GSDMB tehostajana perustuva HSVtymidiinikinaasi ilmentävä vektori ohjaukseen okkultistisen vatsakalvon levittäminen mahasyövän cells

GSDMB
tehostajana perustuva HSVtymidiinikinaasi ilmentävä vektori ohjaukseen okkultistisen vatsakalvon levittäminen mahalaukun syöpäsolujen
Abstract
taustaa
Mahasyöpää (GC) on yksi tärkeimmistä pahanlaatuisten sairauksien maailmanlaajuisesti, erityisesti Aasiassa ja Japanissa ja Koreassa on korkein esiintyvyys maailmassa. Koska suurin osa tapauksista, jotka reagoivat huonosti hoitoihin kuolee vatsakalvon levitys (PD) syöpäsolujen, valvontaan PD on tärkeää potilaan selviytymisen. GSDMB
on jäsen gasdermin geeniperheen. Koska GSDMB
on ilmaistu monia syöpätyyppejä, mukaan lukien GC, on todennäköistä, että geeni sisältää säätelyalueen, joka on käytetty terapiassa piilevän PD kautta syöpäsoluja erityinen ilmaisu sytotoksisten geenien.
Menetelmät
Teimme toimittaja määrityksissä tunnistaa säätelyalue syöpäsolu-ekspressiota. Meillä on myös rakennettu lentiviraalinen terapeuttinen vektori, joka ekspressoi herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin (HSVtk) on GC solu- spesifisellä tavalla, ja testattiin se hiirimallissa PD.
Tulokset
olemme tunnistaneet säätelyalue on +496 jotta +989 päässä GSDMB
transkription aloituskohdasta ja nimennyt sitä GSDMB
tehostajana. Lentiviruksen terapeuttinen vektori tukahdutti leviämisen GC solulinjan, 60As6, in vitro
läsnäollessa gansikloviiri, ja intraperitoneaalisesti vektorin pidensivät olevaksi hiirten intraperitoneaalisesti 60As6 viikkoa ennen hallinnon.
Johtopäätökset
GSDMB
ajettavat HSVtk ekspressiovektori oli terapeuttinen vaikutus okkultismin PD malli hiirillä. Tämä strategia voidaan mahdollisesti käyttää hoitoon GC potilaita PD.
Avainsanat
Vatsa kasvaimet vatsaonteloon Genetic hoito HSVtymidiinikinaasi Background
Mahasyöpää (GC) on yksi tärkeimmistä pahanlaatuisten sairauksien, erityisesti Aasiassa, ja toinen johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti [1]. Se on yleensä luokitellaan kahteen tyyppiin (Lauren luokitus) [2], suoliston ja hajanainen, joiden arvellaan heijastaa sen synnyssä [3]. Diffuusi-tyypin GC (DGC) on sub-luokiteltu huonosti eriytetty GC (ei-kiinteä tyyppi) tai erilaistumaton GC että Japani mahasyövän Association luokitusjärjestelmän [4]. DGC on infiltratiivinen ja osoittaa usein aggressiivisia invaasion mahalaukun seinämän, jolloin etäpesäkkeitä ja leviämistä GC solujen vatsaonteloon (vatsakalvon levitys, PD).
Levitetään GC soluja vatsaonteloon aiheuttaa vatsakalvon carcinomatosis ( PC) [5]. PC aiheuttaa vatsaoireita, kuten vatsakipu, pahoinvointi ja oksentelu, sekä systeemisiä oireita, kuten laihtuminen ja askites. PC ei ainoastaan ​​voimakkaasti heikentää elämänlaatua GC potilaiden, mutta se on myös johtava kuolinsyy GC [6]. Tukevalla hoidolla yksin, mediaanielossaolosta potilaiden PC on 3-6 kuukautta [7]. Jos käsitelty systeemistä kemoterapiaa, samalla tavalla kuin muita etäpesäkeleesioita, PC esittää huonompi vaste terapiaan kuin muita etäpesäkkeiden GC, pääasiassa koska huono jakautuminen kemoterapeuttisen aineen vatsaonteloon. Siksi viimeaikaiset pyrkimykset ovat keskittyneet innovatiivisten PC terapeuttisten, kuten yhdistäminen sytoreduktiivisen kirurgian, lämpö hoito, ja vatsaonteloon kemoterapiaa. Nämä yhdistetyt lähestymistavat ovat hieman parantaneet ennusteeseen PC, vaikka mediaanielossaolosta aika on edelleen alle 12 kuukautta, tehdään selväksi, että on olemassa käytännön raja tehoon kirurgisten cytoreduction [8, 9]. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että on tärkeää tunnistaa GC potilaalla on okkultistisen PD suorittamalla cytologic tarkastelu vatsakalvon huuhtelunäytteessä, koska tällaiset tapaukset osoittavat parannetun ennusteen jos ne on saatu muuntaminen negatiivinen sytologia laajat intraoperative vatsakalvon huuhtelu seurasi intraperitoneaalinen kemoterapiaa [10].
käsite "itsemurhan geeni" syöpähoidon käyttäen herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin (HSVtk), syntynyt vuonna 1980 [11]. HSVtk katalysoi fosforylaation guanosiini analogisten gansikloviiri (GCV) tulee monofosfaattimuodon joka myöhemmin fosforyloituu solujen nukleotidin kinaasit osaksi erittäin myrkyllistä gansikloviiritrifosfaatiksi [12]. Gansikloviiritrifosfaatiksi lohkot DNA: n kahdentuminen, mikä johtaa solusyklin pysähtymiseen ja solukuolemaa [13]. Therapy johon HSVtk siirtämistä syöpäsoluihin, jonka jälkeen GCV hallinto, tunnetaan itsemurha geeniterapia, ja tämä tekniikka on äskettäin käytetty vaiheen III kliiniseen glioblastoma multiforme [12].
Tässä tutkimuksessa kehitimme terapeuttinen vektori, joka ilmaisee HSVtk syöpäsoluissa, käyttäen säätelyalue on gasdermin B-geeni (GSDMB
). GSDMB
on jäsen gasdermin (GSDM
) perhe, joka koostuu neljästä geenistä, GSDMA
, GSDMB
, GSDMC
ja GSDMD
[14, 15], ja se on ilmaistuna jakautuviin soluihin normaalin epiteelin ja myös monissa syöpätyyppien, kuten ruokatorven, mahalaukun, maksan, paksusuolen, kohdunkaulan ja rintasyöpiä [14, 16-18]. GSDMB
ilmentymistä ohjaavat kaksi promoottoria, solun promoottori ja LTR-peräinen promoottori [19-21]. LTR-johdettu promoottori (LTR-promoottori) on aktiivinen useimmissa normaaleissa kudoksissa, lukuun ottamatta mahassa, ja monissa syöpäsolulinjoissa, kun taas solun promoottori on aktiivinen normaalissa vatsassa kudosten ja joissakin syöpäsolulinjoissa [20]. Tässä tutkimuksessa olemme tunnistaneet alueen alavirtaan LTR-promoottori, joka osoitti vahvaa transkriptionaalista aktiivisuutta GC solulinjoissa. Käytimme tätä aluetta rakentamaan HSVtk-lauseke virusvektori ohjaukseen okkultismin PD. Tool Menetelmät
Ihmiskudokset
Mahasyöpää (GC) kudokset saatiin National Cancer Center Hospital saatuaan kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen kultakin potilas, joka hyväksyttiin National Cancer Center Institutional Review Board (ID: No.17-030). Kudosnäytteitä pakastettiin välittömästi nestetyppeen jälkeen kirurgisten uuttamalla, ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.
Microarray-analyysi
Kokonais-RNA eristettiin suspendoimalla solut ISOGEN lyysipuskuria (Nippon Gene, Toyama, Japani) jonka jälkeen saostetaan isopropanolilla. Suoritimme ilme analyyseistä Human Expression Array U95A versio 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA) mukaan toimittajien protokollia. Ilmaus arvo (keskimääräinen ero: AD) kunkin geenin laskettiin käyttäen GeneChip- Analysis Suite 4.0 ohjelmistoa (Affymetrix). Hierarkkinen klusterointi microarray tietojen suoritettiin käyttäen GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., Palo Alto, CA), Microsoft Excel, ja Cluster & TreeView [22, 23]. Kaikki microarray tiedot on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta, GEO (hakunumero; GSE47007). Wilcoxonin u
-testi (p
< 0,05) ja näyttämällä 2-kertainen muutos, geenit ilmaistaan ​​erityisesti heikossa-tyyppinen GC valittiin [22].
Solulinjat ja primaariviljelmää hiiren mesoteelisolujen
Kolme mahasyövän solulinjoissa, HSC-57, on johdettu suoliston-tyypin GC, ja HSC-59 ja HSC-60, molemmat peräisin diffuusi-tyypin GC, perustettiin ja tunnettu siitä, että yksi tekijöistä [24 ]. SNU16, jotka ovat peräisin diffuusi-tyypin GC, on annettu American Type Culture Collection (ATCC), Kaksi muuta solulinjaa tehokkuutta tuottamaan PD hiirillä, 60As6 ja 60As6GFP (60As6 ilmentävät vihreää fluoresoivaa proteiinia), perustettiin tekijät pois diffuusi-tyyppinen GC johdettu HSC-60 solulinjan useiden kohtien vatsaonteloon elinsiirtojen hiirille [25]. CC-2511, joka on fibroblastisolulinjan, ostettiin Lonza, Japani (Tokio, Japani). Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä Dulbeccon Modified Eagle Medium. Hiiren mesoteelisolujen kerättiin injektoimalla 10 ml lämmitettyä 0,25% trypsiini /EDTA-liuosta vatsaonteloon [26]. Soluja inkuboitiin 3 päivää RPMI-1640 täydennettynä L-glutamiinilla, fenolipunaista ja HEPES (Wako, Tokio, Japani). Met-5A, ihmisen mesothelial solulinja, saatiin ATCC ja ylläpidetään Medium 199 (Life Technologies, Tokio, Japani) täydennettynä 3,3 nM EGF (Life Technologies), 400 nM hydrokortisonia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA), 870 nM insuliinin (Life Technologies) ja 10% FBS: ää.
RT-PCR
Yhteensä RNA: ita ihmisen normaalia elimiä hankittiin BioChain, Hayward, CA. Yhteensä RNA: t uutettiin käyttäen RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Tokio, Japani). Jälkeen muodostetaan ensimmäisen juosteen cDNA kokonais-RNA: sta käyttäen Thermoscript RT-PCR System (Life Technologies, Tokio), PCR suoritettiin AccuPrime ™ Pfx
DNA Polymerase (Life Technologies) seuraavissa sykliolosuhteita joko 35 (LTR selostukset ) tai 25 sykliä (muut): 95 ° C 1 min; 56 ° C (β-aktiini) tai 58 ° C (muut) 1 min; ja 72 ° C 1 min. Seuraavat alukesarjat käytettiin: solun promoottori transkriptin 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'ja 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; LTR-promoottori-johdettu transkriptien 5'-TTCAGTTGCTTCAGGCCATC-3 'ja 5'-CCAGAATTTGAAACTCAGCC-3'; 3'-puolella GSDMB
, 5'-ATTCTGGACTTCCTGGATGC-3 'ja 5'-ATGTATGAAATCCAGGCTGG-3'; for MYH11
, 5'CAGTGACGATGAGAAGTTCC-3 'ja 5'- CGCAGAAGAGGCCAGAGTAC; ja β-aktiini
, 5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3 'ja 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3'.
Reporter Assay
genominen fragmentti, -1080-1053 ja GSDMB
ja joka sisältää LTR-promoottori, monistettiin PCR: llä käyttämällä LA Taq Hot Start DNA-polymeraasia (Takara), 35 sykliä 96 ° C 30 s ja 68 ° C: ssa 2 minuutin ajan, käyttäen alukesarjoja: 5'-CTTCCTGAGATTCAGAGGCC-3 'ja 5' -CTCGAGTTCACTGTGTTAGCCAGG-3 ', ja insertoida pGL3 perusvektoriin (Promega, Madison, WI). Se oli katkaistu käyttämällä restriktiokohtia: Nhel
I ja Eco
R I tuottaa -1035-1053 fragmentti; Kpn
I ja Eco
R I -426-+1.053; Nhel
I ja Af
II -61-+1053; Nhel
I ja Eco
81 I 129-1053; ja Nhel
I ja Stu
I 496-1053. 496-1053 reportterikonstruktio oli edelleen katkaistu restriktioentsyymeillä: Nhel
I ja Swa
I 757-1053; Nhel
I ja PvuII
II 860-1053; Nhel
I ja Bst
X I 989-1053; Xho
I ja Bst
X I 496-989; Xho
I ja PvuII
II 496-860; ja Xho
I ja Swa
I 496-757. Edelleen katkaisu 496-989-fragmentti, PCR suoritettiin fragmentti mallina käyttäen Ex Taq DNA-polymeraasia (Takara), 35 sykliä 95 ° C 1 min, 58 ° C 1 min, ja 72 ° C 1 min, käyttäen seuraavia alukesarjoja sillä 562-989, 5'-GCTAGCTGTGGGATTTGTACACATCC-3 'ja 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'; ja 649-989, 5'-GCTAGCTTTATTTCCACTGGAAACCG-3 'ja 5'-AGATCTCGACTGGGATTACAGG-3'. Monistamisen jälkeen fragmentit insertoitiin pGL4.12 [luc2CP
] -vektoriin (Promega). -1 Kb ylävirran alueiden CXCR4
ja CXCR7
valmistettiin genomisen PCR: llä käyttämällä MightyAmp DNA-polymeraasia (Takara), 35 sykliä 98 ° C: ssa 10 s, 62 ° C: ssa 15 s, ja 68 ° C: ssa 2 min, käyttäen seuraavia alukesarjat: ja CXCR4
, 5'-GCTAGCGCGCCCACTGCAAACCTCAG-3 'ja 5'-CTTAAGTCACTTTGCTACCTGCTGC-3'; ja CXCR7
, 5'-GCTAGCCGGAGGCCCCCGGAGAGCAG-3 'ja 5'-CTTAAGTTTGCAACAACTGTGAGC-3'. Nämä fragmentit insertoitiin pGL4.12 [luc2CP
] vektori. Yksi mikrogramma kutakin konstruktia ja Renilla lusiferaasin ohjaus reportteri-vektoriin (PRL-SV40 vektori, Promega) olivat kotransfektoitiin 1 x 10 5-soluissa käyttämällä SuperFect Transfection Reagent (QIAGEN). Lusiferaasimääritys suoritettiin 24 tunnin kuluttua toimittaja käyttöönoton käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Määritys suoritettiin kolminkertaisena.
GSDMB
tehostajana-HSVtk lentivirus vektori
pMFG-HSVtk vektori tarjosi RIKEN BRC kautta National Bio-Resource Project on MEXT, Japani, luvalla tohtori . Hirofumi Hamada, ja HSVtk-cDNA leikattiin sen Neo
I-Bam
HI-fragmentti. Rakentaa GSDMB
edistäjän-HSVtk lentivirus vector, ensin 496-989-fragmentti (GSDMB
tehostajana) insertoitiin pcDNA3.1 (+) (Life Technologies) välillä Nhe
I ja Hind
III sivustoja, ja sitten HSVtk cDNA liitettiin vektoriin Bam
HI-eteenpäin (varten sense-säikeen ilmaus) tai taaksepäin (antisense-juoste ilmaus) suuntaan. Seuraavaksi GSDMB
tehostaja-HSVtk mielessä ja GSDMB
edistäjän-HSVtk antisense fragmentit leikattiin plasmidista vektorit Nhel
I-Not
I fragmentit ja insertoitiin pLVSIN-CMV neo vektorien välillä Xba
ja Not
minä sivustoja. Lopuksi CMV-promoottori poistettiin lentiviruksen konstrukteja. Tuottaa viruspartikkeleita, jotka sisältävät vektoreita, konstruktit viedään Lenti-X ™ 293 T Cells (Takara) käyttäen Lenti-X ™ HTX Packaging System (Takara). Sen jälkeen kun 72 h'-inkuboinnin jälkeen alusta kerättiin ja virustiitteri (cfu /ml) määritettiin transduktio osaksi HT-1080-soluissa, kun läsnä oli polybreeniä (5 ug /ml elatusaineessa, Sigma-Aldrich). Hiukkaset levitettiin Met-5A ja 60As6 (1 x 10 5 solua per malja, kolmena kappaleena) in vitro
läsnä polybreenin (5 ug /ml), ja soluja inkuboitiin elatusaineessa, joka sisälsi Gancicrovir (GCV, 5 ug /ml, Wako) ja 5 päivää solujen kasvun määrityksissä. Määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja P
-arvo Studentin t
-testi Viljeltyjen solujen kanssa (+) ja ilman sitä (-) GCV laskettiin.
Hoito PD hiirimallissa GSDMB
tehostajana-HSVtk vektorit
Olemme aiemmin raportoitu hiiren PD-malli (PD-hiiret), joka on valmistettu ruiskuttamalla intraperitoneaalisesti 60As6 soluihin [25]. 60As6GFP-solut (1 x 10 6 solua per hiiri) injektoitiin vatsaonteloon 18 hiirtä (6 viikkoa vanha hiirillä CB17 /Icr-Prkdc < scid > /CrlCrlj Genotyypin: scid /scid, Charles River, Yokohama Japani) päivänä 1. hiiret jaettiin kahteen ryhmään; yksi ryhmä injektoitiin antisense-ekspressiovektorin, ja toinen ryhmä injektoitiin mielessä vektorin; molemmat ryhmät sitten injektoitiin intraperitoneaalisesti 2 ml: lla PBS-liuosta, joka sisälsi viruspartikkelin (5 x 10 5 pmy) ja Gansikloviiri (2 mg) 8, 10 ja 12 päivää. Keskimääräinen elinaika kunkin ryhmän ja P
-arvo Studentin t
-testi kahden ryhmän välillä laskettiin. Tutkimuksen hyväksyi National Cancer Centerin komitea eläinkokeiden.
Tulokset
tunnistaminen tehostajaa alueen GSDMB
, joka ajaa geeniekspressiota GC soluissa
tunnistamiseksi promoottori /tehostaja alueita, olisivat tehokkaita kehittämisessä terapeuttisen vektorin vatsakalvon levitys (PD), ensin etsittiin geenien useammin ilmaistaan ​​diffuusi-tyyppinen GC kuin suoliston-tyyppinen GC käyttäen vertailevaa geeniekspressioanalyysissä välillä 12 ensisijaisen hajanainen-tyyppejä ja 18 suoliston -types, koska PD on useammin nähdään diffuusi-tyyppinen GC kuin suoliston-type [22]. Olemme huomanneet, että neljä kymmenestä Affymetrix GeneChip koetinsarjojen, jolla on suurin fold-muutos geeniekspression diffuusi-tyypin GC verrattuna suoliston-tyypin olivat koetin sarjat MYH11
(myosiinin raskaan ketjun 11, sileän lihaksen geenin, Additional tiedosto 1: Taulukko S1). Vahvistettuaan, että geeni ei ilmenny ihmisen immortalisoitu mesothelial solulinja Met-5A (tuloksia ei ole esitetty), valitsimme MYH11
niin vahva ehdokas geeni, jonka promoottori mahdollistaa diffuusi-tyypin GC erityinen ilmaisu HSVtk. Kuitenkin geeni ei ilmaistu 60As6 soluissa, joita käytettiin tehdä PD mallin hiiriä (Additional tiedosto 2: Kuva S1). On todennäköistä, että MYH11
ilmaistaan ​​syöpään liittyvän fibroblastit, jotka ovat erityisen runsaasti diffuusi-tyypin GC kudoksissa. Seuraavaksi menee ulos microarray data-analyysi, siirsimme huomiomme ylävirran alueiden CXCR4
(kemokiini (CXC-motiivin) -reseptorin 4 geeni) ja CXCR7
(kemokiini (CXC-motiivin) reseptorin 7-geeni), kun sekä ilmaistaan ​​monia syöpätyyppejä ja niillä on tärkeä rooli etäpesäkkeiden [27]. Kuitenkin käyttämällä toimittaja määrityksiä, huomasimme, että ylävirran alueilla näiden geenien olivat kopioinnin suhteen aktiivisia sekä Met-5A ja 60As6 solut (Additional tiedosto 2: Kuva S2), mikä tarkoittaa, että alueet ohjaavat ilmentymistä HSVtk ihmisen mesoteelisolut in vivo
. Lopuksi, keskityimme GSDMB
geeni, kuten edellisessä Tutkimus osoitti, että se on voimakkaasti ilmaistu GC kudoksissa ja solulinjoissa [14].
GSDMB
transkriptoidaan kaksi promoottoria, solu- ja LTR promoottorit ( Fig. 1 a), ja jälkimmäinen on pääasiassa käytetään normaaleissa kudoksissa ja syöpäsolulinjoissa [19-21]. Olemme vahvistaneet nämä havainnot suorittamalla RT-PCR analyysit RNA useita normaaleissa kudoksissa (Fig. 1b). RT-PCR GC kirurgisista näytteistä osoitettiin, että LTR-promoottori käytettiin 14 15 suolen-tyyppinen GC ja 11 15 diffuusi-tyyppinen GC (Fig. 1 c). Kuva. 1 GSDMB
geeni transkriboidaan Cellular ja LTR promoottorit. (A) kaavamainen esitys kahden promoottorin. (B) Expression of kaksi transkriptien, yhden solun promoottori ja toinen LTR, ihmisen normaaleissa kudoksissa (RT-PCR). Neljä variantteja ihmisen GSDMB transkriptin on rekisteröity GenBank; variantti 1 (NM_001042471), vaihtoehto 2 (NM_018530), variantti 3 (NM_001165958) ja variantti 4 (NM_001165959). Transkriptio varianttien 1, 3 ja 4 ohjaa solun promoottori, ja että variantti-2 LTR-promoottori. 3 'puolella GSDMB
transkriptit on yhteinen kullekin. (C) Expression of LTR-transkriptien mahasyövän kudoksissa, 15 suoliston-tyypin ja 15 diffuusi-tyypin näytteistä (RT-PCR: llä kirurgisista näytteistä)
tunnistamiseksi alueen kriittinen transkriptionaalista aktiivisuutta GC-soluissa, DNA-fragmentti, joka kattaa -1080-1053 emäsparin asema peräisin transkription aloituskohdasta varten LTR-promoottori, eristettiin (Fig. 2a). Reportteri määritykset katkaistu DNA-fragmentit käyttäen kahta GC solulinjoja, HSC-57 ja HSC-59, osoitti, että 496-989 alue oli voimakas transkriptionaalinen aktiivisuus, jopa vahvempi kuin alkuperäisen -1080-1053 fragmentti, ja että edelleen katkaisu 496-989 fragmentti johtanut merkittävään vähentämiseen transkriptionaalista aktiivisuutta (kuvio. 2b). Alueella, joka vastaa tätä fragmenttia, jolla on vahvat transkriptionaalista aktiivisuutta nimettiin GSDMB
tehostajana. Kuva. 2 tunnistaminen GSDMB
tehostajana. (A) kaavamainen kuva, joka esittää reportterikonstrukteja käytetään Lusiferaasimäärityksiä. Long terminal repeat (LTR) osatekijä ihmisten Endogeenisen retrovirus näkyy kaksipäinen nuoli. Asema on transkription aloituskohdasta varten transkriptio LTR-promoottori. (B) Luciferase määritykset käyttämällä kahta mahasyövän solulinjoissa, HSC-57 ja HSC-59, osoitti alueen voimakas transkriptionaalinen aktiivisuus, joka ulottuu 496-989, joka nimettiin GSDMB
tehostajana. Vektori, tyhjä toimittaja vektori, Bar, keskihajonta
rakentaminen GSDMB
edistäjän perustuva HSVtk lentivirus vector
Olemme aiemmin raportoitu hiiren PD-malli (PD-hiiret), joka on valmistettu ruiskuttamalla intraperitoneaalisesti 60As6 soluihin [ ,,,0],25]; Tässä tutkimuksessa kehitimme virus- terapeuttisen vektorin hoitoon PD hiirillä. Tutkimiseksi vahvuus transkriptionaalista aktiivisuutta GSDMB
tehostajan 60As6, toimittaja määritykset suoritettiin käyttäen reportterlkonstruktiomme ylävirran alueiden CXCR4
ja CXCR7
vertailua varten. GSDMB
edistäjän osoitti voimakkaampaa transkriptionaalista aktiivisuutta 60As6 soluissa kuin CXCR4
tai CXCR7
ylävirran alueilla, ja tärkeintä, GSDMB
tehostaja oli hyvin heikko transkriptionaalista aktiivisuutta hiiren vatsakalvon mesoteelisolut ja met-5A, ihmisen mesothelial solulinjassa (Fig. 3). Tämä tulos viittaa siihen, että GSDMB
edistäjän mahdollistaa HSVtk ilmentyminen lähes yksinomaan 60As6 mutta ei mesoteelisolujen ja vatsaonteloon PD hiiret, ja todennäköisesti ole ihmisen vatsakalvon mesothelium. Kuva. 3 GSDMB
tehostajana on vahva transkriptioaktiviteettia joka 60As6 solulinjassa. Lusiferaasimäärityksiä kanssa kolmenlaisia ​​viljeltyjen solujen: 60As6 soluja, joita käytettiin tekemään vatsakalvon levitys (PD) malli Tässä tutkimuksessa hiirille, primaariviljelmää soluja hiiren vatsakalvon mesoteelisolujen ja vakiintunut ihmisen mesotherial solulinjassa Met-5A. Bar, keskihajonta
Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus HSVtk /GCV-hoidon avulla GSDMB
tehostajana perustuva HSVtk lentivirus vektori on 60As6 in vitro
(Fig. 4a). Lukumäärä 60As6 solujen transduktio lentivirus vektori väheni merkittävästi, kun inkuboitiin väliaineessa täydennetty GCV; Toisaalta, samaan HSVtk /GCV hoito ei ollut vaikutusta solujen määrä Met-5A (Fig. 4b). Kuva. 4 HSVtk /GCV-hoidon avulla GSDMB
tehostajana perustuva lentivirus vektori paransi eloonjääntiprosentin PD hiirillä. (A) lentiviraalinen terapeuttinen vektori GSDMB
tehostajana (Enh) -indusoituun ilmentymistä herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin (HSVtk). (B) Solujen proliferaatio määritykset 60As6 ja Met-5A transdusoitu terapeuttinen vektori, suoritettiin inkuboimalla keskipitkällä kanssa (+) /ilman (-) gansikloviiri (GCV). (C) kuuri HSVtk /GCV terapiaa PD hiirillä. Bar, keskihajonta, P
, P
-arvon Studentin t
-testi väliin viljeltyjen solujen kanssa (+) ja ilman (-) GCV. (D) mikroskooppinen näytteillä pieni populaatio 60As6GFP solujen (vihreä fluoresenssi) istutettiin hiiren vatsakalvon päivänä 10. (e) määrä selvisi hiirillä HSVtk /GCV-hoidon kanssa sense-juosteen ilmentävällä vektorilla (punainen) ja antisense säikeen ilmentävät vektorin viite (sininen). Mean elinaika kunkin ryhmän näkyy oikealla puolella P
- arvo Studentin t
-testi kahden ryhmän välillä
HSVtk /GCV-hoidon piilevän PD hiirten
Käytimme HSVtk /GCV hoito PD hiirillä. Tämän terapeuttisen määrityksessä, valmistimme kahdenlaisia ​​GSDMB
edistäjän perustuva lentivirus vector: yksi vektori ilmaistuna mielessä-juoste HSVtk cDNA: n ja sen hoitoon PD hiirissä, kun taas toinen vektori ilmaistuna antisense-juosteen ja sitä käytettiin kontrollina. Hoito aloitettiin seitsemän päivää intraperitoneaalisen inokulaation 60As6 solut, jotka ilmentävät vihreää fluoresoivaa proteiinia (60As6GFP). Tämä hoito-ohjelma oli suunniteltu hoitoon piilevän PD malli, jossa 60As6GFP soluja hajottavasti Siirto tehty vatsaonteloon (kuviot. 4c, d). Sen jälkeen, kun kolme annosta hoidon päivänä 36, yksikään yhdeksästä hiirestä käsiteltiin HSVtk sense-ekspressiovektori oli kuollut, kun taas kaksi yhdeksästä viite hiiret oli jo kuollut. Mikään yhdeksästä viittaus hiiristä oli elossa päivänä 57 eli kahdeksan viikon kuluessa injektion 60As6GFP solujen kuitenkin, neljä yhdeksän terapeuttisen vektorin hoidetuista hiiristä oli edelleen elossa (Fig. 4e). Tämä tulos viittaa siihen, että hoito voi parantaa ennustetta okkulttisen PD hiirillä.
Keskustelu
GSDMB
edistäjän ohjaa geenin ilmentymistä GC-soluissa
Aiemmin on raportoitu, että GSDMB
ilmentyy kaikissa GC kudoksia ja solulinjoja tutkitaan [14], ja tässä tutkimuksessa osoitimme, että LTR-promoottori ohjaa GSDMB
ilmentymistä 25 30 GC yksilöt (Fig. 1 c). Transkriptionaalista aktiivisuutta LTR-alueen (Fig. 2a) on aiemmin osoitettu toimittaja määrityksissä ei-GC-solulinjat [20, 21]. Kuitenkin löysimme selvä alueen voimakas transkriptionaalinen aktiivisuus alavirtaan LTR alueen, ja on nimetty sen GSDMB
tehostajana. Lisäksi kaksi GC solulinjat, HSC-57 ja HSC-59, transkriptionaalista aktiivisuutta tämän alueen havaittiin reportteri määrityksissä muiden GC solulinjoissa, mukaan lukien MKN74 (suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus oli noin 1,9), HSC-60 (29,4 ), HSC-42 (2,5) ja HSC-44 (4,6), mutta ei HSC-58 tai MKN28 (tuloksia ei ole esitetty) [14]. Siten GSDMB
tehostajaa ei geeni-ilmentymistä joissakin GC-soluissa.
Katkaisu alueella, joka kattaa 496-562 vähensi merkittävästi transkriptionaalista aktiivisuutta GSDMB
tehostajana (Fig. 2b, +562 ja +989). Vuonna 496-562 alueella, löydettiin konsensus-sitoutumiskohtia useiden transkriptiotekijöiden, mukaan lukien GATA2, GATA3, GATA4, YY1, SOX5, SOX9, SOX10 ja NFY-A, ja pohja-substituutio missä tahansa näistä konsensussekvenssit teki ei vaikuta transkriptionaalisen aktiivisuuden tehostajana (tuloksia ei ole esitetty). Transkriptiotekijän, joka on vuorovaikutuksessa tehostajana ja edistää sen transkriptionaalista aktiivisuutta ei ole vielä tunnistettu.
Soveltaminen terapeuttisen lentivirus vektori hoitoon ihmisen okkulttisen PD
parantavaa hoitoa ei ole osoitettu PD. GC potilaalla on makroskooppisten PD on huono ennusteita, joiden mediaani kokonaiselinaika 3-6 kuukauden. Ne, joilla on vain mikroskooppisen PD on myös huono ennuste; niiden 5 vuoden pysyvyys on 0-18% [28]. Siksi on tärkeää havaita okkultistisen PD mukaan cytologic tarkastelu vatsakalvon huuhtelunäytteessä ja täysin poistaa syöpäsoluja vatsaonteloon. Meta-analyysit Cabalag et al
. osoitti, että laaja vatsaonteloon huuhtelu (EIPL, fysiologinen suolaliuos 1 pentue /annos, 10 kertaa) ja intraoperative vatsaonteloon kemoterapiaa (IIPC) sisplatiinin parantunut merkittävästi 5 vuoden eloonjäämiseen yli 40% [28]. Tulokset Tutkimuksemme osoittavat, että HSVtk /GCV-hoidon avulla lentivirus vektori parantaa ennustetta potilaiden itsenäisesti, ja oletamme, sitä käytetään tukihoitona. Kiinteät kasvaimet epämääräistä kasvun koostuvat monista myofibroblasteja ja muutama alus (esim diffuusi-tyyppinen GC, haiman syövät ja scirrhous tyyppi rintasyöpä). Riippuen olosuhteista microenvironment, kuten ravinteiden puute nämä kasvaimet osoittavat korkeaa esiintyvyys harvoin-proliferatiivisia syöpäsoluja. Näin ollen, diffuusi-tyypin GC-soluja levitettiin vatsaonteloon voi koostua väestöstä, joka voi vastustaa sytotoksista vaikutusta sisplatiinin. Lentivirus terapeuttinen vektori voi esitellä HSVtk molempiin jakautuviin että ei-jakautuvat solut. Lisäksi GSDMB
edistäjän mahdollistaa GC soluspesifisiä HSVtk ilmentymistä. Tämä rajoitettu ilmaus minimoi mesothelial soluvaurioita, mikä tarkoittaa, että geeniterapia voidaan suorittaa käyttäen annoksia riittävän korkea kokonaan poistaa GC soluja, jopa ne kestävät sisplatiinin, okkultismin PD. On todennäköistä, että yhdistelmähoito, EIPL ja IIPC, jonka jälkeen HSVtk /GCV-hoidon avulla lentivirus vektori, parantaa ennustetta piilevän PD merkittävämmin kuin EIPL ja IIPC yhdistelmähoitoa yksin. Uskomme, että tämä hoito ansaitsee saattamista kliinisissä tutkimuksissa. Vaikka näyttää siltä, ​​että GSDMB
tehostajana ei toimi joissakin GC soluissa, lisätutkimuksia tavoitteena on määrittää ylimääräisiä GC-erityisiä parantajia, ratkaisee tämän ongelman.
Johtopäätökset
GSDMB
ajettavat HSVtk ilme vektori oli terapeuttinen vaikutus okkultismin PD malli hiirillä. Tämä strategia voidaan mahdollisesti käyttää estämään GC potilaita sairastua PD ja myös hoitoon GC potilaita PD.
Julistukset
kuittaus
tutkimuksessa tukivat Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (C ) Japan Society for Promotion of Science (JSPS KAKENHI Grant Number 23501322).
Muita tiedostoja
Additional tiedosto 1: Taulukko S1. Kymmenen koetinsarjojen osoittaa ilmaus erityisiä hajanainen-tyypin mahasyöpä. Muita tiedosto 2: Kuva S1. MYH11
ei ilmenny mahasyövässä solulinjoissa. Promoottori sekä CXCR4: ää
ja CXCR7
geenien osoittaa transkriptionaalista aktiivisuutta sekä 60As6 ja MeT-5A-solut. Kilpailevat edut
Kirjoittajat julistaa heillä ole kilpailevia intressejä.
Tekijät osuudet
NS ja HS suunnitellut ja ohjannut tätä tutkimusta. NS suoritetaan biologinen analyysit ja eläinkokeet tuella RK, FC ja KY. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Mahasyöpä yliopistossa opetussairaalassa Luoteis Tansaniassa: retrospektiivinen katsaus 232 tapausta
• Vaikutus ottamista diagnoosin mahalaukun tyhjenemiseen kriittisesti sairaiden potilaiden