Nedreglering av bindvävstillväxtfaktor hämmar tillväxten och invasion av gastriska cancerceller och dämpar peritoneal dissemination

nedreglering av bindvävstillväxtfaktor hämmar tillväxten och invasion av gastriska cancerceller och dämpar peritoneal spridning Bild Sammanfattning
Bakgrund
Connective vävnads tillväxtfaktor (CTGF) har visat sig vara inblandade i tumörutveckling och progression. Dock fortfarande till stor del okända roll CTGF i magcancer.
Resultat
I denna studie visade vi att CTGF starkt uttrycktes i magcancer vävnader jämfört med matchade normala mag vävnader. CTGF uttryck i tumörvävnad i samband med histologisk grad, lymfkörtel metastas och peritoneal spridning (P < 0,05). Patienter med positiv CTGF uttryck hade väsentligt lägre sammanlagd postoperativ 5 års överlevnad än de med negativ CTGF uttryck (22,9% mot 48,1%, P < 0,001). Vi visade att knockdown av CTGF uttryck signifikant hämmade celltillväxt av gastric cancerceller och minskad cyklin D 1 uttryck. Dessutom knockdown av CTGF uttryck också markant minskat migration och invasion av gastric cancerceller och minskade uttrycket av matrix metalloproteinas (MMP) -2 och MMP-9. Djurstudier visade att nakna möss injicerade med CTGF knockdown stabila cellinjer innehöll ett mindre antal peritoneala seeding noduler än cellinjerna kontroll.
Slutsatser
Dessa data antyder att CTGF spelar en viktig roll vid celltillväxt och invasion i human magcancer och det verkar vara en potentiell prognostisk markör för patienter med magcancer.
Nyckelord
bindvävstillväxtfaktor Mage tumörer Cell proliferation invasiv Peritoneal spridning Introduktion
Trots betydande framsteg inom cancerforskning, cancer förblir en världsomspännande hälsoproblem och dödlighet på grund av cancer förblir hög [1]. Gastric cancer är den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i världen samtidigt som det tycks vara en nedåtgående trend i förekomst, särskilt i västvärlden; Det är fortfarande vanligast rapporterade i Kina och Japan [2, 3]. Även om prognosen för patienter med avancerad magsäckscancer tycks ha förbättrats till följd av standardiseringen av kirurgiska tekniker och de senaste framstegen inom kemoterapi, förblir den 5-åriga postoperativ överlevnad låg [4, 5]. Peritoneal metastaser är den vanligaste och betydande orsak till dödsfall efter operation för magcancer [6, 7]. Men mekanismerna för peritoneal metastas har inte tydligt definierade.
Bindvävstillväxtfaktor (CTGF), också känd som CCN2, är en medlem av CCN familjen, inklusive cysteinrik protein 61 (Cyr61), även känd som CCN1, och nefroblastom-over uttryckt gen (november), även känd som CCN3 samt Wisp-1 /elm1 (CCN4), Wisp-2 /rcop1 (CCN5) och Wisp-3 (CCN6) [8, 9]. CTGF tros vara en multifunktionell signal modulator inblandad i ett stort antal biologiska eller patologiska processer, såsom angiogenes, osteogenes, fibros i njurar och hud, och tumörutveckling [10-12]. Även om rollen av CCN2 i normal vävnad fibros har varit väl studerat [13], är funktionen av CCN2 i cancer inte lika väl förstådda. Intressant nog har CCN2 identifierats som en onkogen i en mängd olika cancertyper, men anses vara en tumör-suppressor-genen i andra former av cancer [14]. Överuttryck av CTGF återfinns i prostatacancer [15], gliom [16], bröstcancer [17], och vuxna akut lymfatisk leukemi [18]. Ökad CTGF uttryck har associerats med utvecklingen av livmoderhalscancer tumörer [19], och esofagus skivepitelcancer [20]. Omvänt, i lung adenokarcinom [21] och koloncancer [22], överuttryck av CTGF hämmar invasion och metastas av cancerceller både in vitro och in vivo.
Kliniska studier har visat att överuttryck av CTGF var signifikant korrelerad med lymfkörtel metastaser och dålig prognos hos patienter med magcancer [23, 24]. Det är dock fortfarande okänd exakta roll CTGF i magcancer. I denna studie upptäckte vi CTGF uttryck i magcancer vävnader. Vi fann att CTGF överuttrycktes i magcancer, och dess uttryck i samband med aggressivt beteende av magcancer. Vi använde sedan siRNA-teknik för att knockdown endogen CTGF uttryck i gastric cancerceller. Vi visade att nedreglering av CTGF hämmade tillväxten och invasionen av magcancer in vitro och försvagade peritoneal spridning in vivo. Vår studie belyser starkt betydelsen av CTGF i tillväxt och invasionen av magcancer, och kan ge en terapeutiskt mål i magcancer.
Material och metoder
Reagens
Dimetylsulfoxid (DMSO) och trypsin köptes från Sigma (St. Louis, MO, USA). DMEM, streptomycin och andra cellodlings leveranser var från GibcoBRL (Grand Island, NY, USA). Fetalt bovint serum var från Hyclone (Logan, UT, USA). MTT [3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltrazolium bromid] erhölls från Fluka (Ronkonkoma, NY, USA). CTGF, cyklin D1, matrixmetalloproteinas (MMP) -2, MMP-3, MMP-9 och GAPDH primära antikroppen, såväl som andra antikropp Rhodamine (TRITC) -konjugerade affinipure get-anti-mus-IgG erhölls från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Kalifornien, USA). CTGF ELISA-kit köptes från R &D (Minneapolis, MN, USA). Trizol och Lipofectamine 2000 köptes från Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). SYBR @ Primescript ™ RT-PCR-kit var från Takara Biotechnology, Japan.
Vävnadsprover och immunhistokemisk färgning
tumörprover erhölls från 110 patienter med magcancer, som genomgick kirurgi vid institutionen för kirurgiska onkologi, Första anslutna Hospital of China Medical University under perioden 2003-2005. Samtliga patienter genomgick gastrctomy och deras kliniska och patologiska data fanns tillgängliga. Normala magen vävnader togs från matchade distala opererande marginal för magcancer prover. Alla kirurgiska prover undersöktes av erfarna patologer och distala opererande marginalen var tumörfria. De färska vävnaderna skars i små bitar, snabbfrystes i flytande kväve omedelbart och förvarades vid -80 ° C fram till proteinextraktion. Studieprotokollet granskades och godkändes av den etiska kommittén i Kina Medical University. Idéer för immunohistokemisk färgning, 4 pm histologiska sektioner avparaffinerades med xylen och rehydreras genom en graderad serie av alkohol. Sektionerna kokades sedan under 10 minuter i 0,01 M citratbuffert och endogent peroxidas blockerades genom inkubation i 0,3% H 2 O 2 i metanol under 30 min. Icke-specifik bindning blockerades genom att inkubera objektglasen med normalt getserum under 30 min vid rumstemperatur. Sektionerna inkuberades över natt vid 4 ° C med 1:50 utspädning av CTGF primära antikroppen. Sektionerna exponerades för biotin-märkt sekundär antikropp under 1 timme, till en streptavidin-peroxidas reaktionssystemet, och sedan utvecklas med DAB- H 2 O 2. Färgning poängsattes enligt följande skala: 0, ingen färgning; 1+, minimal färgning; 2+, måttlig till stark färgning i åtminstone 20% av cellerna; 3+, stark färgning i åtminstone 50% av cellerna. Fall med 0 eller 1+ färgning klassificerades som negativa, och fall med 2+ eller 3+ färgning klassades som positiv.
Cell Culture
Mänskliga gastric cancercellinjer, MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 och MGC803 erhölls från Department of cellbiologi, Kina Medical University, Kina. De odlades i DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum, 100 U /ml penicillin, 100 | ig /ml streptomycin vid 37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% CO 2. Cellerna rubbas användning av 0,25% trypsin och 0,02 mol /L EDTA i PBS för subkultur.
Konstruktion av CTGF knockdown stabila cellinjer
Två små störande RNA (siRNA) oligonukleotider syntetiserades för att rikta två olika regioner i CTGF cDNA: GTGCATCCGTACTCCCAAA (PSC 1) och GCTAAATTCTGTGGAGTAT (PSC2). De klonades in i siRNA expressionsvek pGCsilencer ™ U6.Neo.GFP. Den icke-specifika siRNA användes som en negativ kontroll (PSNC). SiRNA expressionsplasmiderna transfekterades in SGC7901 celler med användning av Lipofectamine 2000. Cellerna screenades med G418 (800 | ig /ml), och de kolonier plockades efter 3 veckor, bestämda genom RT-QPCR och Western blöt. Celler transfekterade med PSC 1, PSC2 eller PSNC betecknades PSC 1-celler, PSC2 celler eller PSNC celler, respektive.
Kvantitativ realtids-polymeraskedjereaktion (RT-QPCR) Review Total RNA isolerades från cellpellets med användning av Trizol-reagens. Totalt RNA (1 pg) omvandlades till cDNA med användning av en RT (omvänt transkriptas) reaktionssats. Realtids-PCR utfördes med användning av Mx3000P realtids-PCR-system enligt tillverkarens anvisningar och SYBR ® Premix ExTaq som en DNA-specifik fluorescerande färgämne. PCR utfördes under 40 cykler av 95 ° C under 5 s och 60 ° C under 40 s. Primersekvenser visas i tabell 1. Tröskelcykeln (Ct) erhölls och relativa mängderna bestämdes för varje prov normaliserat till GAPDH. Uttryck av mRNA beräknades med ΔΔCt metod [25] .table en PCR primersekvenser
Gene
primersekvenser (5'-3 ') framåt och bakåt

Produkt (bp)

CTGF
CTTGCGAAGCTGACCTGGAA
AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA
90
MMP-2
ATGACATCAAGGGCATTCAGGAG
TCTGAGCGATGCCATCAAATACA
135
MMP-3
GGGTGAGGACACCAGCATGA
CAGAGTGTCGGAGTCCAGCTTC
178
MMP-9
TCCCAGACCTGGGCAGATTC
GCAAAGGCGTCGTCAATCAC
124
Cyclin D1
GATGCCAACCTCCTCAACGAC
CTCCTCGCACTTCTGTTCCTC
171
GAPDH
GCACCGTCAAGGCTGAGAAC
TGGTGAAGACGCCAGTGGA
138
Western blot-analys
Vävnader eller celler lyserades i RIPA-buffert kompletterad med blandning proteasinhibitor under 30 min vid 4 ° C. Cellysaten sedan sonikerades kortvarigt och centrifugerades (14000 g vid 4 ° C) under 15 min för att avlägsna olösliga material. Lika stora mängder av protein separerades med SDS-PAGE och överfördes till ett PVDF-membran. Membranen blockerades med 5% fettfri torrmjölk och inkuberades sedan med första antikropp, följt av pepparrotsperoxidas-konjugerad sekundär antikropp. Proteinband visualiserades genom ECL kemiluminescens-metoden.
Immunfluorescens och konfokal avbildning
Cellerna på Lab-Tek vävnadsodlingskammarobjektglas fixerades i kall 100% metanol under 10 min och blockerades sedan med normalt getserum under 30 min . Cellerna inkuberades med den primära antikroppen över natten vid 4 ° C, tvättades 3 gånger i PBT (PBS med en ‰ Triton X-100), och inkuberades därefter med andra antikropp konjugerad med rodamin. DNA färgämnet DAPI användes för att färga DNA. Cellerna avbildas på en Leica SP2AOBS konfokalmikroskop.
Konditionerat medium (CM) insamling och Enzymkopplad immun (ELISA) Review 3 × 10 5 celler såddes i 100 mm vävnadsodlingsskål med DMEM innehållande 10 % fetalt bovint serum under 2 dagar. Därefter tvättades cellerna två gånger med PBS och inkuberades med 5 ml serumfritt DMEM. 48 h senare tillsattes det konditionerade mediet uppsamlades och centrifugerades vid 2000 g under 5 minuter, får passera genom filter (porstorlek, 0,45 um) och lagrades vid -80 ° C fram till användning.
Nivåerna av CTGF i det konditionerade mediet från gastriska cancercellinjer mättes med användning av humant Quantikine ELISA-kit enligt tillverkarens instruktioner.
MTT proliferationsanalys
förmåga cellulär proliferation bedömdes med hjälp MTT [3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2 , 5-diphenyltrazolium bromid] analys. Approximativt 5 x 10 3-celler såddes i 96-brunnars odlingsplattor och odlades i serumfritt DMEM under 24, 48, 72 och 96 h, respektive. Då celler inkuberades med 20 | il MTT (10 mg /ml) under 4 h vid 37 ° Cand 200 | il DMSO pipetterades för solubilisering av formazanprodukten under 20 min vid rumstemperatur. Den optiska densiteten (OD) bestämdes med användning av en spektrofotometer (Bio-Rad) vid en våglängd av 570 nm.
Kolonibildningsanalys
5 × 10 2-celler suspenderade i 2 ml 0,3% agaros DMEM-medium innehållande 10% fetalt bovint serum ströks ut i 6-brunnars plattor på toppen av befintliga 0,6% botten agaros med samma medium. Plattorna inkuberades vid 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator. Efter tre veckor, cellkolonier > 0,1 mm i diameter räknades under en mikroskopisk fält.
Cell invasionsanalys
invasion bestämdes med en invasion kammaranalys. Celler (2 x 10 4) såddes på den övre kammaren i en 24-brunnars matrigel belagda mikroporfilter membranfilter, med 8 ^ m porer och bottenkammaren fylldes med 0,5 ml DMEM med 10% fetalt bovint serum som en chemoattractant. Efter inkubation under 24 timmar, var icke-invaderande celler (övre kammaren) försiktigt bort med en bomullspinne och invaderande celler (nedre kammaren) fixerades med användning av metanol och färgades med trypanblått. Den invasiva förmågan bestämdes genom antalet penetrerande celler under ett mikroskop med 200 gångers förstoring för 10 slumpmässiga fält i varje brunn migration assay Chamber
förfarande för in vitro migration assay.
Ades med användning av en icke-matrigel-belagda 24-brunnars Boyden-kammare (8 ^ m, Millipore). Celler (2 x 10 4) såddes på skären suspenderade i 0,2 ml serumfritt DMEM-medium. Icke-migrerande celler avlägsnades från den övre kammaren av filtret efter inkubation i 24 timmar. Migrerade celler färgades och kvantifieras och baseras på förfarandet som beskrivits tidigare. Tredubbla analyser utfördes för varje grupp av celler i invasion och migrationsanalyser, och resultaten är uttryckta som medelvärde ± SD.
Gelatin zymografi
MMP-2 och MMP-9-aktivitet bestämdes genom gelatin zymografi såsom beskrivits tidigare [ ,,,0],26]. I korthet, efter centrifugering supernatanten separerades och proteinkoncentrationen bestämdes; lika stora mängder protein, som lagts till av provbuffert (Tris-HCl 1 M, pH 6,8, Natriumdodecylsulfat (SDS) 2%, glycerol 10%) applicerades på 7,5% SDS-polyakrylamid-gel innehållande 1 mg /ml gelatin. Efter elektrofores SDS avlägsnas från gelén genom tvättning två gånger med 2,5% TritonX-100 under 1 timme. Efter en kort sköljning gelén inkuberades vid 37 ° C under 18 h i buffert, pH 7,6, innehållande 100 mM Tris-HCl, 10 mM CaCb 2, 20 mM NaCl. Gelén färgades With1% Coomassie Brilliant Blue R250 för 2 h och behandlades sedan med avfärgningslösning (40% metanol, 10% ättiksyra, 50% destillerat vatten). Proteolytisk aktivitet detekterades som tydliga band mot bakgrund fläck av osmält substrat i gelén.
Djurstudie av peritoneal implantering
Detta experiment genomfördes i enlighet med riktlinjerna som utfärdats av staten Food and Drug Administration (SFDA i Kina ). Djuren inhystes och vårdas i enlighet med de riktlinjer som fastställts av National Science Council Republiken Kina.
BALB /c nakna möss, 35-40 dagar gammal och väger 20-22 g, tillhandahölls av Shanghai SLAC Laboratory Animal Limited Company. Mössen hölls under sterila förhållanden och matas en steriliserad mus diet och vatten. Djuren bedövades via inandning av isoflurance. PSC 1, PSC2, PSNC och SGC7901-celler (1 x 10 7-celler) suspenderades i 0,5 ml DMEM och inokulerades in i bukhålan hos testmöss. Mössen avlivades sex veckor senare, och eventuella spridas knölar som finns på krös och membranet utvärderades.
Statistisk analys
Alla värden i texten och siffrorna presenteras som medelvärde ± SD. Generellt överlevnad bestämdes genom att använda Kaplan-Meier estimator, en händelse definieras som död för cancer korrelerade orsak. Log-rank test användes för att identifiera skillnader mellan överlevnadskurvor mellan olika patientgrupper. I univariat analys, 2-tailed χ 2 test för kategoriska variabler och 2-tailed t-test för kontinuerliga variabler användes för statistiska jämförelser. Värden på p Hotel < 0,05 togs för att visa en signifikant skillnad mellan medel.
Resultat
CTGF är överuttryckt i magcancer och korrelerade med kliniskt patologiska egenskaper hos magcancer patienter
Vi bestämde CTGF uttryck i magcancer vävnader och matchas distala normala vävnader . Figur 1A illustreras CTGF uttryck i fem slumpmässigt utvalda patienter. Förhöjda nivåer av CTGF-proteinet återfanns i humana gastric cancervävnader jämfört med de parade normala vävnader från patienterna. Detta bekräftades också av immunohistokemisk färgning (Figur 1B). I syfte att ytterligare undersöka sambandet mellan uttryck av CTGF och kliniskt patologiska egenskaper, var 110 prover användes för undersökning med immunhistokemisk färgning. Statistisk analys visade positiv CTGF uttryck var signifikant associerad med histologisk grad, lymfkörtel metastas och peritoneal spridning jämfört med patienter med negativ CTGF uttryck (tabell 2). Positiv CTGF uttryck oftare upptäcks i fall av lymfkörtlar metastaser (P = 0,012). Nivåer CTGF uttryck ökade kraftigt i odifferentierade gastric cancer jämfört med differentierade gastric cancer (P = 0,039). Och uttrycket av CTGF-proteinet var signifikant korrelerad med utvecklingen av peritoneal spridning av magcancer (P = 0,011). Beräkning av överlevnadstiden för de 110 berörda patienterna från Kaplan-Meier-metoden visade att de patienter som presenterade CTGF-positiva tumörer visade en kortare överlevnad jämfört med patienter som drabbats av CTGF-negativa tumörer (Figur 1C, P < 0,001 ). Figur 1 Uttryck av CTGF i magsäckscancer med sämre prognos. A. Western blot-analys påvisade CTGF uttryck i magcancer vävnader och matchade distala normala vävnader från slumpvis utvalda patienter fem magcancer. B. Immunohistokemi resultat av CTGF uttryck i parade ventrikelcancer vävnadsprover. C. Kaplen-Meir överlevnadskurvor för 110 patienter med magcancer, grupperade enligt CTGF uttryck.
Tabell 2 associering mellan CTGF uttryck och clinicopathologic egenskaperna hos patienter med magcancer (n = 110) katalog vid CTGF uttryck
vid vid negativ
Positiv
P-värde

Kön
Man
33
34
0,779
Kvinna
20
23
Ålder (år) katalog ≤ 65
35
40
0,642 Hotel > 65
18
17
Tumörstorlek (cm) Hotel < 5
26
25
0,585
≥ 5
27
32
tumörlokalisation
Lower
42
37
0,413
USA
5
8
Övre
3 6
hela
3 6
Histologisk betygs
differentierade
26
17
0,039 *
Odifferentierade
27
40
Lauren grade
Intestinal
28
21
0,108
Diffusa
25
36
Körtelcelscancern metastaser
Negativ
23
12
0,012 *
Positiv
30
45
TNM stadium
jag
11
8
0.080
II
15
9
III
20
22
IV
7
18
levermetastaser
negativ
50
55
0,588
Positiv
3 2 Review Peritoneal spridning
negativ
50 44
0,011 *
positiv
3
13
* P < 0,05; CTGF, bindvävs tillväxtfaktor.
Expression av CTGF i humana gastriska cancercellinjer och siRNA-medierad tystnad
Först undersökte vi CTGF uttryck i sex gastric cancercellinjer (MKN-45, MKN-1, AGS, SGC7901, BGC823 och MGC803) med Western blöt. CTGF detekterades i alla cellinjer som utvärderades, och med SGC7901 celler som uttrycker den högsta nivån (Figur 2A). Därför var SGC7901 celler valts som modell för de efterföljande funktionsstudier. Eftersom biologiskt aktivt CTGF är både utsöndras och uttrycks i cytoplasman [8, 27], mätte vi också nivån på utsöndrade CTGF i det konditionerade mediet av dessa gastriska cancercellinjer genom ELISA, som sammanföll med den nivå av CTGF i cytoplasman av varje cellinje (Figur 2B). Figur 2 Expression av CTGF i magcancer cellinjer och knockdown av CTGF av siRNA. A. Western blöt som visar uttrycket av CTGF i 6 gastric cancercellinjer. GAPDH fungerade som proteinladdningskontroll. B. CTGF i konditionerat medium av 6 gastric cancercellinjer och stabila transfekterade celler analyserades med ELISA. Resultat uttrycks som pg /ml /1 x 106cells (medel ± SD, n = 4). C. Western blot-analys av CTGF-proteinexpression i SGC7901, PSNC och CTGF knockdown stabila cellinjer (PSC 1 och PSC2). D. Immunofluorescensanalys av CTGF uttryck. E. RT-QPCR visar CTGF mRNA-nivåer i SGC7901, PSNC och CTGF knockdown stabila cellinjer (PSC 1 och PSC2). Data uttrycks som ett faldig förändring i förhållande till kontroll (kontroll är SGC7901). Värdena är angivna som medelvärden ± standardavvikelse för tre experiment. * P < 0,05 jämfört med kontroll.
För att studera funktionen av CTGF i SGC7901 celler, CTGF knockdown stabila cellinjer användes för att analysera ljuddämpningseffekten. Som visas i figur 2B, var nivån av utsöndrat CTGF i det konditionerade mediet minskade kraftigt under de siRNA-stabila transfekterade celler jämfört med kontroll. Western blöt och immunofluorescens-färgning visade att uttryck av CTGF-proteinet i cytoplasman minskade markant under de CTGF knockdown stabila cellinjer (Figur 2C, D). Vidare uttryck av CTGF-mRNA också minskat betydligt i CTGF knockdown stabila cellinjer (Figur 2E).
Knockdown av CTGF uttryck hämmar tillväxten av gastric cancerceller
kolonibildningsanalys användes för att utvärdera tillväxt av cellerna i vilka CTGF tystades. Såsom visas i fig 3A, CTGF knockdown stabila celler (PSC 1 och PSC2) bildade signifikant färre kolonier på mjuk agar jämfört med SGC7901 och PSNC celler (83 ± 10, 90 ± 15 versus 30 ± 7 och 20 ± 5, respektive). För att ytterligare testa den negativa effekten av CTGF knockdown på magcancer celltillväxt, var MTT-analys utförs och tillväxtkurvor genererades (figur 3B). Såsom visas av kurvorna, både PSC 1 och PSC2 celler prolifererade långsammare än PSNC celler och SGC7901 celler under den första 96 h efter det att cellerna ströks ut. Den dramatiska minskningen av kolonibildning och tillväxt av CTGF tystas celler föreslog CTGF dämpning kan reglera magcancer celltillväxt negativt. RT-QPCR visade att mRNA-nivåer av cellcykelrelaterade proteinet cyklin D1 var nedregleras i de två CTGF knockdown stabila cellinjer jämfört med PSNC och SGC7901 (figur 3C). I överensstämmelse med detta resultat, observerade vi en markant minskning av cyklin D1 proteinuttryck i CTGF knockdown celler PSC 1 och PSC2 (Figur 3D). Interestingly, behandling med konditionerat medium av SGC7901 som utsöndrade en stor mängd av CTGF kunde rädda cyklin D1 nedreglering och återställa cellproliferation i CTGF knockdown stabila celler. Dessa data indikerade att CTGF dämpning kan reglera negativt gastric cancercellernas tillväxt och minska cyklin D1 uttryck. Figur 3 Knockdown av CTGF uttryck hämmar tillväxten av gastric cancerceller. A. kolonibildningsanalys. B. MTT proliferationsanalys. C. Knockdown av CTGF nedregleras mRNA-nivån av cyklin D1. D. Knockdown av CTGF nedregleras proteinnivån av cyklin D1. PSC 1 /PSC2 + CM från SGC7901: PSC 1 eller PSC2 celler inkuberades med konditionerat medium (CM) av SGC7901. Alla resultat var reproducerbara i tre oberoende experiment. * P < 0,05 jämfört med kontroll (kontroll är SGC7901).
Knockdown av CTGF uttryck inhiberar migration och invasion av gastric cancerceller
Cellmigration och invasion är kritiska processer i tumörmetastas. Vi undersökte cell migration av icke-Matrigel-belagda Boyden kammare och cellinvasion av Matrigel-belagda invasionen kammaranalyser, respektive. I migrationsanalyser (Figur 4A), var migrationen av PSC 1 och PSC2 celler minskat betydligt jämfört med kontroll (P < 0,05). Såsom visas i figur 4B, CTGF knockdown också markant reducerad cellinvasion egenskaper jämfört med kontroll. Cellinvasion hastigheter av PSC 1 och PSC2 celler minskade med 61,4% och 55,8%, respektive. RT-QPCR och Western blöt visade att MMP-2 och MMP-9 ned reglerades i de två stabila kloner jämfört med kontrollceller (Figur 4C, D). I motsats härtill hade MMP-3 inte signifikant ändra både i mRNA och proteinnivåer. Dessutom visade zymografi analys verksamhet både MMP-2 och MMP-9 i siRNA-stabila transfekterade celler var betydligt lägre än i kontrollcellerna (Figur 4E). Interestingly, behandling med konditionerat medium av SGC7901 som utsöndrade en stor mängd av CTGF inducerade återuttryck av MMP-2 och MMP-9 och återställde migration och invasion av CTGF knockdown stabila celler. Dessa resultat tyder på att knockdown av CTGF uttryck minskade migration och invasion av gastric cancerceller och minskade uttrycket av MMP-2 och MMP-9. Figur 4 Knockdown av CTGF uttryck inhiberar migration och invasion av gastric cancerceller. A. Cellmigration analys. B. Cellinvasionsanalys. Migration och invasion celler fixerades och färgades, och representativa fält fotograferades. För kvantifiering, räknades cellerna i 10 slumpmässiga fält under ett ljusmikroskop (x 200). Tredubbla analyser utfördes för varje grupp av celler i invasion och migrationsanalyser, och resultaten är uttryckta som medelvärden ± SD. C. RT-QPCR gjordes för analys av mRNA-uttryck av MMP-2, MMP-3, och MMP-9 i CTGF knockdown stabila cellinjer och kontrollceller. Staplarna representerar medelvärdet ± standardavvikelse för tre experiment. D. Protein nivåer av MMP-2, MMP-3, och MMP-9 detekterades med Western blöt. GAPDH fungerade som proteinladdningskontroll. E. Gelatin zymografi analys för verksamheten i MMP-2 och MMP-9. PSC 1 /PSC2 + CM från SGC7901: PSC 1 eller PSC2 celler inkuberades med konditionerat medium (CM) av SGC7901 * P. ≪ 0,05 jämfört med kontroll (kontroll är SGC7901).
Nedreglering av CTGF inhiberar peritoneal spridning av magcancer in vivo
För att utforska effekterna av CTGF på den peritoneala spridning av gastriska cancerceller in vivo, inokulerades vi olika celler in i nakna möss. SGC7901 celler, styra stabil cellinje (PSNC) och CTGF knockdown stabila celler (PSC 1 och PSC2) injicerades in i fyra separata grupper av nakna möss. Som följd av en sådan behandling, den mätbara undertryckande av peritoneal spridning i möss injicerade med CTGF knockdown stabila celler jämfört med dem som injicerats med SGC7901 celler eller PSNC celler noterades (figur 5A). Kvantitativt var 117 ± 20 sprids knölar noteras för test möss ympade med SGC7901 celler och 137 ± 26 sprids knölar noterades för möss ympade med PSNC celler. Däremot signifikanta färre spridas noduler kunde observeras för möss som injicerats med CTGF knockdown stabila celler (Figur 5B). Figur 5 Knockdown av CTGF hämmar magcancer SGC7901 xenograft peritoneal spridning. SGC7901, PSNC och CTGF knockdown stabila cellinjer (PSC 1 och PSC2) injicerades intraperitonealt såsom beskrivits under "Material och metoder". 6 veckor senare avlivades mössen, fotograferade, dissekeras och eventuella sprids knölar som finns på krös och membranet räknades. A. fotografi av nakna möss med peritoneal spridning från varje grupp. B. sprids knölar utvärderades. Varje stapel representerar medelvärdet ± SD (n = 5 för varje grupp). * P < 0,05 som Diskussion
mest omfattande litteratur hittills om CTGF jämfört med kontroll (kontroll är SGC7901).
Definierar sin roll i sårläkning och fibrotisk sjukdom. Nyligen har flera studier implicerade CTGF i tumörutveckling och tumörcellöverlevnad [28-30]. Ändå är den exakta roll CTGF i tumörprogression inte bestämd, och funktionen av CTGF i tumörcellbiologin av magcancer har inte undersökts grundligt. Att ta itu med dessa frågor, utvärderade vi CTGF uttryck när det gäller eventuella direkta samband med celltillväxt och invasion av gastric cancerceller. Dessutom undersökte vi ytterligare effekterna av CTGF på peritoneal spridning av gastric cancerceller in vivo.
I denna studie visade våra resultat att CTGF starkt uttrycktes i magcancer vävnader jämfört med matchade normala mag vävnader. Uttrycket av CTGF i odifferentierad magsäckscancer var betydligt högre än i differentierade magsäckscancer. CTGF uttryck i tumörvävnad i samband med lymfkörtelmetastaser och peritoneal spridning. Dessutom patienter med positivt CTGF uttryck hade väsentligt lägre sammanlagd postoperativ 5 års överlevnad (22,9%) än de med negativ CTGF uttryck (48,1%, Figur 1C). Dessa resultat tyder på att CTGF kan vara inblandade i progression och metastasering av magcancer. Dessutom kan CTGF vara en användbar prognostisk markör.
Flera nya studier har visat att CTGF reglerar celltillväxt i esofagus cancerceller och pankreascancerceller [20, 30]. Men lite är känt om effekten av CTGF uttryck på celltillväxt av gastric cancerceller. Våra resultat visade att CTGF Trycket ledde till inhibition av celltillväxt och klonogena tillväxten.

• Högre antal av Helicobacter pylori CagA Epiya C fosforyleringsställen ökar risken för magcancer, men inte duodenalsår
• DNA-kopia antal profiler för magcancer prekursor skador