim tkivima (Sl. 1b). RT-PCR na GC kirurške primjerci pokazali da LTR promotor je korišten u 14 od 15 crijevna tipa GCS i 11 od 15 difuzna tipa GCS (sl. 1c). Sl. 1 GSDMB pregled gen prepisao staničnoj i ltr promotora. (A) Shematski prikaz dviju promotora. (B) Ekspresija dva transkripta, jedan po staničnog promotora, a drugi od LTR, u ljudskim normalnim tkivima (RT-PCR). Četiri varijante ljudskog GSDMB transkripta su registrirani u GenBank; Varijanta 1. (NM_001042471), varijanta 2 (NM_018530), varijanta 3 (NM_001165958) i varijantu 4 (NM_001165959). Transkripcija varijanti 1, 3 i 4 je upravljan od strane staničnog promotora i da varijanta 2 je od LTR promotora. 3 'strane u GSDMB pregled transkripata je zajednička za svaki od njih. (C) Ekspresija LTR transkripata u želučanom tkivu karcinoma, 15 intestinalni tip i 15 uzoraka difuzno tipa (RT-PCR na kirurških uzoraka)
Za identificiranje područje kritični za transkripcijsku aktivnost u GC stanicama, DNA fragment rasponu -1080 do +1053 bb, pozicija iz početno mjesto transkripcije za LTR promotora, bio izoliran (Sl. 2a). U reporter testovi na skraćene DNA fragmenata pomoću dvije stanične linije GC, HSC-57 i HSC-59, naznačeno da je 496-989 regija imala jake transkripcijske aktivnosti, čak i jače nego što je izvorni -1.080-1053 fragmenta, i da daljnje skraćivanja na 496 do 989 fragmenta rezultira značajno smanjenje transkripcijskom aktivnošću (sl. 2b). Regija odgovara ovaj ulomak s jakim transkripcije aktivnosti dobio je ime GSDMB pregled prolaska. Sl. 2. Identifikacija GSDMB pregled pojačivač. (A) prikazuje, shematski prikazuje reporterske konstrukte koji se koriste u pokusima luciferaze. Dugog terminalnog ponavljanja (LTR) element ljudskog endogenog retrovirus je prikazano strelicom dvoglavim. Položaj je od početno mjesto transkripcije za prijepis LTR promotora. (B) ispitivanja Luciferaze pomoću dva rak želuca stanične linije, HSC-57 i HSC-59, otkriva područje s jakim transkripcijsku aktivnost, u rasponu od +496 do +989, koji je određen kao GSDMB pregled pojačivačem. Vector, prazna reporter vektor, Bar, standardna devijacija pregled izgradnja GSDMB pregled pojačivača-driven HSVtk lentivirusa vektora pregled Mi smo ranije izvijestili miša PD modela (PD miševi) koji je producirao intraperitonealnom injekcijom 60As6 stanica [ ,,,0],25]; U ovoj studiji, razvili smo virusni vektor terapeutski za liječenje PD miševa. Za ispitivanje čvrstoće transkripcije aktivnosti GSDMB pregled pojačivača u 60As6, reporter analize su izvršene pomoću reporter konstrukciju za uzvodnim područjima CXCR4 Netlogu i CXCR7 Netlogu za usporedbu. U GSDMB pregled pojačivač pokazao jači transkripcijsku aktivnost u 60As6 stanicama nego CXCR4 Netlogu ili CXCR7 pregled uzvodno regijama i, važnije, GSDMB pregled pojačivač imali vrlo slabu transkripcijsku aktivnost u peritonealnoj mesothelial stanica miša i na Met-5A, humane stanične linije mezotelijalno (Sl. 3). Taj rezultat sugerira da je GSDMB pregled pojačivač omogućuje HSVtk ekspresiju gotovo isključivo u 60As6 ali ne i u stanicama mezotelnih peritonealnu šupljinu PD miševa, a vjerojatno nije u ljudskoj peritonealnoj mezotelijumu. Sl. 3 GSDMB pregled pojačivač ima jake transkripcijske aktivnosti u staničnoj liniji 60As6. Luciferaze testovi s tri vrste stanica u kulturi: 60As6 stanice koje su korištene za izradu peritonejsku širenje (PD) Model miševi u ovoj studiji, primarne kulture stanica peritonealnom mesothelial stanica miša i uspostavio ljudski mesotherial stanične linije Met-5A. Bar, standardna devijacija pregled Zatim smo ispitali učinak terapije HSVtk /GCV tipkama GSDMB pregled obogaćivanja-driven HSVtk lentivirusom vektora na 60As6 in vitro pregled (Sl. 4a). Broj 60As6 stanica prenosio s lentivirusa vektora značajno je smanjena kada se inkubira u mediju obogaćenom sa GCV; S druge strane, isto HSVtk /GCV tretman nije imao učinka na broj stanica Met-5A (Sl. 4B). Sl. 4 HSVtk /GCV terapija u GSDMB pregled obogaćivanja-driven lentivirusom vektor poboljšali stopu preživljavanja PD miševa. (A) lentivirusnim terapijski vektor GSDMB pregled pojačivač (ENH) -driven izražavanje herpes simplex virus timidin kinaze (HSVtk). (B) staničnim proliferacijskim ispitivanjima na 60As6 i Met-5A transducirane s terapeutskom vektora, izvedena je inkubacijom u mediju s (+) /bez (-) ganciklovir (GCV). (C) režim HSVtk /GCV terapiji PD miševa. Bar, standardna devijacija, P pregled, P
-vrijednost od Studentov t-test pregled između kultiviranih stanica sa (+) i bez (-) GCV. (D) Mikroskopsko promatranje izložena malu populaciju 60As6GFP stanica (zelena fluorescencija) ugrađuju se u miša peritoneum, na dan 10. (e) Broj preživjelih miševa nakon HSVtk /GCV terapije s osjećajem cjedilu izražavanje vektor (crveno) i sa antisens- -strand izražavanje vektor kao referentnu (plavo). Srednje vrijeme preživljavanja svake skupine prikazan je na desnoj strani s P Netlogu - vrijednost Studentov t-test pregled, između dvije skupine
HSVtk /GCV terapiju okultnih PD miševa pregled smo se primjenjuje HSVtk /GCV terapija PD miševa. U tom terapijskom pokusu, pripremili smo dva tipa u GSDMB pregled pojačivača-driven lentivirusa vektora: jedan vektor izrazio osjetilnih pramen HSVtk cDNA, a koristila se za liječenje Parkinsonove miševa, dok se drugi vektor izrazio suprotnog smjera cjedilu a je korišten kao kontrola. Terapija je počela sedam dana nakon intraperitonealne inokulacije 60As6 stanica koje izražavaju zeleni fluorescentni protein (60As6GFP). Režim je namijenjen za liječenje okultne PD model u kojem su stanice 60As6GFP difuzno presađenih u peritonealnu šupljinu (Sl. 4c, d). Nakon tri doze liječenja, a na dan 36, niti jedan od devet miševa tretiranih s HSVtk smisla-vektoru ekspresije umrla, a dva od devet referentnih miševa već umro. Niti jedan od devet referentnih miševa bili živi na dan 57, tj osam tjedana nakon ubrizgavanja 60As6GFP stanica; Međutim, četiri od devet terapijskih vektora tretiranih miševa još uvijek živ (Sl. 4e). Ovaj rezultat sugerira da je terapija može poboljšati prognozu okultnih PD miševa. Pregled Rasprava
GSDMB pregled pojačivač vozi na ekspresiju gena u GC stanicama pregled Ranije smo izvijestili da GSDMB pregled je izražena u svim GC tkiva i stanične linije pregledao [14], au ovom istraživanju smo pokazali da LTR promotor upravlja GSDMB pregled izraz u 25 od 30 GC jedinki (Sl. 1 C). Transkripcijski aktivnost LTR kraja (Sl. 2a) koji je prethodno pokazana je reporter testovima ne-GC stanicama [20, 21]. Međutim, pronašli smo različito područje s jakim transkripcije aktivnosti u nizvodno od LTR regije, a to su označeni kao GSDMB pregled pojačivač. Osim dvije stanične linije GC, HSC-57 i HSC-59 je transkripcijska aktivnost ove regije se detektira reporter testovima drugih GC stanične linije, uključujući MKN74 (relativna aktivnost luciferaze je bila oko 1,9), HSC-60 (29,4 ) HSC-42 (2.5) i HSC-44 (4,6), ali ne i na HSC-58 ili MKN28 (podaci nisu prikazani) [14]. Dakle, u GSDMB pregled pojačivač ne voziti na ekspresiju gena u nekim GC stanicama.
Skraćivanja regije obuhvati +496 do +562 značajno smanjio transkripcijski aktivnost GSDMB pregled pojačivačem (sl. 2b, 562 do +989). U 496 do 562 regije, pronašli smo konsenzus-vezna mjesta nekoliko transkripcijskih čimbenika, uključujući GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 i NFY-A, te bazne supstitucije na bilo koji od ovih suglasnim sekvencama učinio ne utječe na transkripcijsku aktivnost pojačivača (podaci nisu prikazani). Faktor transkripcije koji surađuje s pojačivačem i pridonosi još nije identificiran njegova transkripcijska aktivnost. Pregled Primjena terapijskog lentivirusa vektora liječenju ljudskog okultne PD
kurativnih terapije nije utvrđena za PD. GC bolesnici s makroskopskim PD imaju loše prognoze, a medijan ukupnog preživljavanja od 3-6 mjeseci. Oni koji imaju samo mikroskopski PD također imaju lošu prognozu; njihova pet godina stopa preživljavanja je 0-18% [28]. Stoga je važno za detektiranje skrivenih PD od citološkim ispitivanjem peritonealnu ispirku i potpuno iskorijeniti stanice raka u peritonealnoj šupljini. Meta-analize po Cabalag sur pregled. pokazala da velika u trbušnu šupljinu ispiranje (EIPL, fiziološka 1 legla /dozi, 10 puta) i intraoperacijske u trbušnu šupljinu kemoterapije (IIPC) sa cisplatinom značajno poboljšana 5 godine ukupno preživljenje za više od 40% [28]. Rezultati našeg istraživanja pokazuju da HSVtk /GCV terapija pomoću lentivirusom vektor poboljšava prognozu bolesnika samostalno, a pretpostavljamo da će se koristiti kao konsolidacije terapije. Solidni tumori s difuznom rast se sastoji od mnogih miofibroblasta i nekoliko plovila (na primjer, difuzna tipa GCS, raka gušterače i scirrhous vrste raka dojke). Ovisno o uvjetima mikro poput nedostatka hranjivih tvari, ovi tumori pokazuju visoku pojavnost rijetko proliferacijskih tumorskih stanica. Tako, difuzno tipa GC stanice diseminirane u peritonealnoj šupljini može se sastojati od populacije koja može odoljeti citotoksični učinak cisplatinom. Lentivirus terapijski vektor može uvesti HSVtk u oba proliferacijom i ne-proliferacijom stanica. Osim toga, u GSDMB pregled pojačivač omogućuje GC stanica specifične HSVtk izraz. To ograničeno izraz smanjuje oštećenje mezotelnih stanica, što znači da je genska terapija može biti izvedena pomoću doze su dovoljno visoke za potpuno iskorjenjivanje GC stanica, čak i one otporne na cisplatin u okultne PD. Vrlo je vjerojatno da kombinirana terapija, EIPL i IIPC, nakon čega slijedi HSVtk /GCV terapije koja koristi lentivirusom vektor, poboljšati će prognozu okultne PD znatno više nego što se EIPL i IIPC samo kombiniranu terapiju. Vjerujemo da će ovaj režim je dostojan da bude stavljen na kliničkim ispitivanjima. Iako se čini da je GSDMB pregled pojačivač ne radi u nekim GC stanicama, daljnja istraživanja kojima je cilj identificiranje dodatnih GC-specifične pojačivače, riješiti će taj problem.
Zaključci
GSDMB
-driven HSVtk izraz vektor je terapeutski učinak na okultne PD modela miševa. Ova strategija potencijalno može koristiti kako bi se spriječilo bolesnika GC od ugovaranja PD i također se koristi za liječenje pacijenata GC sa PD-a. Pregled deklaracija
Priznanje pregled ovog istraživanja bio je podržan od strane Grants-u-Aid za znanstvena istraživanja (C .) u Japanskom društva za promicanje znanosti (JSPS KAKENHI Grant broj 23501322)
Dodatne datoteke
Dodatne datoteke 1: Tablica S1. Top deset sonda seta pokazuju ekspresiju specifičan da bi se proširile pisati raka želuca. Dodatni datoteka 2: Slika S1. MYH11 pregled nije izražen u želučanim staničnim linijama raka. Promotor područje i CXCR4 Netlogu i CXCR7 pregled gena pokazuje transkripcijsku aktivnost u oba 60As6 i met-5A stanica. Suprotstavljenih interesa
Autori izjavljuju da nemaju konkurentne interese.
Autori doprinosa
NS i HS dizajniran i režirao ovu studiju. NS izvedena biološke analize i eksperimente na životinjama uz potporu RK, FC KY. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Rak želuca u sveučilišnoj nastavi bolnici u sjeverozapadnom Tanzaniji: retrospektiva pregled 232 cases
• Utjecaj dijagnoze prijema na pražnjenje želuca kod kritičnih bolesnika patients